生物分离技术综合实验省公共课一等奖全国赛课获奖课件.pptx

生物分离技术综合试验生物分离技术综合试验植物色素提取、分离及定量与初步判定植物色素提取、分离及定量与初步判定试验一、试验一、植物色素制备植物色素制备一、试验目标一、试验目标:了解有机溶剂提取目标物质（植物色素）过程与注意事了解有机溶剂提取目标物质（植物色素）过程与注意事项。并了解目标物质提取过程中主要影响因子及其相互项。并了解目标物质提取过程中主要影响因子及其相互关系。关系。二二 试验原理：试验原理：用有机溶剂法从原料中提取黄酮类成份用有机溶剂法从原料中提取黄酮类成份,利用黄酮类物质利用黄酮类物质在热乙醇中溶解度较高在热乙醇中溶解度较高,将其提取出。将其提取出。第1页试验一、试验一、植物色素制备植物色素制备三、三、仪器仪器高速干粉粉碎机、恒温水浴锅、烧杯试管若干、中高速干粉粉碎机、恒温水浴锅、烧杯试管若干、中低速离心机、过滤装置低速离心机、过滤装置（漏斗和滤纸），（漏斗和滤纸），250ml磨磨口椎形瓶口椎形瓶6个个/每组；每组；10ml容量瓶容量瓶4个个/组。组。四、试剂四、试剂配配40%（80ml/组）、组）、70%（450 ml/组）乙醇，组）乙醇，10硝酸铝溶液硝酸铝溶液50ml/组，组，5亚硝酸钠亚硝酸钠50 ml/组组,质质量分数量分数4.3氢氧化钠氢氧化钠200 ml/组。组。第2页试验一、试验一、植物色素制备植物色素制备五、操作五、操作1、不一样、不一样浸提剂浓度浸提剂浓度对黄酮提取率影响对黄酮提取率影响1.1取干粉原料取干粉原料15克，分成克，分成6组（组（2.5克每组），用克每组），用8倍体积（指倍体积（指料液比料液比v/m为为8：1）即）即20ml40%、70%，95%乙醇浸提（温度乙醇浸提（温度70，时间，时间1.5h），浸提时每隔），浸提时每隔15 min用手用手轻摇轻摇2min。浸提所。浸提所得粗液进行离心（得粗液进行离心（4500r/min20min），得浸提上清液。），得浸提上清液。1.2 精密吸收上清液精密吸收上清液1.0 mL，分别置于，分别置于10 mL容量瓶中，加质容量瓶中，加质量分数量分数5亚硝酸钠亚硝酸钠0.4 mL，放置，放置6 min后，加质量分数后，加质量分数10硝硝酸铝酸铝0.4 mL，放置，放置6 min，再加质量分数，再加质量分数4.3氢氧化钠氢氧化钠4 mL，加蒸馏水至刻度，摇匀，放置加蒸馏水至刻度，摇匀，放置15 min，在，在510nm波长下测得其波长下测得其吸光度值，得出最优浸提剂浓度。吸光度值，得出最优浸提剂浓度。（按三个水平，每个水平做两组操作，即每个单原因条件得六（按三个水平，每个水平做两组操作，即每个单原因条件得六个数据。）个数据。）第3页试验一、试验一、植物色素制备植物色素制备2、不一样、不一样浸提时间浸提时间对黄酮提取率影响对黄酮提取率影响2.1 取干粉原料取干粉原料15克，分成克，分成6组（组（2.5克每组），用按克每组），用按8：1（指（指料液比料液比v/m）70%乙醇浸提（温度乙醇浸提（温度70），浸提时间分别为），浸提时间分别为90min、120min，150min，浸提时每隔，浸提时每隔15分钟用手分钟用手轻摇轻摇2min。浸提所得粗液进行离心（浸提所得粗液进行离心（4500r/min20min），得浸提上清液。），得浸提上清液。2.2 精密吸收上清液精密吸收上清液1.0 mL，分别置于，分别置于10 mL容量瓶中，加质容量瓶中，加质量分数量分数5亚硝酸钠亚硝酸钠0.4 mL，放置，放置6 min后，加质量分数后，加质量分数10硝酸铝硝酸铝0.4 mL，放置，放置6 min，再加质量分数，再加质量分数4.3氢氧化钠氢氧化钠4 mL，加蒸馏水至刻度，摇匀，放置，加蒸馏水至刻度，摇匀，放置15 min，在，在510nm波长下波长下测得其吸光度值，得出最优浸提时间。测得其吸光度值，得出最优浸提时间。（按三个水平，每个水平做两组操作每个水平做两组操作，（按三个水平，每个水平做两组操作每个水平做两组操作，即每个单原因条件做六个数据。）即每个单原因条件做六个数据。）第4页试验一、试验一、植物色素制备植物色素制备3、不一样料液比对黄酮提取率影响3.1 取干粉原料15克，分成6组（2.5克每组），用按6：1，8：1，10：1（指料液比v/m，即ml/克）70%乙醇浸提（温度70，时间1.5h），浸提时每隔15分钟用手轻摇2min。浸提所得粗液进行离心（4500r/min20min），得浸提上清液。3.2 精密吸收上清液1.0 mL，分别置于10 mL容量瓶中，加质量分数5亚硝酸钠0.4 mL，放置6 min后，加质量分数10硝酸铝0.4 mL，放置6 min，再加质量分数4.3氢氧化钠4 mL，加蒸馏水至刻度，摇匀，放置15 min，在510nm波长下测得其吸光度值，按V*A值大小比较得出最优料液比。选做部分：若出现从6：18：110：1（V*A）持续平稳增加，则可以继续加大料液比（可认为12：1，14：1,）,直到找到拐点位置最佳料液比。第5页试验一、试验一、植物色素制备植物色素制备六、试验注意事项六、试验注意事项1 1、将本试验中全部乙醇提取浸提液集中起来（一定要记下、将本试验中全部乙醇提取浸提液集中起来（一定要记下这些浸提液所对应原料质量这些浸提液所对应原料质量M M），量取其），量取其总体积总体积V V，将提取，将提取液分出液分出50ml50ml，将这，将这50ml50ml和其余色素液分置于两个烧杯中，和其余色素液分置于两个烧杯中，然后将两个烧杯在然后将两个烧杯在44左右低温下并用保鲜膜封闭保留左右低温下并用保鲜膜封闭保留（按（按现在温度，放在台子上避光保留即可），现在温度，放在台子上避光保留即可），以供后面纯化试以供后面纯化试验使用。验使用。2 2、在色素提取过程中，每隔一段时间要进行轻摇，摇摆时、在色素提取过程中，每隔一段时间要进行轻摇，摇摆时幅度要小，以免使提取原料粘在壁上，造成原料损失。幅度要小，以免使提取原料粘在壁上，造成原料损失。3 3、在做不一样料液比对色素提取影响试验时，比较结果优、在做不一样料液比对色素提取影响试验时，比较结果优劣要用劣要用V*A,V*A,即：体积即：体积*吸光度值。吸光度值。第6页试验一、试验一、植物色素制备植物色素制备六、试验注意事项六、试验注意事项4 4、离心前一定要认真平衡好，两管质量平衡误差应在、离心前一定要认真平衡好，两管质量平衡误差应在0.10.1克以内。同时，在离心过程中，一定要有专员看护克以内。同时，在离心过程中，一定要有专员看护以免发生事故。以免发生事故。5 5、试验当中提取液一定要全部从磨口锥形瓶和离心管、试验当中提取液一定要全部从磨口锥形瓶和离心管中倒出，在将离心好色素倒出时，一定要小心，不要中倒出，在将离心好色素倒出时，一定要小心，不要将底部沉降物倒出来。将底部沉降物倒出来。6 6、色素提取过程中一定要在锥形瓶上加上塞子，若乙、色素提取过程中一定要在锥形瓶上加上塞子，若乙醇蒸发较快时醇蒸发较快时（如：（如：80%80%以上高浓度乙醇提取时），以上高浓度乙醇提取时），能能够考虑在磨口锥形瓶上加一蛇形管，但低浓度乙醇提够考虑在磨口锥形瓶上加一蛇形管，但低浓度乙醇提取时没有必要加蛇形管。取时没有必要加蛇形管。第7页试验一、试验一、植物色素制备植物色素制备7、上样液制备、上样液制备（该步骤亦能够在试验二中完成）（该步骤亦能够在试验二中完成）将试验一中所得将试验一中所得全部浸提液全部浸提液用烧杯放在用烧杯放在100水浴中水浴中浓缩浓缩到到20ml，将所得浓缩液置于，将所得浓缩液置于50ml（或更大）分液漏斗中，按（或更大）分液漏斗中，按等量体积加入石油醚后塞上塞子并充分摇匀，弃石油醚层，等量体积加入石油醚后塞上塞子并充分摇匀，弃石油醚层，得下层黄酮液，放在得下层黄酮液，放在90水浴中浓缩，浓缩至水浴中浓缩，浓缩至10ml（详细操（详细操作时，可先用大烧杯进行浓缩，待溶液约作时，可先用大烧杯进行浓缩，待溶液约50ml左右时，改用左右时，改用50ml小烧杯进行浓缩，这么便于进行定量），小烧杯进行浓缩，这么便于进行定量），备用。备用。第8页试验一、试验一、植物色素制备植物色素制备8、测量吸光度时，一定要设空白对照（即把除、测量吸光度时，一定要设空白对照（即把除1ml样样液以外其余液以外其余9ml亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠、蒸馏水亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠、蒸馏水+1ml乙醇乙醇）9、因为各提取液浓度较大，在测量吸光度前，一定要、因为各提取液浓度较大，在测量吸光度前，一定要将待测液取出将待测液取出1mL，稀释到，稀释到10mL后，再按前面后，再按前面A值测值测定方法进行测定。定方法进行测定。第9页试验一、试验一、植物色素制备植物色素制备附录附录1 1、试验前面准备（同学们不需要做）：、试验前面准备（同学们不需要做）：（1 1）、原料制备）、原料制备用高速干粉粉碎机将银杏叶粉碎，过用高速干粉粉碎机将银杏叶粉碎，过4040目以上，目以上，40-6040-60目，目，60-60-7070目，目，70-8070-80目，目，80-9080-90目，目，90-10090-100目，目，100100目以上，筛后备用。目以上，筛后备用。（2 2）、标准曲线绘制：）、标准曲线绘制：精密称取芦丁对照品精密称取芦丁对照品200 mg200 mg，用体积分数，用体积分数(下同下同)70)70乙醇溶解，乙醇溶解，定容至定容至100 mL100 mL容量瓶中摇匀。精密移取容量瓶中摇匀。精密移取10 mL10 mL芦丁乙醇液于芦丁乙醇液于25 25 mLmL容量瓶中，用蒸馏水定容，得到容量瓶中，用蒸馏水定容，得到0.8 mg0.8 mgmLmL标准溶液。精密标准溶液。精密吸收标准溶液吸收标准溶液0.00.0、0.20.2、0.40.4、0.60.6、0.80.8、1.0 mL1.0 mL，分别置于，分别置于10 mL10 mL容量瓶中，加质量分数容量瓶中，加质量分数5 5亚硝酸钠亚硝酸钠0.4 mL0.4 mL，放置，放置6 min6 min后，加质量分数后，加质量分数1010硝酸铝硝酸铝0.4 mL0.4 mL，放置，放置6 min6 min，再加质量分，再加质量分数数4.34.3氢氧化钠氢氧化钠4 mL4 mL，加蒸馏水至刻度，摇匀，放置，加蒸馏水至刻度，摇匀，放置15 min15 min，进行测量，在，进行测量，在510nm510nm处有最大吸收波长。以测定结果得芦丁处有最大吸收波长。以测定结果得芦丁浓度与吸光度标准曲线：浓度与吸光度标准曲线：Y=0.1035Ad-0.0016(YY=0.1035Ad-0.0016(Y：芦丁浓度，：芦丁浓度，mgmgmlml；A A：吸光值：吸光值)，R=0.9999R=0.9999。第10页试验二、植物色素分离纯化试验二、植物色素分离纯化一、目标一、目标学习掌握柱层析法分离纯化目标物质（植物色素）方法和学习掌握柱层析法分离纯化目标物质（植物色素）方法和操作。操作。二、原理二、原理柱层析是比较理想分离黄酮类色素方法柱层析是比较理想分离黄酮类色素方法,其原理是经过基其原理是经过基质分子与黄酮类化合物分子上质分子与黄酮类化合物分子上酚羟基形成氢键缔合物而产酚羟基形成氢键缔合物而产生作用生作用,其作用力强弱取决于黄酮类化合物分子上羟基数其作用力强弱取决于黄酮类化合物分子上羟基数目与位置目与位置以及以及洗脱剂与黄酮类化合物和基质之间形成氢键洗脱剂与黄酮类化合物和基质之间形成氢键缔合能力大小缔合能力大小。惯用不一样百分比水和醇混合溶剂作为洗。惯用不一样百分比水和醇混合溶剂作为洗脱剂，能成功分离各种类型黄酮。脱剂，能成功分离各种类型黄酮。第11页试验二、植物色素分离纯化试验二、植物色素分离纯化三、器材与试剂三、器材与试剂1、试验仪器试验仪器 层析柱、试管、烧杯、量筒、烘箱。层析柱、试管、烧杯、量筒、烘箱。2、试验试剂试验试剂 石油醚、石油醚、40%乙醇乙醇200ml/组、组、70%乙醇乙醇300ml/组、组、95%乙醇乙醇200ml/组、基质。组、基质。3、试验材料、试验材料 银杏叶提取液银杏叶提取液第12页试验二、植物色素分离纯化试验二、植物色素分离纯化四、操作四、操作1、上样液制备、上样液制备（该步骤亦能够在试验一中完成）（该步骤亦能够在试验一中完成）将试验一中所得全部浸提液将试验一中所得全部浸提液用烧杯放在用烧杯放在100水浴中水浴中浓缩到浓缩到20ml，将所得浓缩液置于，将所得浓缩液置于50ml（或更大）分液漏斗中，按（或更大）分液漏斗中，按等量体积加入石油醚后塞上塞子并充分摇匀，弃石油醚层，等量体积加入石油醚后塞上塞子并充分摇匀，弃石油醚层，得下层黄酮液，放在得下层黄酮液，放在90水浴中浓缩，浓缩至水浴中浓缩，浓缩至10ml（详细（详细操作时，可先用大烧杯进行浓缩，待溶液约操作时，可先用大烧杯进行浓缩，待溶液约50ml左右时，左右时，改用改用50ml小烧杯进行浓缩，这么便于进行定量），小烧杯进行浓缩，这么便于进行定量），备用。备用。2、基质预处理：、基质预处理：称取所需大孔吸附树脂称取所需大孔吸附树脂(湿重湿重)，以，以95乙醇浸泡乙醇浸泡24 h，充，充分溶胀后用乙醇湿法装柱，分溶胀后用乙醇湿法装柱，第13页试验二、植物色素分离纯化试验二、植物色素分离纯化3 装柱：装柱：将酒精浸泡好基质约将酒精浸泡好基质约40ml（指混匀状态下取样），经过漏斗迟缓倒入柱中（指混匀状态下取样），经过漏斗迟缓倒入柱中（柱中已经装好（柱中已经装好10ml95%乙醇），乙醇），边加边用木夹子轻敲柱子，同时用竹签边加边用木夹子轻敲柱子，同时用竹签轻轻压实。流速应控制在轻轻压实。流速应控制在20滴滴/min，待装至，待装至20cm柱高，再加与柱壁完全吻柱高，再加与柱壁完全吻合滤纸片，接着加入合滤纸片，接着加入1.0 cm高海沙（或石英砂高海沙（或石英砂）。（注意，在整个装柱过）。（注意，在整个装柱过程中，树脂应浸泡在溶液中，不然会出现断痕，气泡等。程中，树脂应浸泡在溶液中，不然会出现断痕，气泡等。若柱子无砂芯，若柱子无砂芯，要在装柱前加一小团（大拇指指甲大小）棉花封住柱子，以防基质漏出。要在装柱前加一小团（大拇指指甲大小）棉花封住柱子，以防基质漏出。）4、平衡：、平衡：用用95%乙醇洗柱，不时检验流出乙醇液，待流出乙醇液与去离子水以乙醇洗柱，不时检验流出乙醇液，待流出乙醇液与去离子水以1：3体积比混合，振摇不显白色浑浊时结束洗柱（已洗好，无须做），体积比混合，振摇不显白色浑浊时结束洗柱（已洗好，无须做），用纯化用纯化水将柱中树脂洗至无醇味后备用水将柱中树脂洗至无醇味后备用。（注意，全部醇洗液需回收到大烧杯里，。（注意，全部醇洗液需回收到大烧杯里，水洗液无须回收）水洗液无须回收）5、上样与吸附：、上样与吸附：取浓缩液取浓缩液10ml上柱，吸附上柱，吸附20min（流速（流速20滴滴/min），等样品液完全流入基），等样品液完全流入基质中后，用质中后，用3倍柱体积（约倍柱体积（约150ml）去离子水洗脱。）去离子水洗脱。第14页试验二、植物色素分离纯化试验二、植物色素分离纯化6、洗脱（解吸附）：、洗脱（解吸附）：6.1 依次用依次用40%200ml（流速约流速约30滴滴/min）、）、70%300ml（流（流速约速约20滴滴/min）、）、95%200ml（流速约（流速约40滴滴/min）乙醇分别）乙醇分别进行洗脱，将试管放在试管架上按序接收洗脱液，每管搜集进行洗脱，将试管放在试管架上按序接收洗脱液，每管搜集 8ml左右洗脱液左右洗脱液6.2 从第一管起，每接收从第一管起，每接收3管，则精密吸收第管，则精密吸收第1、4、7、10等管中洗脱液等管中洗脱液1.0 mL，置于，置于10 mL容量瓶中，加质量分数容量瓶中，加质量分数5亚硝酸钠亚硝酸钠0.4 mL，放置，放置6 min后，加质量分数后，加质量分数10硝酸铝硝酸铝0.4 mL，放置，放置6 min，再加质量分数，再加质量分数4.3氢氧化钠氢氧化钠4 mL，加蒸，加蒸馏水至刻度，摇匀，放置馏水至刻度，摇匀，放置15 min，在，在510nm波长下测得其吸波长下测得其吸光度值；光度值；第15页试验二、植物色素分离纯化试验二、植物色素分离纯化6、洗脱（解吸附）：、洗脱（解吸附）：6.3 确定黄酮所在主要流分后，将吸光度值在确定黄酮所在主要流分后，将吸光度值在0.1以上（含以上（含0.1）全部管中洗脱液集中起来，测出其）全部管中洗脱液集中起来，测出其总体积总体积V纯化纯化（接着，可（接着，可直接测定纯化液直接测定纯化液A值）值），预留预留50ml纯化液，纯化液，用保鲜膜封闭后放在用保鲜膜封闭后放在4中低温保留，并中低温保留，并将其余纯化液将其余纯化液置于置于90水浴中浓缩至水浴中浓缩至10ml，用保鲜膜封闭后放在，用保鲜膜封闭后放在4中低温避光保留，备用。中低温避光保留，备用。第16页试验二、植物色素分离纯化试验二、植物色素分离纯化五、试验注意事项五、试验注意事项1 1、装柱前在柱子底部加一小棉花球。、装柱前在柱子底部加一小棉花球。2 2、装柱时，边加树脂边用木质棒（或橡胶棒）轻、装柱时，边加树脂边用木质棒（或橡胶棒）轻敲柱子，使基质缓缓下沉敲柱子，使基质缓缓下沉 。3 3、装柱要求连续、均匀、无纹格、无气泡，表面、装柱要求连续、均匀、无纹格、无气泡，表面平整，整个层析过程中液面一定不得低于树脂表面。平整，整个层析过程中液面一定不得低于树脂表面。4 4、要注意及时开启和关闭旋纽，即在上一个液体、要注意及时开启和关闭旋纽，即在上一个液体刚好没入基质时，才开始加入下一个液体，刚好没入基质时，才开始加入下一个液体，且一定且一定要用玻棒引流要用玻棒引流。第17页试验二、植物色素分离纯化试验二、植物色素分离纯化五、试验注意事项五、试验注意事项5 5、要注意控制流速，不宜过快。、要注意控制流速，不宜过快。6 6、在加入好样品后（在洗壁前）就要接收洗、在加入好样品后（在洗壁前）就要接收洗脱液。脱液。7 7、柱子预处理时流出液用三角瓶或烧杯接收，、柱子预处理时流出液用三角瓶或烧杯接收，而上样后色素洗脱液则用试管接收。而上样后色素洗脱液则用试管接收。8 8、所预留纯化液、所预留纯化液50ml50ml和和10ml10ml，必须是在全部，必须是在全部洗脱下来洗脱下来A A值大于值大于0.10.1纯化液混匀后才能取液。纯化液混匀后才能取液。第18页试验三、植物色素定量与初步判定试验三、植物色素定量与初步判定一、目标一、目标 用化学方法判定上面所纯化提取液中有黄酮存在，同用化学方法判定上面所纯化提取液中有黄酮存在，同时测定黄酮含量和最终得率。时测定黄酮含量和最终得率。二、原理二、原理黄酮化合物分子结构中含有黄酮化合物分子结构中含有C5、C6位酚羟基或邻二酚位酚羟基或邻二酚羟基可与羟基可与金属盐试剂铝盐金属盐试剂铝盐生成有色络合物，黄酮络合生成有色络合物，黄酮络合物在物在510nm处有较大吸收峰，可由分光光度法测出黄处有较大吸收峰，可由分光光度法测出黄酮含量。依据黄酮一些特征，利用黄酮与一些试剂发酮含量。依据黄酮一些特征，利用黄酮与一些试剂发生特殊发色反应来检测黄酮。生特殊发色反应来检测黄酮。第19页试验三、植物色素定量与初步判定试验三、植物色素定量与初步判定三、试验器材三、试验器材1、试验仪器：、试验仪器：分光光度计，烘箱，电子天平，分光光度计，烘箱，电子天平，10ml 容量容量瓶瓶1支支/组，组，100m容量瓶容量瓶1支支/组，移液管若干。组，移液管若干。2、试验试剂：、试验试剂：80%氢氧化钠（质量分数）溶液，氢氧化钠（质量分数）溶液，10%FeCl3，10%FeCl2溶液，溶液，2%NaBH4溶液，甲醇。溶液，甲醇。3、试验材料：、试验材料：试验二中所得洗脱液浓缩液（总体积为试验二中所得洗脱液浓缩液（总体积为10ml）。）。第20页试验三、植物色素定量与初步判定试验三、植物色素定量与初步判定四、试验步骤四、试验步骤（一）物质初步判定操作（样液是试验二中纯化液浓缩（一）物质初步判定操作（样液是试验二中纯化液浓缩而来而来10ml）：）：1、在所纯化提取液在所纯化提取液2ml中加入中加入10%氢氧化钠（氢氧化钠（质量分数）质量分数）溶液溶液2ml，若色素液马上由黄色变为深黄色；则认定黄酮，若色素液马上由黄色变为深黄色；则认定黄酮化合物存在。化合物存在。2、在所纯化提取液两份，各为在所纯化提取液两份，各为2ml，分别加入，分别加入10%FeCl3，Fe Cl2；若发觉两种离子都使色素溶液变为蓝绿色，；若发觉两种离子都使色素溶液变为蓝绿色，则可认定黄酮化合物存在。则可认定黄酮化合物存在。3、硼酸氢钠反应：取黄酮纯化液硼酸氢钠反应：取黄酮纯化液2ml，再加等量，再加等量2%NaBH4甲醇溶液甲醇溶液1min后加浓盐酸后加浓盐酸（买来即用，不需（买来即用，不需调配）调配）数滴，若有紫色或紫红色出现，则说明此黄酮纯数滴，若有紫色或紫红色出现，则说明此黄酮纯化液中有二氢黄酮存在。化液中有二氢黄酮存在。第21页试验三、植物色素定量与初步判定试验三、植物色素定量与初步判定（二）目标物质得率确实定：（二）目标物质得率确实定：1、标准曲线及方程和最正确吸收波长用试验一结果。标准曲线及方程和最正确吸收波长用试验一结果。2、从试验二所得预留在冰箱中从试验二所得预留在冰箱中10ml纯化液纯化液中精密吸收中精密吸收1ml，（注意，若储存液有沉降现象，则可进行（注意，若储存液有沉降现象，则可进行40 加热，待其澄加热，待其澄清后再进行光度测定，清后再进行光度测定，但若是连续试验，就无须在冰箱中保但若是连续试验，就无须在冰箱中保留而是在试验二中直接测定其留而是在试验二中直接测定其A A值）值），放置于放置于10 mL容量容量瓶中，冰箱中取出放置一定时间，使之到达室温后，按前瓶中，冰箱中取出放置一定时间，使之到达室温后，按前面方法，在面方法，在510nm波长下测得其吸光度值波长下测得其吸光度值A。此步骤亦可在试验二中直接测定。此步骤亦可在试验二中直接测定。第22页试验三、植物色素定量与初步判定试验三、植物色素定量与初步判定（二）目标物质得率确实定：（二）目标物质得率确实定：将将A样品代入标准曲线方程样品代入标准曲线方程Y=KA+b(Y：黄酮浓度，：黄酮浓度，gL；A：吸光值，：吸光值，用各组自己测得方程用各组自己测得方程)，能够得到待测样品黄酮浓度，能够得到待测样品黄酮浓度，C纯化纯化（单位为（单位为mg/ml）。）。C纯化纯化=Y*10*n（因为测定浓度过程中，待测液由（因为测定浓度过程中，待测液由1ml定容到定容到10ml，n为试为试验过程中待测液稀释倍数）验过程中待测液稀释倍数）黄酮得率黄酮得率%=测得黄酮含量（测得黄酮含量（mg）/原料总质量原料总质量100%=（C纯化纯化 V纯化）纯化）mg（M1000）mg100%M代表代表V所对应原料总质量。将书本公式中所对应原料总质量。将书本公式中“V提取液提取液/200”去掉去掉，因为试验二中因为试验二中10ml浓缩液对应是全部提取液。浓缩液对应是全部提取液。第23页试验三、植物色素定量与初步判定试验三、植物色素定量与初步判定（三）目标物质纯度测定：（三）目标物质纯度测定：取试验一中所得取试验一中所得提取液提取液50ml，放置在已经烘干，并已，放置在已经烘干，并已经称好质量为经称好质量为m1小烧杯中，放在真空干燥箱中干燥，小烧杯中，放在真空干燥箱中干燥，干燥到恒重后，称其重量干燥到恒重后，称其重量m2，得色素浸膏重量为（，得色素浸膏重量为（m2 m1），再依据上面第（二）中公式算出总黄酮含量），再依据上面第（二）中公式算出总黄酮含量m总总，则其纯度为：，则其纯度为：目标物质目标物质纯化前纯化前纯度纯度=C纯化纯化50 100%m2 m1第24页试验三、植物色素定量与初步判定试验三、植物色素定量与初步判定（三）目标物质纯度测定：（三）目标物质纯度测定：取试验二中所得取试验二中所得纯化液纯化液50ml，放置在已经烘干，并已经，放置在已经烘干，并已经称好质量为称好质量为m3小烧杯中，放在真空干燥箱中干燥，干燥小烧杯中，放在真空干燥箱中干燥，干燥到恒重后，称其重量到恒重后，称其重量m4，得色素浸膏重量为（，得色素浸膏重量为（m4 m3），再依据上面第（二）中公式算出总黄酮含量），再依据上面第（二）中公式算出总黄酮含量m总总，则其纯度为：则其纯度为：目标物质目标物质纯化后纯化后纯度纯度=C纯化纯化50 100%m4 m3 第25页试验三、植物色素定量与初步判定试验三、植物色素定量与初步判定（三）目标物质纯度测定（三）目标物质纯度测定纯化倍数计算：纯化倍数计算：m =目标物质目标物质纯化后纯化后纯度纯度 目标物质目标物质纯化前纯化前纯度纯度第26页试验三、植物色素定量与初步判定试验三、植物色素定量与初步判定五、试验注意事项五、试验注意事项1 1、在进行、在进行目标物质得率确实定目标物质得率确实定试验中，一定要注意试试验中，一定要注意试验数据测量准确性。验数据测量准确性。2、在进行在进行目标物质纯度测定目标物质纯度测定试验中，要注意色素容器试验中，要注意色素容器（小烧杯）一定要先在高温烘干后称其重量，然后把（小烧杯）一定要先在高温烘干后称其重量，然后把色素倒入其内，在高温下进行烘干。色素倒入其内，在高温下进行烘干。第27页试验三、植物色素定量与初步判定试验三、植物色素定量与初步判定五、试验注意事项五、试验注意事项3 3、在测定洗脱液、在测定洗脱液A A值时，若洗脱液经过稀释到值时，若洗脱液经过稀释到n n倍后再倍后再测定时，则须在原来测定时，则须在原来C C纯化纯化数值基础上在乘以稀释倍数数值基础上在乘以稀释倍数n n，在去计算对应得率和纯度。，在去计算对应得率和纯度。在此情况下，测定液相当于稀释了在此情况下，测定液相当于稀释了两次两次，一次是样，一次是样液本身稀释，另一次是样液测定时加入显色剂使之稀液本身稀释，另一次是样液测定时加入显色剂使之稀释到释到1010倍。计算时倍数是两次稀释倍数乘积。倍。计算时倍数是两次稀释倍数乘积。4 4、天天水浴锅、烘箱、水龙头、门窗等在晚上离开试、天天水浴锅、烘箱、水龙头、门窗等在晚上离开试验室时必须关闭。验室时必须关闭。第28页后记后记1 1、同学们在试验结束后，一定要将全部用过、同学们在试验结束后，一定要将全部用过设备洗涤洁净后，摆放整齐，并归放到对应试设备洗涤洁净后，摆放整齐，并归放到对应试验室内。并把所用到全部试验室清扫洁净。验室内。并把所用到全部试验室清扫洁净。2 2、把领用东西由组长负责偿还给老师。、把领用东西由组长负责偿还给老师。3 3、试验汇报在第、试验汇报在第1 16 6周周四前交上来。周周四前交上来。第29页