分子生物学DNA的重组与转座省公共课一等奖全国赛课获奖课件.pptx

第七章第七章DNA重组与转座重组与转座DNArecombinationandtransposition第1页DNA重组重组概念：概念：DNA分子内或分子间发生遗传信息分子内或分子间发生遗传信息重新重合称为遗传重组或基因重排重新重合称为遗传重组或基因重排。DNA重组意义重组意义：对生物进化起着关键作用。能快速增加群体遗对生物进化起着关键作用。能快速增加群体遗传多样性传多样性(diversity)，使有利突变与不利突，使有利突变与不利突变分开，经过优化组合积累有意义遗传信息；变分开，经过优化组合积累有意义遗传信息；提供修复机制；调整基因表示等。提供修复机制；调整基因表示等。第2页DNA重组重组n从从DNA序列和所需蛋白质因子要求把重组分为序列和所需蛋白质因子要求把重组分为4类：类：同源重组同源重组(homologousrecombination)位点特异位点特异(专一专一)性重组性重组(site-specificrecombination)转座重组转座重组(transpositionrecombination)异常重组异常重组(illegitimaterecombination)第3页7.1同源重组同源重组同源重组同源重组(homologousrecombination)是指两条同源区是指两条同源区DNA分子片段间交换过程。分子片段间交换过程。第4页1.同源重组分子模同源重组分子模型型-Holliday重重组模型组模型片段重组体片段重组体拼接重组体拼接重组体第5页第6页7.1.2异源双链与基因转换异源双链与基因转换第7页7.1.3.7.1.3.细菌基因转移与重组细菌基因转移与重组细菌基因转移四种机制细菌基因转移四种机制结合结合(conjugation)转化转化(transformation)转导转导(transduction)细胞融合细胞融合(cellfusion)第8页7.1.4同源重组酶学机制同源重组酶学机制细菌接合、转化以及转导重组都是同源重组，细菌接合、转化以及转导重组都是同源重组，而且这种重组是发生在一个完整环状双螺旋而且这种重组是发生在一个完整环状双螺旋DNA分子与一个双链或单链分子与一个双链或单链DNA分子片段之分子片段之间。且重组需要间。且重组需要RecA和和RecBCD蛋白质。蛋白质。Recombination第9页7.2位点特异性重组位点特异性重组site-specificrecombination第10页一、位点特异性重组（一、位点特异性重组（site-specific recombination site-specific recombination）1 1、概念：发生在专一序列而次序极少相同、概念：发生在专一序列而次序极少相同DNADNA分子间分子间 重组重组噬菌体基因组整合到细菌染色体基因组中属此种重组噬菌体基因组整合到细菌染色体基因组中属此种重组2 2、特征：、特征：在特定结合序列部位，有专一酶催化断裂重接在特定结合序列部位，有专一酶催化断裂重接-产生准确产生准确DNADNA重排重排都含有整合作用两个基本特征都含有整合作用两个基本特征a a、经典保守性重组经典保守性重组-交换是相互和保留原先交换是相互和保留原先DNADNAb b、发生在噬菌体和细菌发生在噬菌体和细菌DNADNA短同源序列专一性核苷酸上短同源序列专一性核苷酸上第11页7.2.1phageDNA整合与切除整合与切除1、实现机制：、实现机制：均是经过均是经过-细菌细菌DNA和和DNA上特定位点之间重组上特定位点之间重组2、特定位点、特定位点-附着位点（附着位点（attachmentsiteatt）E.coliattB 以以BOB表示，由表示，由23bpphageattP以以POP表示表示240bp关键序列关键序列“O”完全一致完全一致（同源部分）（同源部分）-位点特异性重组发生地方位点特异性重组发生地方B,B,P,P-臂臂第12页3、整合过程、整合过程整合后附着位点为整合后附着位点为attL（BOP）attR（POB）整合位点整合位点-attB、attP切除位点切除位点-attL、attR整合过程需要整合过程需要整合酶整合酶（integraseInt）（）（编码）编码）和寄主整合宿主因子和寄主整合宿主因子IHF（integrationhostfactor）共同作用共同作用第13页溶源性细菌溶源性细菌(lysogen)(lysogen)溶菌周期溶菌周期（lysislysis）原噬菌体原噬菌体第14页4 4、整合分子机制、整合分子机制 关键序列关键序列OO全长全长15bp15bp，富含，富含A-TA-T 发生在发生在OO内重组交换位点相距内重组交换位点相距 7bp 7bp 整合酶结合位点：整合酶结合位点：attP 240bpattP 240bp、attB 23bp(attB 23bp(二者作用不一样二者作用不一样)attPattP位点负超螺旋为重组所必须位点负超螺旋为重组所必须-加强了加强了IntInt和和IHFIHF亲和力亲和力-高剂高剂量蛋白维持单链重组所必需结构量蛋白维持单链重组所必需结构 IntInt结合结合 -关键序列反向位点（切割位置）关键序列反向位点（切割位置）-结合在结合在attatt臂上（臂与关键区靠近）臂上（臂与关键区靠近）第15页intIHFXis第16页 整合体及其作用整合体及其作用 整合体（整合体（intasomeintasome）-Int Int和和IHFIHF结合到结合到attPattP时复合物时复合物 整合体捕捉整合体捕捉attBattB，说明，说明-a a、attBattB和和attPattP最初识别靠最初识别靠IntInt 识别两序列能力识别两序列能力 b b、两序列同源性在链交换时为主要、两序列同源性在链交换时为主要原因原因第17页IntInt蛋白能切断蛋白能切断DNADNA，并使它重新连接，近而使，并使它重新连接，近而使hollidayholliday结构拆分结构拆分重组时重组时attPattP和和attBattB部位交叉断裂，互补单链末端进行交叉杂交部位交叉断裂，互补单链末端进行交叉杂交第18页鼠伤寒沙门氏菌鼠伤寒沙门氏菌H1鞭毛蛋白和鞭毛蛋白和H2鞭毛蛋鞭毛蛋白抗原表示互变，称为鞭毛相转变，这白抗原表示互变，称为鞭毛相转变，这种转变是由种转变是由H片段倒位决定，此倒位是片段倒位决定，此倒位是因为特异重组位点因为特异重组位点hix发生重组后引发。发生重组后引发。7.2.2 7.2.2 细菌特异位点重组细菌特异位点重组第19页沙门氏菌沙门氏菌H H片段倒位决定鞭毛相转变片段倒位决定鞭毛相转变 第20页7.3 7.3 转座作用转座作用7.3.1 7.3.1 转座子概念：转座子概念：转座子转座子（transposontransposon，Tn):Tn):是在基因组中可移动一是在基因组中可移动一段段DNADNA序列。基因组内无须借助于同源序列就能序列。基因组内无须借助于同源序列就能 改改变本身位置一端变本身位置一端DNADNA序列序列.转座：转座子转座：转座子由基因组一个位置转移到另一个位置过由基因组一个位置转移到另一个位置过程叫转座。转座过程有程叫转座。转座过程有5 5大特点：大特点：第21页第22页第23页C C基因基因-Ds-Ds基因基因-Ac-Ac基因：基因：Ac-Ds Ac-Ds 控制系统控制系统玉米易突变位点由来与行为玉米易突变位点由来与行为(1950)(1950)，染色体结构和基因，染色体结构和基因表示表示(1951)(1951)Barbara McClintock Barbara McClintock(芭芭拉芭芭拉麦麦克林托克林托克克)1902-1992 1902-1992 第24页 Barbara McClintock(1902-1992),a geneticist who integrated classical genetics with microscopic observations of the behavior of chromosomes,was regarded as a genius,nearly incomprehensible thinker.In 1946,she discovered mobile genetic elements,which she called controlling elements.Thirty-seven years later,she won a Noble Prize for this work,becoming the third woman to receive an unshared Nobel in science.第25页7.3.2转座子分类：转座子分类：1.插入序列插入序列（insertionsequence,IS):简称简称IS因子因子IS家族结构：家族结构：正向重复序列（正向重复序列（directrepeats,DR）反向重复序列（反向重复序列（invertedrepeats，IR）1kb左右编码区，仅编码和转座相关转座酶。左右编码区，仅编码和转座相关转座酶。对靶位点选择有三种形式：随机选择，热点选择和特异位点对靶位点选择有三种形式：随机选择，热点选择和特异位点选择。选择。第26页ATGCATACGT987654321123456789987654321123456789987654321123456789987654321123456789ATGCATACGTATGCATACGT倒置重复区倒置重复区靶序列顺式重复区靶序列顺式重复区转座子转座子转座子在靶位置插入前后结构转座子在靶位置插入前后结构第27页2.2.复合转座子复合转座子(Composite transposons)(Composite transposons)：含有一个中心序列和位于两侧臂（含有一个中心序列和位于两侧臂（armarm）；）；除了和本身转座相关基因外，中心序列含有抗除了和本身转座相关基因外，中心序列含有抗药性基因等遗传信息；药性基因等遗传信息；复合转座子两端臂由复合转座子两端臂由IS IS序列组成。序列组成。第28页复合型转座子复合型转座子 型：两末端有相同型：两末端有相同IS IS序列，或正向，或反向。序列，或正向，或反向。型：末端有反向重复序列。如型：末端有反向重复序列。如TnATnA家族家族第29页tnpAtnpRAmp RTn3 Tn3 结构示意图结构示意图IRIRres转录单位转录单位 tnp A：编码转座酶编码转座酶(1021aa)tnp R：编码蛋白质编码蛋白质(185aa)，2种功效：解离酶、阻遏蛋白种功效：解离酶、阻遏蛋白Tn ATn A家族家族:nTnATnA是复制型转座转座子，长约是复制型转座转座子，长约5kb5kb左右左右 。n两端含有末端反向重复序列（而不是两端含有末端反向重复序列（而不是IS IS），长约），长约38bp38bp左右，左右，任一个缺失都会阻止转座。任一个缺失都会阻止转座。n中部编码区编码三个基因：转座酶，解离酶和抗性基因，中部编码区编码三个基因：转座酶，解离酶和抗性基因，TnATnA家族都带有抗性标识家族都带有抗性标识 。n靶位点含有靶位点含有5bp5bp正向重复序列。正向重复序列。n解离位点（解离位点（resres）是）是TnATnA家族特有内部位点。家族特有内部位点。第30页7.3.3 7.3.3 转座过程发生机制转座过程发生机制n转座时发生插入作用普遍特征是受体分子中有一段很短转座时发生插入作用普遍特征是受体分子中有一段很短(3l2bp)、被称为靶序列、被称为靶序列DNA会被复制，使插入转座子会被复制，使插入转座子位于两个重复靶序列之间。位于两个重复靶序列之间。n对于一个特定转座子来说，它所复制靶序列长度是一样，对于一个特定转座子来说，它所复制靶序列长度是一样，如如IS1两翼总有两翼总有9个碱基正确靶序列，而个碱基正确靶序列，而Tn3两端总有两端总有5bp靶序列。靶序列。n靶序列复制起源于特定内切酶所造成黏性靶序列复制起源于特定内切酶所造成黏性DNA末端。末端。第31页第32页1复制型转座复制型转座(replicativetransposition)：Replicativetranspositiondescribesthemovementofatransposonbyamechanisminwhichfirstitisreplicated,andthenonecopyistransferredtoanewsite.Replicativetranspositioninvolvestwotypesofenzymaticactivity:n转座酶：转座酶：transposasen解离酶：解离酶：Resolvase第33页2非复制型转座非复制型转座(nonreplicativetransposition)Nonreplicativetranspositionallowsatransposontomoveasaphysicalentityfromadonortoarecipientsite.Thisleavesabreakatthedonorsite,whichislethalunlessitcanberepaired.第34页1)1)非复制转座：非复制转座：转座子插入到转座子插入到DNADNA上新位点，首先交织切开靶上新位点，首先交织切开靶DNADNA，再将转座子连接到靶再将转座子连接到靶DNADNA凸出单链上，最终填补空缺完成凸出单链上，最终填补空缺完成转座。转座。ThedirectrepeatsoftargetDNAflankingatransposonaregeneratedbytheintroductionofstaggeredcutswhoseprotrudingendsarelinkedtothetransposon.3 3、转座中普通过程：、转座中普通过程：第35页2)2)复制型转座复制型转座:在转座子和靶位点两端在转座子和靶位点两端分别交织切割产生切口分别交织切割产生切口;转座子和靶位点切口末转座子和靶位点切口末端交互连接端交互连接(a-f,g-d),(a-f,g-d),形形成一个交换结构成一个交换结构(cross cross structurestructure););以游离以游离33末端作为引末端作为引物进行复制，产生一个物进行复制，产生一个包含两个正向重复转座包含两个正向重复转座子拷贝复合物，称为共子拷贝复合物，称为共合体合体(cointegratecointegrate),),这一这一过程在转座酶作用下进过程在转座酶作用下进行行;第36页转座子两个拷贝在转座子两个拷贝在resres（site of resolution site of resolution）位点发生重组，释放）位点发生重组，释放两个复制子。这一过程两个复制子。这一过程称为拆分称为拆分(ResolutionResolution)，在解离酶作用下进行。，在解离酶作用下进行。第37页3.3.非复制转座断裂和再非复制转座断裂和再连接过程：连接过程：Cross structureCross structure中供体中供体与转座子之间未断裂与转座子之间未断裂链被切开；链被切开；转座子与两侧靶链连转座子与两侧靶链连接。接。Donor(black);target(green)第38页7.3.4 7.3.4 转座子转座特征转座子转座特征 p204p2047.3.5 7.3.5 转座引发遗传学效应转座引发遗传学效应(1)(1)转座引发插入突变转座引发插入突变 各种各种IS IS、TnTn都能够引发插入突变。都能够引发插入突变。假如插入位于某操纵子前半部分，就可能造成极性假如插入位于某操纵子前半部分，就可能造成极性突变，造成该操纵子后半部分结构基因表示失活。突变，造成该操纵子后半部分结构基因表示失活。(2)(2)转座产生新基因转座产生新基因 假如转座子上带有抗药性基因，假如转座子上带有抗药性基因，它首先造成靶它首先造成靶DNADNA序列上插入突变，同时也使这个序列上插入突变，同时也使这个位点产生抗药性。位点产生抗药性。第39页(3)(3)转座产生染色体畸变转座产生染色体畸变 当复制性转座发生在宿主当复制性转座发生在宿主DNADNA原原有位点附近时，往往造成转座子两个拷贝之间同源重有位点附近时，往往造成转座子两个拷贝之间同源重组，引发组，引发DNADNA缺失或倒位。若同源重组发生在两个正缺失或倒位。若同源重组发生在两个正向重复转座区之间，就造成宿主染色体向重复转座区之间，就造成宿主染色体DNADNA缺失；若缺失；若重组发生在两个反向重复转座区之间，则引发染色体重组发生在两个反向重复转座区之间，则引发染色体DNADNA倒位。倒位。第40页（4 4）转座引发生物进化）转座引发生物进化 因为转座作用，使一些因为转座作用，使一些原来在染色体上相距甚远基因组合到一起，构原来在染色体上相距甚远基因组合到一起，构建成一个操纵子或表示单元，可能产生一些具建成一个操纵子或表示单元，可能产生一些具育新生物学功效基因和新蛋白质分子。育新生物学功效基因和新蛋白质分子。第41页玉米转座子玉米转座子 1932 1932年，美国玉米遗传学家年，美国玉米遗传学家B.McClintockB.McClintock发觉玉米发觉玉米籽粒色斑不稳定遗传现象，于籽粒色斑不稳定遗传现象，于19521952年，第一次提年，第一次提出转座因子概念。出转座因子概念。7.3.6 7.3.6 真核生物转座因子：真核生物转座因子：第42页玉米控制原件玉米控制原件 Ac-Ds Ac-Ds系统系统(activator-dissociation-system)(activator-dissociation-system)，即激活，即激活-解离系统；解离系统；Spm-dSpm(suppressor-promoter-Spm-dSpm(suppressor-promoter-mutator),mutator),即抑制即抑制-促进促进-增变系统；增变系统；Dt(dotted)Dt(dotted)即斑点系统即斑点系统第43页若玉米带有野生型若玉米带有野生型C基因，则胚乳呈紫色；基因，则胚乳呈紫色；C基因突变阻断了紫色素合成，那么胚乳呈基因突变阻断了紫色素合成，那么胚乳呈白色白色;在胚乳发育过程中，突变发生回复造成斑点在胚乳发育过程中，突变发生回复造成斑点产生产生,回复突变发生在早期发育阶段，紫斑就回复突变发生在早期发育阶段，紫斑就比较大比较大;McClintock推测原来推测原来C突变（无色素）是由突变（无色素）是由一个一个“可移动控制因子可移动控制因子”引发，称解离因子引发，称解离因子(dissociator，Ds)，它能够插入到，它能够插入到C基因中基因中（即转座）。（即转座）。另一个可移动控制因子是激活因子另一个可移动控制因子是激活因子(activator，Ac)，它存在可激活，它存在可激活Ds转座，进转座，进入入C基因或其它基因，也能使基因或其它基因，也能使Ds从基因中转从基因中转出，使突变基因产生出，使突变基因产生“回复突变回复突变”，这就是，这就是Ac-Ds系统系统Ac-Ds系统系统 第44页Ac-Ds控制系统控制系统Ac(autonomouselement)，即自主控制因子，即自主控制因子:含有含有2个转座酶基因、个转座酶基因、3个非编码区，两端个非编码区，两端有有11bpIR。Ac可自主转座，能使可自主转座，能使Ds因子活因子活化，经过化，经过Ds控制结构基因表示。控制结构基因表示。Ds(noautonomouselement),又称解离因子又称解离因子:Ac能活化能活化Ds，使其在基因组内转座或插入，使其在基因组内转座或插入结构基因之内。玉米结构基因之内。玉米Ds存在能抑制邻近基因存在能抑制邻近基因表示。表示。第45页第46页87kD转座酶转座酶P P因子诱发果因子诱发果蝇杂种不育蝇杂种不育P P品系雄性品系雄性MM品系雌性品系雌性子子代生殖细胞发代生殖细胞发育不全。育不全。2.2.果蝇转座原件果蝇转座原件-P-P因子因子第47页