天然产物五味子乙素对口腔癌细胞增殖、凋亡及侵袭的影响.pdf

北京口腔医学 2024年第32卷第1期 Beijing Journal of Stomatology February 2024，Vol.32，No.116口腔癌是头颈部最常见的恶性肿瘤。但目前治疗口腔癌的药物具有生物毒性和短期即出现耐药性等问题，使得近 50 年来口腔癌 5 年生存率仍徘徊在 50%左右1。因此，研发抗癌新药，对口腔癌的治疗具有重要意义。天然化合物自古以来就被广泛用于预防和治疗各种疾病。研究表明，五味子乙素具有多种生物活性，具有抗氧化、抗肿瘤、保肝等功能2,3。五味子乙素可通过抑制肿瘤血管生成、诱导细胞凋亡、抑制肿瘤的侵袭和转移、逆转肿瘤的耐药性等多种机制，抑制乳腺癌、胃癌、肝癌等疾病的进展4,5。但五味子乙素在口腔癌中的作用目前尚未见文献报道。过氧化物还原酶 1(Peroxiredoxin1，Prx1)是过氧化物氧化还原酶家族中的重要成员之一，具有清除细胞内 H2O2来保护细胞免受氧化损伤和参与细胞凋亡的作用。研究表明 Prx1 在一些恶性肿瘤包括口腔癌中表达异常增高6，并发现 Prx1 与肿瘤细胞凋亡及侵袭转移密切相关7,8。我们前期实验中，发现 Prx1 参与口腔癌细胞的凋亡、侵袭和迁移9。本研究拟利用口腔癌细胞株 SCC15、CAL27 细胞，研究五味子乙素对口腔癌增殖、凋亡、侵袭的作用及对 Prx1 表达的影响，探讨五味子乙素对口腔癌的作用机制，为口腔癌新药研发提供实验依据。天然产物五味子乙素对口腔癌细胞增殖、凋亡及侵袭的影响王春晓 汤晓飞 陈中坚 薛梅 路云萍 刘燕 林子琦 周晓军 沈建芬 黄优【摘要】目的 研究天然产物五味子乙素（Schisandrin B，Sch B）对口腔癌细胞增殖、凋亡和侵袭的影响。方法 用不同浓度的五味子乙素分别处理口腔癌细胞株 SCC15 和 CAL27 细胞 24 h 和 48 h，采用 CCK-8 法和AnnexinV-FITC/PI 双标记流式细胞术，检测五味子乙素对口腔癌细胞增殖及凋亡的影响；采用 Transwell 实验分别检测五味子乙素对细胞侵袭的影响，采用 qRT-PCR 和 Western Blot 检测五味子乙素对 Prx1 mRNA 与蛋白表达的影响。结果 CCK-8 和流式细胞术检测发现五味子乙素明显抑制 SCC15 和 CAL27 细胞增殖并促进细胞凋亡，呈时间和剂量依赖性（P 0.05）。Transwell 实验结果显示，五味子乙素对侵袭的抑制作用呈时间和剂量依赖性。五味子乙素对 Prx1 mRNA 的表达无显著影响，但对其蛋白表达有显著的抑制作用（P 0.05）。结论 五味子乙素可能通过调控 Prx1 蛋白的表达抑制口腔癌细胞的增殖、侵袭，促进细胞凋亡。【关键词】五味子乙素；口腔癌；Prx1；增殖；凋亡；侵袭【中图号】R739.8【文献标识码】A【DOI】10.20049/j.bjkqyx.1006-673X.2024.01.004Schisandrin B regulates cell proliferation,apoptosis,invasion of oral cancer cells WANG Chun-xiao,TANG Xiao-fei,CHEN Zhong-jian,XUE Mei,LU Yun-ping,LIU Yan,LIN Zi-qi,ZHOU Xiao-jun,SHEN Jian-fen,HUANG You.Suzhou Stomatological Hospital,Suzhou 215000,China【Abstract】Objective To investigate the effect of schisandrin B(Sch B)on the proliferation，apoptosis and invasion on oral cancer cells.Methods The cell viability was detected by CCK8 assay.Apoptosis was measured by Annexin V-fluorescein isothiocyanate/propidium iodide staining.Cell invasion was tested using transwell matrigel invasion assay.The mRNA and protein expression of peroxiredoxin1(Prx1)was examined by qRT-PCR and Western blot.Results Sch B significantly inhibited the proliferation of SCC15 and CAL27 cells and promoted cell apoptosis in a time-dependent and dose-dependent manner(P0.05).The inhibitory effect of Schisandrin B on invasion was time-dependent and dose-dependent.Schisandrin B had no significant effect on the expression of Prx1 mRNA,but had a significant inhibitory effect on its protein expression(P0.05).Conclusions Sch B may inhibit the proliferation and invasion of oral cancer cells and promote cell apoptosis by regulating the expression of Prx1 protein.【Key words】Schisandrin B;Oral cancer;Prx1;Cell proliferation;Apoptosis;Invasion基金项目：苏州口腔医院院级科研基金项目（SZKQYY 20B007）；江苏省口腔医学会第五届征集专委会 中青年科研项目（Joa-2011-4）作者单位：215000 苏州 苏州口腔医院（王春晓、黄优、陈中坚、刘燕、林子琦、周晓军、沈建芬）；首都医科大学口腔医学院（汤晓飞、路云萍）通信作者：黄优，E-mail：，电话：[phone]北京口腔医学 2024年第32卷第1期 Beijing Journal of Stomatology February 2024，Vol.32，No.117材料和方法1.实验材料和试剂口腔癌细胞株来源于首都医科大学附属北京口腔医院研究所；五味子乙素(上海源叶公司)；培养基 DMEM、胎牛血清（赛默飞世尔科技公司）；CCK-8（上海生工）；细胞凋亡检测试剂盒 Annexin V Apoptosis Detection Kit、Transwell 小室、人工基底膜（美国 BD 公司）；Prx1 抗体（美国 CST 公司）。2.细胞培养和药物配置10%胎牛血清的 DMEM 培养基，并置于 37，5 CO2 的恒温培养箱中培养。五味子乙素由DMSO 溶解为 20 mg/ml 初始浓度。3.CCK-8 法检测细胞增殖实验设置实验组，五味子乙素浓度分别为 15、30 和 60 g/ml。取对数生长期细胞 96 孔板，每组 6个复孔。每孔 10 l CCK8 试剂，置于 37 度孵箱内培养 2.5 h 终止培养。在酶标仪上测定各孔吸光度（A值），实验重复 3 次。4.Annexin-V-FITC/PI 流式细胞术检测细胞凋亡细胞接种于 6 孔板，处理同 CCK-8，用 PBS 重新悬浮细胞，按照 Annexin-V-FITC/PI 凋亡检测试剂盒说明书，上流式细胞仪检测。实验重复 3 次。5.Transwell 侵袭实验用含无血清的 DMEM 培养液将各组细胞加入铺有人工基底膜的 Transwell 的上室中,下室中加入含 10胎牛血清的培养液。37培养 24 h 后，用0.5的结晶紫对上室底部细胞进行染色，用棉签除去上室内侧的细胞。高倍镜下随机选取5个视野，计数迁移至滤膜下层的细胞，实验重复 3 次。6.RNA 的提取、逆转录合成 cDNA 及 qRT-PCR 检测用 不 同 浓 度 的 五 味 子 乙 素,处 理 SCC15、CAL27 细胞 48 h，分别提取各组细胞总 RNA,反转录成 cDNA。进行 PCR 的扩增。采用相对定量方法进行结果分析，计算 2-Ct值。实验重复 3 次。7.Western Blot 检测SCC15、CAL27 细 胞 处 理 分 组 如 qRT-PCR，收集各组细胞提取总蛋白，变性，凝胶电泳，转膜，封闭，加入一抗兔抗人 Prx1 多克隆抗体(1：2000)或兔抗人-actin(1：1000)，4孵育过夜，洗膜，加入二抗辣根过氧化酶标记羊抗兔 IgG(1：3000)，37孵育 1 h，洗膜，用 ECL 显影液检测底物的表达，Labworks 图像分析系统对结果进行分析。8.统计学方法采用 SPSS16.0 软件对实验结果数据进行统计学处理。两样本均数比较采用配对 t 检验：多样本均数比较采用单因素方差分析。检验以 P0.05 为差异具有统计学意义。结 果1.五味子乙素对口腔癌细胞增殖的影响五味子乙素对口腔癌细胞抑制率随浓度增加而增加，且 48 h 的抑制率显著高于 24 h，提示五味子对口腔癌细胞增殖具有抑制作用，且呈时间和浓度依赖性（图 1,2）。2.五味子乙素对口腔癌细胞凋亡的影响五味子乙素组细胞凋亡率与对照组相比，随着浓度和时间的增加而增加（图 3,4）。3.五味子乙素对口腔癌细胞侵袭的影响与对照组相比,五味子乙素组细胞侵袭率随着浓度和时间的增加而减弱(P0.05)，且药物组的细胞形态变圆，浓度越高细胞越小越圆（图 5,6）。4.五味子乙素对口腔癌细胞 Prx1 mRNA 表达的影响qRT-PCR 检测结果显示，五味子乙素对口腔注：*：P0.05；*：P0.01，高 浓 度 VS 低 浓 度；#：P0.05；#：P0.01，24 h VS 48 h图 1 五味子乙素对 SCC15 细胞增殖的影响注：*：P0.05；*：P0.01，高 浓 度 VS 低 浓 度；#：P0.05；#：P0.05)（图 7,8）。5.五味子乙素对口腔癌细胞Prx1 蛋白表达的影响口腔癌细胞 Prx1 蛋白的表达随着药物浓度的增加而降低（P0.05）（图 9,10）。讨 论越来越多的研究表明，一些天然植物产物在癌症治疗方面发挥着积极作用10。五味子乙素是木脂素的一种，为中药五味子主要活性成分，因其具有优异的抗氧化、抗肿瘤等作用在多种肿瘤中均有研究，但其在口腔癌中是否也有显著的作用尚未见报道。研究表明，五味子素乙素以剂量、时间依赖性的方式抑制人胆囊癌细胞 GBC-SD 和 NOZ 细胞的活力和增殖，并促进细胞凋亡。Western blot 分析显示，五味子乙素处理细胞后促凋亡相关基因 Bax、cleaved caspase-9、cleaved caspase-3、cleaved PARP 表达上调，抑制凋亡相关基因 Bcl-2、NF-B、cyclin D1、CDK-4 表达下调。此外，该药物还能抑制皮下移植 NOZ 瘤裸鼠的肿瘤生长。这些数据表明，五味子乙素通过调控凋亡相关蛋白的表达诱导胆囊癌细胞凋亡11。本研究中，我们通过体外试验发现，五味子乙素显著抑制口腔癌 SCC15、CAL27 细胞的增殖，诱导了细胞凋亡，且五味子乙素对口腔癌细胞的抑制增殖和促进凋亡呈时间和浓度依赖性。侵袭和转移是导致恶性肿瘤死亡的主要原因。五味子乙素除了通过抑制肿瘤细胞增殖和促进凋亡，还通过抑制肿瘤细胞的侵袭抑制肿瘤的进展。Yan 等12发现五味子乙素和多西紫杉醇均可降低肿瘤细胞活力，诱导细胞凋亡，抑制细胞侵袭。五味子乙素和多西紫杉醇联合应用更明显地增强抗肿瘤的作用。Li 等13发现五味子乙素显著抑制细胞侵袭迁移和上皮间质转化（epithelial-mesenchymal transition,EMT）进程，并发现五味子乙素可减轻肺癌干细胞的干性。其机制可能是五味子乙素通过靶向 NF-B 和p38 MAPK 信号通路对大细胞肺癌细胞产生抑制作用。本实验发现，五味子乙素对口腔癌细胞侵袭的抑制作用呈时间和浓度依赖性。氧化应激可诱导 DNA 损伤，促进各种癌症的进展14。大量实验注：*：P0.05；*：P0.01，高浓度 VS 低浓度；#：P0.05；#：P0.01，24 h VS 48 h图 3 流式细胞术检测五味子乙素处理对 SCC15 细胞凋亡率的影响 A：流式检测结果；B：细胞凋亡率注：*：P0.05；*：P0.01，高浓度 VS 低浓度；#：P0.05；#：P0.01，24 h VS 48 h图 4 流式细胞术检测 CAL27 细胞的凋亡率 A：流式检测结果；B：细胞凋亡率ABAB北京口腔医学 2024年第32卷第1期 Beijing Journal of Stomatology February 2024，Vol.32，No.119表明，五味子乙素可提高细胞超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）水平，抑制脂质过氧化，降低乳酸脱氢酶和丙二醛释放活性氧，从而直接清除自由基，发挥抗氧化作用15。Nasser 等16发现五味子乙素可以有效增加前列腺癌细胞活性氧簇（reactive oxygen species,ROS）水平，且具有浓度依赖性。这些结果提示五味子乙素可能通过调节氧化应激而抑制肿瘤生长。过氧化物还原酶属于抗氧化蛋白超家族，广泛存在于原核生物和真核生物中。作为抗氧化剂，Prxs 蛋白含有能够氧化 H2O2的活性半胱氨酸位点，能够清除正常组织和细胞内的活性氧，保护细胞抵抗氧化应激。Prx1 是 Prxs 家族的主要成员，是一种清除 ROS 的过氧化物解毒酶。Prx1 在包括口腔鳞状细胞癌在内的各种恶性肿瘤中表达增高，并与患者预后相关。本课题组前期研究表明 Prx1 和氧化损伤可能参与口腔白斑和口腔鳞状细胞癌的发病机制17。Prx1 过表达可增加口腔癌细胞的侵袭和迁移，Prx1 沉默可降低细胞的侵袭和迁移，Prx1 调节烟草相关口腔鳞状细胞癌中的 EMT 过程9。在本研究中，五味子乙素处理口腔癌SCC15 和 CAL27 细 胞，Prx1 蛋 白表达明显降低，而 mRNA 水平未表现出明显变化，推测五味子乙素可能在蛋白翻译阶段影响口腔癌细胞Prx1 的表达，进而调控口腔癌细胞的增殖、迁移和侵袭。本研究结果表明，五味子乙素可能通过调控Prx1 的表达，抑制口腔癌细胞的增殖、侵袭和迁移，促进细胞凋亡。本研究为探讨新的口腔癌的治疗方法提供了实验依据及新靶点。参 考 文 献 1 Eshraghi Samani R,Shirkhoda M,Hadji M,et al.The prognostic 注：*：P0.05；*：P0.01，高浓度 VS 低浓度；#：P0.05,24 h VS 48 h图 5 Transwell 实验检测五味子乙素对 SCC15 细胞侵袭的影响 A：高倍镜下结果；B：细胞侵袭结果注：*：P0.05，*：P0.01，高浓度 VS 低浓度；#：P0.05，24 h VS 48 h图 6 Transwell 实验检测五味子乙素对 CAL27 细胞侵袭的影响 A：高倍镜下结果；B：细胞侵袭结果AB图 7 五味子乙素对 SCC15 细胞 Prx1 mRNA 表达的影响 北京口腔医学 2024年第32卷第1期 Beijing Journal of Stomatology February 2024，Vol.32，No.120value of lymph node ratio in survival of head-and-neck squamous cell carcinoma.J Res Med Sci,2018,23:35.2 Li WL,Xin HW,Yu AR,et al.In vivo effect of Schisandrin B on cytochrome P450 enzyme activity.Phytomedicine,2013,20(8-9):760-765.3 Zhu HY,Zhang XR,Guan J,et al.Pharmacokinetics and tissue distribution study of schisandrin B in rats by 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