1018四湖总干渠壬基酚和双酚A对餐繁殖的影响1.doc

四湖总干渠环境雌激素不同浓度江段繁殖生物学比较研究

郭嫦娟1,2，廖涛3，柳明1，谢松光1,4
（1.中国科学院水生生物研究所，中国科学院水生生物多样性与保护重点实验室，武汉430072；2.中国科学院研究生院，北京 100049；3. 湖北省农业科学院，武汉430062；中国科学院水生生物研究所淮安研究中心，淮安223002）

摘 要：本文选取湖北四湖总干渠污染水平不同的3个江段（A、B、C），A离源头较近，B位于一农药厂排污口下方，C位于一城镇居民排污口下方，比较繁殖群体的生物学特征。A江段水体中未检测出环境雌激素，而B、C两江段主要含有壬基酚和双酚A，两种污染物总浓度在20μg/L左右。与A江段相比，B、C江段繁殖群体中雌性个体的比例明显较高，卵粒较小；雄性个体精巢中空增大，结缔组织坏死或断裂，精原细胞和精子细胞密度低；肝体指数增大、肝组织出现大量空泡，肝细胞密度降低、细胞核不明显等特点。壬基酚和双酚A已被证明具有显著的雌激素活性和生殖毒性。因此，B、C江段壬基酚和双酚A环境雌激素浓度较高可能是导致繁殖群体生物学特征改变的重要原因。

关键词： 环境雌激素；壬基酚；双酚A； (Hemiculter leucisculus)；繁殖生物学特征

Abstract：Recently, a lot of data from laboratory experiments have supported that nonylphenol and bisphenol A in the aquatic environment can impact the reproductive health of various fish species, but the evidence of field studies is scarce. In this paper, the study location is the Main Irrigation Channel of the Four Lake area of Hubei province, we choose three different pollution level sections of this river as the sample locations, use GC-MS to detect the level of nonylphenol and bisphenol A in the water, and compare sex ratio, hepatosomatic index(HSI), egg diameter, liver and testis histology of sawbelly. No target chemicals was detected in location A, but the water both in location A and B contained nonylphenol and bisphenol A on some states. Sawbelly in B and C have higher female percentage and HSI than A, but smaller egg diameter than A, at the same time, differences in liver and testis histology structure between these three locations are very apparent.

Key words：endocrine disrupting chemicals, nonylphenol, bisphenol A, sawbelly (Hemiculter leucisculus), Reproductive characteristics

环境内分泌干扰物(Environmental endocrine disrupting chemicals, EDCs)是指可干扰生物体内保持自身平衡、调节发育过程中的内源激素的合成、分泌、运输、结合和代谢等过程的外源性化学物质[1]，又称环境雌激素。我国主要河流水系及沿海地区水体均不同程度受到环境雌激素的污染，多氯联苯(PCBs)、壬基酚、双酚A、邻苯二甲酸酯类等有机化工原料内分泌干扰物一般在南方水体检出率较高，有机氯农药和生活用水排放是这些环境雌激素的主要来源[2]。环境雌激素对生态环境和人类健康的影响已受到社会的广泛关注。
大量实验室毒性实验证明，环境雌激素影响鱼类的生长和繁殖[3-5]，这种个体水平的影响可能进一步影响鱼类的种群动态。然而有关自然水体中环境雌激素的生物学效应研究还很少。(Hemiculter Leucisculus)隶属于鲤形目(Cyprinidae)、鲤科(Cyprinidae)、属，生活于水体中上层的小型鱼类，在我国分布广泛[6]。分批产卵，繁殖季节为4-8月，5-6月为盛季。本文选择湖北省境内四湖总干渠，比较环境内分泌干扰物不同污染程度江段的生长和繁殖，以期为评价环境内分泌干扰物对鱼类的影响效应提供自然水体的证据，并为筛选内分泌干扰物的生物标志物提供依据。

1 研究地点

图1 湖北四湖总干渠，示采样点位置A、B、C (●)
Fig. 1 The main Irrigation Channel of the Four Lake area in Hubei Province, China, showing the sampling locations A, B, and C (●)

四湖总干渠源于湖北荆州郊外，经潜江、监利、洪湖至新滩口汇入长江，全长100多公里[7]。沿途城镇生活污水、工业废水和农田用水排入总干渠[8]。总干渠中没有鱼类放养和渔业捕捞。
采样在A、B、C三个河段进行。其中A段（30°21′49″N/112°30′12″E）离源头较近，水质良好；B段（30°11′09″N/112°36′09″E）位于一个农药厂排污口下方；C段（30°03′24″N/112°54′21″E）位于某城镇排污口下方。
2 材料与方法
2.1 主要仪器与试剂
波恩氏液（苦味酸饱和水溶液：甲醛：冰醋酸为15：5：1）；肝素钠溶液（用无菌水配成1mg/mL的浓度，4℃保存）；5%甲醛溶液，无水乙醇，浓H2SO4 (上海国药)；雌激素标准品（Sigma公司）；色谱分析中的乙酸乙酯、甲醛、正己烷为农残级，乙腈为色谱纯
电子天平 (0.001g)（SHIMADZU- BL-320H）；GC-MS（Agilent）；HBL柱（Waters）；光学显微镜（OLYMPUS BX51）；解剖镜（OLYMPUS-SZX16）；轮转式切片机（LEICA -RM2235）

2.2样品采集与处理
采样于2009年6月19日和20日进行，采用流刺网（长：17m，宽1m，网目：2.0cm）采集繁殖群体，每个采样点采集30尾以上。样品采集后立即置于冰块中保存，带回实验室后测定标准体长(standard length, SL, 0.1mm)、称体重(body weight, BW, 0.01g)；将腹部剖开，观察性腺，确定性别；取出肝脏、称重（liver weight，LW，0.001g），肝体指数（HSI）采用以下公式计算：
HSI=LW/BW×100%。
取部分肝脏和精巢组织用波恩氏液固定12-24 h后，转入70%乙醇溶液中保存，用于组织切片和观察。切片时先后采用乙醇梯度浓度脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，切片，烘片，二甲苯脱蜡、系列乙醇复水，苏木精—伊红染色，乙醇脱水、二甲苯透明，中性树胶封片，在显微镜下观察并拍照；选择性腺发育至IV期或V的雌鱼，分离部分卵巢，称重后固定于5%的福尔马林溶液中，在解剖镜下测定卵径。
鱼类采集同时用采水器采集表层水样3L，现场用浓硫酸固定，采用0.45μm滤膜过滤，用浓硫酸将pH值调为3左右，保存于4℃，48小时内进行环境雌激素分析。测定时采用固相萃取方法对样品进行浓缩分离，采用气相色谱与质谱联用GC—MS的方法测定水样中环境雌激素浓度[9]。

2.3 数据处理
采用嵌套方差分析（Nested ANOVA）检验不同样点间卵径差异显著性。采用单因子方差分析（One-way ANOVA）检验不同样点、性别的HSI的差异显著性。显著性检验的显著水平为P<0.05。统计分析采用 STATISTICA 6.0 进行。

3 结果
3.1 不同江段内分泌干扰物浓度
A河段水样中没有检测出环境雌激素， B、C两河段水样中均检测出壬基酚和双酚A两种环境雌激素，B、C两河段间两种污染物浓度均无显著性差异(表1)。

3.2繁殖生物学指标
A、B、C三个样点分布采集繁殖群体个体51尾、41尾和39尾，其中雌鱼所占比例分别为39%、58%和61%。污染点B、C的雌鱼所占比例高于对照点A（表1）。
样点对卵径存在显著的影响（Nested ANOVA, P<0.05），多重比较表明A样点卵径平均值显著小于B、C样点，B、C样点间卵径平均值差异不显著（表1）。

表1湖北四湖总干渠不同采样江段（A、B、C）环境雌激素浓度和繁殖群体的生物学特征。采样江段位置见图1.
Table 1 The concentration of envirnonmetal endron in the water and the reproductive biology characteristics of Hemiculter leucisculus at the three sampling sections (A, B, and C) in the Main Irrigation Channel of the Four Lake area in Hubei Province. The locations of the sampling locations are showed in Figure 1.

A
B
C
环境雌激素浓度
双酚A
-
7.30±1.91
3.15±1.11
壬基酚
-
12.84±3.49
18.12±2.84
繁殖群体生物学指标
雌性个体百分比（%）
38.0
58
61
卵径（mm）
0.67±0.0837a
0.5079±0.0521b
0.5100±0.048 b
肝体指数（雌）
1.4415±0.9447a
2.5668±0.5707 b
2.7038±0.4399 b
肝体指数（雄）
0.9577±0.5490a
1.4018±0.5849 b
1.6850±0.4838 b
注：同一行中参数字母相同则无显著性差异（P＞0.05），反之，则有显著性差异（P＜0.05）
Note: Means in a row with different superscripts are significantly different from each other (P＜0.05).

3.3肝体指数和肝脏组织学
采样点和性比对的HSI均存在显著差异（two-way ANOVA）。A样点雌性和雄性个体的HSI均显著低于B、C样点（P<0.05）；三样点中雌性个体的肝体指数均显著高于雄性个体（P<0.05）（表1）。
不同采样点肝脏切片的存在明显的差异。对照样点A的肝细胞排列紧密，细胞核清晰，细胞质丰富（图2-A）；但是B和C采样点的肝组织出现大量空泡、孔洞，肝细胞密度降低，细胞核不明显。

图2 四湖总干渠不同江段肝脏组织切片显微照片。图中A、B、C分别代表从A、B、C江段采集的个体。示B、C江段肝脏组织空泡（↓）
Fig. 2 The liver histological pictures of Hemiculter leucisculus from different sections of the Main Irrigation Channel of the Four Lake Area in Hubei Province. Pictures A, B, and C represent the fish individuals from the sampling locations A, B, and C respectively. Liver vacuole is located in pictures A and B （↓）.

3.4 精巢切片
不同采样河段精巢组织切片存在明显差异（图3）。 A样点的精巢发育良好，生精小叶直径很大，排列紧密，小叶间结缔组织丰富，各个时期的细胞染色质丰富，嗜碱性强，被染成深色（图3-A1, -A2）； B、C两样点精巢中空显著较大，结缔组织坏死或断裂，精原细胞和精子细胞密度都明显下降，表明生精过程受阻，精巢的发育受到抑制（图3-B1, -B2, -C1, -C2）。

图3 四湖总干渠不同江段精巢组织切片。图A1、B1、C1和A2、B2、C2分别为A、B、C江段Can精巢组织在不同显微放大倍数下的照片。示精巢组织间隙（↓）
Figure 3. The testis histological pictures of Hemiculter leucisculus from different sections of the Main Irrigation Channel of the Four Lake Area in Hubei Province. Pictures A1, B1, C1 and A2, B2, C2 represent the fish individuals from the sampling locations A, B, and C respectively with the pictures taking at different magnifications.Testis tissue interval is located in the pictures (↓）.

4 讨 论
四湖总干渠源头A江段水体未检测出内分泌干扰物，而B、C两江段主要含有壬基酚和双酚A，两种污染物总浓度均在20μg/L左右。与A江段相比，B、C江段繁殖群体中雌性个体的比例明显较高，卵粒较小；雄性个体精巢中空增大，结缔组织坏死或断裂，精原细胞和精子细胞密度低；肝体指数增大、肝组织出现大量空泡，肝细胞密度降低、细胞核不明显等特点。壬基酚和双酚A等一类内分泌干扰物已经被证明具有显著雌激素活性，又称环境雌激素[10][11]。由于这些环境雌激素化学结构与鱼体内生理合成的雌激素十分相似，可以与体内雌激素受体结合，影响相关内源雌激素的合成、释放、输送、代谢、结合、作用或消除过程，进而影响鱼类的早期生长发育、性别分化、繁殖等[12]。双酚A对斑马鱼的生殖有明显的抑制作用，而壬基酚和双酚A具有协同效应甚至中断生殖行为[13]。B、C江段水体中壬基酚和双酚A内分泌干扰物浓度较高可能是导致繁殖群体生物学特征改变的重要原因。
水体中的环境雌激素能够影响鱼类性别决定过程，对鱼类产生明显的雌性化效应，改变鱼类个体内源激素表达水平，从而引起鱼类群体性别比率的改变。如英国调查报告表明，生活在工厂排污河流的石斑鱼发生了严重的雌性化现象[14]，在诺福克郡的艾尔河观测点，接受调查的雄性石斑鱼60％出现了雌性化的特征，雌性石斑鱼比例显著高于对照点[15]。本研究中B、C江段繁殖群体的雌性个体比例较高壬基酚和双酚A的雌激素效益一致。
精巢也是环境雌激素可以直接产生作用的靶器官。Bjerselius[16]和Gimeno[17]都发现在雌激素暴露下的雄性鲫鱼，壬基酚暴露下的雄性鲤鱼都会产生精子数量下降，甚至没有精液的现象。Jobling发现暴露在壬基酚中的虹鳟，其雄性生殖腺的生长受抑制[18]。双酚A对断乳期F1雄性子代大鼠生殖和发育有影响，可能是导致生精细胞凋亡增强，增殖减慢，细胞内转录、表达受阻[19]。随着NP浓度的增加，有可能使精巢中的一些细胞凋亡或者坏死的速度增加[20]。本研究中环境雌激素污染物浓度较高的B、C江段精巢组织结构破坏与以上环境雌激素效应一致。
进入生物体内的壬基酚和双酚A必须通过肝脏的代谢才能排除体外，内分泌干扰物的刺激下，混合功能氧化酶等肝脏解毒酶的诱导效应致使肝细胞肿大，肝脏增大[21]。刘萍发现暴露于壬基酚、双酚A、辛基酚和17β-雌二醇这四种化合物中的金鱼HSI较对照组显著升高[22]。而B、C点肝脏细胞肿大，核萎缩变形，细胞空泡化以及局部肝组织坏死，与环境雌激素作为外源异生物质在肝中的代谢密切相关[23]。
B、C两点的卵径均显著低于A点卵径(P<0.05)。这在有关环境雌激素效应研究中还没有报道。卵径大小直接影响出膜仔鱼的大小，进而影响早期个体存活率[24]，B、C两江段的卵径较小可能导致早期生活史阶段存活率降低，进而影响种群动态，需要在以后的研究中进一步关注。
虽然已经有很多受控实验证明环境雌激素对鱼类繁殖影响的研究，但野外原位实验更为这类研究提供更直接的证据。本研究显示在自然环境中，环境雌激素浓度较高的水体鱼类繁殖群体的繁殖生物特征显著改变，可能导致鱼类精子和卵子质量降低、繁殖成功率下降等，从而影响鱼类种群数量和结构。很多天然水体都受到环境雌激素不同程度的污染，如我国黄河口表层水体NP平均值为47.5ng/L[25]，珠江三角洲河段为0.02~0.165μg/L[26]，北黄海近岸浓度为15.13~762.73ng/L[27]。有关环境雌激素污染物对鱼类自然种群种群动态的影响需要进一步通过研究环境雌激素污染水体相关鱼类种群的种群动力学特征研究进一步阐述。

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