长链非编码RNAH19在乳腺癌组织中的表达及临床意义.pdf

中文科技期刊数据库（全文版）医药卫生 收稿日期：2024 年 01 月 23 日 作者简介：成端辉（1972），男，壮族，广西来宾人，研究生，副主任医师，研究方向为普通外科。-78-长链非编码 RNAH19 在乳腺癌组织中的表达及临床意义 成端辉 南宁市第六人民医院，广西 南宁 530003 摘要：摘要：目的 为探讨长链非编码 RNA H19 在乳腺癌组织中的表达及其在临床上的意义。采用实时荧光定量 PCR 对2013 年 1 月至 2013 年 12 月手术切除的 68 对乳腺癌组织及相应癌旁组织的 H19 水平进行检测。通过受试者工作特征（ROC）曲线评估 H19 在乳腺癌诊断中的价值，并分析其与乳腺癌的临床病理参数的关系。应用 Kaplan-Meier法探讨 H19 的表达与患者生存率之间的关系，并通过单因素及 Cox 多因素比例风险模型分析影响乳腺癌预后的因素。结果 乳腺癌组织中 H19 的相对表达量显著高于癌旁组织（2.0050.709vs.1.1090.387,P0.001）。H19的 ROC 曲线下面积为 0.850，诊断阈值为 1.66，约登指数为 0.647，特异度和敏感度分别为 94.1%和 70.6%。H19的表达与淋巴结转移（P=0.001）、组织分化程度（P=0.002）、TNM 分期（P=0.002）及 HER-2 表达状态（P=0.036）相关，但与年龄、肿瘤直径、ER、PR 以及组织学类型无显著关联（P0.05）。高表达 H19 的患者无进展生存率及总生存率较低表达者降低（P0.05）。Cox 多因素回归模型分析结果表明，H19 的表达、淋巴结转移、TNM 分期和HER-2 表达是影响乳腺癌患者预后的独立因素（P0.05）。综上所述，H19 在乳腺癌组织中呈现高表达，参与乳腺癌的发生和发展，可能成为乳腺癌早期诊断和评估预后的潜在靶点。关键词：关键词：乳腺癌；长链非编码 RNA；H19；预后 中图分类号：中图分类号：R737.9 乳腺癌作为女性最常见的恶性肿瘤之一，每年在全球范围内约有 170 万人被确诊罹患，其中大约有 50万人因该病丧生。尽管全球对乳腺癌的诊断和治疗有所进展，但在发展中国家，乳腺癌的发病率依然呈上升趋势1。这突显了对乳腺癌发病机制的深入研究的紧迫性，同时也强调了寻找新的治疗和检测目标的重要性。其中，长链非编码 RNA（lncRNA）引起了广泛的关注。这类 RNA 分子的长度超过 200 核苷酸，虽然不涉及蛋白质编码，但在细胞生物学中扮演着关键的角色。尤其在近年的研究中，lncRNA 已被证实与多种肿瘤的生物学特性密切相关，其中包括调控肿瘤细胞的增殖、分化和凋亡等重要过程2-4。这为深入了解乳腺癌的发病机制提供了新的视角，并为寻找创新的治疗策略和检测指标打开了大门。因此，全面理解 lncRNA 在乳腺癌中的作用，不仅有助于揭示乳腺癌发生发展的分子机制，也为未来研究中的治疗目标提供了潜在的方向。lncRNA H19（H19）是 lncRNA 的一种，人 H19 长度为 2.3 kb，定位在染色体 11p15.55，能够参与哺乳动物早期胚胎发育，其表达量在组织器官成熟后逐渐下调。近年来研究表明，H19 的表达水平在多种恶性肿瘤中重新上调，并在肿瘤的进展转移过程中发挥重要作用。Zhu 等6研究发现 H19 可以通过抑制 E-cadherin的表达从而促进膀胱癌细胞的转移，其表达量与膀胱癌患者的临床分期显著相关。Gao 等7报道 H19 在肺腺癌组织中呈高表达，可通过介导肺腺癌细胞上皮间充质转化促进肿瘤组织的生长，上述结果均表明 H19 能够作为原癌基因发挥作用。但是关于 H19 在乳腺癌组织中的表达情况及其与患者预后的关系尚未有学者报道。因此，选择使用实时定量聚合酶链反应（qRT-PCR）来检测乳腺癌组织中 H19 的表达水平，并分析其与患者的临床病理特征和预后之间的关系。通过这一研究，旨在深入探讨 H19 是否具有作为乳腺癌预后评估分子标志物的潜在价值。1 资料与方法 1.1 临床资料 为深入了解乳腺癌的临床和组织学特征，我们在南宁市第六人民医院展开了一项全面的研究。该研究的时间跨度自 2013 年 1 月至 2013 年 12 月，期间我们收集了 68 对乳腺癌组织和相应的癌旁组织标本，确保癌旁组织距离原发灶超过 5 厘米。这一步骤旨在确保我们的研究样本具有代表性，以更全面地了解乳腺癌中文科技期刊数据库（全文版）医药卫生-79-的发展。所有参与研究的患者均经过病理学的确诊，确保我们研究的对象均为乳腺癌患者。研究对象的年龄跨度在 36 到 69 岁之间，中位年龄为 48 岁，涵盖了不同年龄段的乳腺癌患者，为我们研究的广泛性提供了支持。通过对患者的临床 TNM 分期进行详细分析，我们发现 10 例为 I 期，14 例为 II 期，44 例为 III 期，其中 45 例发生了淋巴结转移。这些数据有助于我们更好地了解乳腺癌在不同发展阶段的临床表现。组织学分析涉及不同类型的乳腺癌，包括56例浸润性导管癌、8 例浸润性小叶癌以及 4 例混合型乳腺癌。此外，在分化程度方面，我们观察到 8 例高分化，18 例中等分化，以及 42 例低分化的病例。这有助于细致地描绘乳腺癌的组织学特征。进一步地关注了雌激素受体（ER）、孕激素受体（PR）和 HER-2 的表达情况。我们发现 40 例患者为 ER 阳性，38 例为 PR 阳性，而 22 例为 HER-2阳性。这些结果对于了解乳腺癌亚型和治疗选择提供了重要线索。强调研究的伦理合规性。南宁市第六人民医院伦理委员会已经批准了此项研究，同时，我们确保所有参与研究的患者都在事先签署了知情同意书，确保他们对研究的目的和过程有清晰的了解。这一伦理审查和知情同意的过程是确保研究合法、透明的重要步骤。1.2 主要试剂 SYBR R Premix Ex TaqTM II、PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser、TaKaRa MiniBEST Universal RNA Extraction Kit、目的基因 H19 引物与内参 GAPDH 均购自广西科迪试剂公司。1.3 总 RNA 提取与 cDNA 合成 在本研究中，实施了一套系统的实验流程，以获得乳腺癌组织和相应癌旁组织的 RNA。首先，将这些组织样本放置于 Trizol 试剂中，并通过研磨和混合等步骤，确保充分裂解细胞结构，释放 RNA。接下来，通过低温离心的方式，我们有效地分离了上清液，其中包含了我们所需的 RNA 成分，并将其收集置于 EP 管中。为了提高 RNA 的纯度，我们引入了氯仿和异丙醇的处理步骤。具体而言，我们加入了氯仿并进行强烈的振荡，随后在冰上进行冷藏。这个过程有效地去除了上清液中的杂质，为后续的 RNA 处理奠定了基础。紧接着，我们加入了等体积的异丙醇，摇匀后再次冷藏，最终弃去上清液。为进一步净化 RNA，我们引入了 75%乙醇的处理步骤，通过振荡和离心的操作，成功地收集了 RNA 的沉淀，并在 510 分钟内将其干燥并混匀。为了确保我们获得的 RNA 具有高质量和适当的浓度，我们使用了凝胶电泳系统进行检测。这个步骤不仅可以评估 RNA 的完整性，还能够检测是否存在任何污染或降解。最后，为了进一步的分析，我们按照试剂盒说明书的详细步骤，配置了逆转录反应体系，将提取得到的总 RNA 转录成 cDNA。这一系列操作的严密执行为我们后续的实验和数据分析提供了可靠的基础。1.4 qRT-PCR 法检测 H19 的相对表达量 在冰上制备 PCR 反应液，包括 SYBRPremixExTaqTMII10L、H19 上下游引物各 0.8L、cDNA 模板 2L、荧光显色剂 0.4L 以及灭菌蒸馏水 6L，总体积为 20L。扩增过程采用 Real-TimePCRSystem 进行，使用H19 特异性引物和内参 GAPDH 特异性引物。H19 引物序列为上游 5-GGCAAGAAGCGGGTCTGT-3，下游 5-GTGCAGCATATTCATTTCCAAG-3；GAPDH 引物序列上游为 5-AGAAGGCTGGGGCTCATTTG-3，下游为 5-AGGGGCCATCCACAGTCTTC-3。PCR 反应条件为变性 9515s，退火 6025s，延伸 7234s，循环 40 次。利用内参 GAPDH，通过 2Ct 方法8计算 H19 基因的表达水平。这一实验方案的设计和操作确保了对 H19 基因表达量的准确测定。1.5 随访 研究中制定了系统的术后随访计划，包括第 1 个月、第 1 年、第 2 年及随后每年的定期随访，截至 2018年 12 月 31 日。总计 68 例患者参与了随访，跨足 6 至72 个月，中位随访时间为 60 个月。在此期间，33 例患者出现复发或转移，25 例不幸死亡，死因主要与乳腺癌复发或转移有关，另有 2 例患者失访。1.6 统计学分析 为深入了解研究对象的情况，我们运用 SPSS 19.0软件进行了全面的统计学分析。计量资料使用均数标准差表示，并通过独立样本 t 检验比较两组数据。计数资料则采用率表示，组间比较通过2 检验和Fishers 精确概率检验进行。通过受试者工作特征（ROC）曲线评估组织 H19 水平对乳腺癌的诊断效能。在生存分析方面，我们运用 Kaplan-Meier 法，并进行Log-rank 检验。为全面了解影响乳腺癌预后的因素，我们采用单因素及 Cox 比例风险模型分析，其中 P中文科技期刊数据库（全文版）医药卫生-80-0.05 表示差异具有统计学意义。这一系列详尽的分析方法确保了对乳腺癌患者预后的全面评估，为研究结果的科学解释提供了坚实的基础。2 结果 2.1 H19 在乳腺癌组织中的表达 qRT-PCR 结果显示，H19 在 68 例乳腺癌组织及相应癌旁组织的相对表达量分别为 2.005 0.709、1.109 0.387，两者比较差异具有统计学意义（t=9.148,P0.001）。H19 表达诊断乳腺癌 ROC 曲线下面积为 0.850（95%CI:0.7830.917,P0.001），诊断阈值 1.66，约登指数 0.647，特异度和敏感度分别为 94.1%和 70.6%，表明当 H19 相对表达量 1.66 时，乳腺癌发生机会增加。见图 1。2.2 H19 表达与乳腺癌患者临床病理特征的关系 以乳腺癌患者组织中H19相对表达量的均值为界，将患者分为 H19 高表达组（37 例）和 H19 低表达组（31例）。统计分析表明，H19 的表达与淋巴结转移（P=0.001）、组织分化程度（P=0.002）、TNM 分期（P=0.002）及 HER-2 表达状态（P=0.036）有关，但与年龄、肿瘤直径、ER、PR 以及组织学类型无关（P 0.05），见表 1。A:H19 在乳腺癌组织和癌旁组织中的表达情况；B：组织 H19诊断乳腺癌的 ROC 曲线 图 1 乳腺癌组织的 H19 水平及诊断效能 2.3 H19 表达与乳腺癌患者预后的关系 采用 Kaplan-Meier 法评估患者的生存时间，结果表明，与低表达 H19 的患者相比，高表达 H19 患者的无进展生存率明显降低（HR=2.148,95%CI:1.0734.204,P=0.032），总生存率也明显低于低表达 H19 的患者（HR=2.741,95%CI:1.1875.701,P=0.018），见图 2。表 1 H19 表达与乳腺癌患者临床病理参数的关系 例（%）临床病理参数 例数 H19 的表达 2值 P 值 高（n=37）低（n=31）年龄（岁）0.040 0.841 50 36 20（55.6）16（44.4）50 32 17（53.1）15（46.9）肿瘤直径（cm）0.093 0.761 2 25 13（52.0）12（48.0）2 43 24（55.8）19（44.2）淋巴结转移 11.241 0.001 无 23 6（26.1）17（73.9）有 45 31（68.9）14（31.1）TNM 分期 9.530 0.002 III 期 24 7（29.2）17（70.8）III 期 44 30（68.2）14（31.8）ER 表达 1.871 0.171 阴性 28 18（64.3）10（35.7）阳性 40 19（47.5）21（52.5）PR 表达 0.421 0.516 阴性 30 15（50.0）15（50.0）阳性 38 22（57.9）16（42.1）HER-2 表达 4.398 0.036 阴性 46 21（45.7）25（54.3）阳性 22 16（72.7）6（27.3）组织学类型 0.017 0.896 导管癌 56 30（53.6）26（46.4）小叶癌 8 5（62.5）3（37.5）混合型 4 2（50.0）2（50.0）分化程度 9.486 0.002 高+中等分化 26 8（30.8）18（69.2）低分化 42 29（69.0）13（31.0）中文科技期刊数据库（全文版）医药卫生-81-A:无进展生存期；B：总生存期 图 2 乳腺癌患者不同 H19 水平的生存曲线 2.4 乳腺癌预后单因素及多因素分析 经过单因素分析，我们发现 H19 的表达、淋巴结转移、TNM 分期、HER-2 表达以及组织分化程度在影响乳腺癌预后方面是具有显著性的危险因素。而在进行多因素分析时，我们进一步确认了 H19 的表达、淋巴结转移、TNM 分期和 HER-2 表达是独立的、对乳腺癌患者预后产生影响的因素（P0.05）。详细的分析结果可参见表 2。这些结果强调了 H19 在乳腺癌预后中的重要作用，并为深入理解其在疾病发展中的具体机制提供了有益的线索。3 讨论 乳腺癌是一种复杂多因素介导、逐渐发展的疾病，其发病机制尚存在未明了的部分。研究揭示乳腺癌患者常涉及多个肿瘤相关基因的异常表达或失活，因此深入研究乳腺癌的分子机制对改善患者预后至关重要。全基因组测序发现人类基因组中只有不到 2%能编码蛋白质，而 90%以上的基因转录产物是非编码 RNA，其中长链非编码 RNA（lncRNA）长度超过 200 个核苷酸。这些lncRNA在乳腺癌的病理生理过程中发挥着重要作用，尤其值得进一步深入研究。同时，通过对乳腺癌患者进行单因素和多因素分析，我们明确了多个影响患者预后的因素，包括年龄、肿瘤直径、淋巴结转移、TNM分期、ER、PR、HER-2 表达状态、组织分化程度以及H19 的表达水平。这些分析结果为全面评估乳腺癌患者疾病预后提供了有力支持，为制定更加精准的治疗方案提供了积极的指导。在未来的研究中，深入剖析这些潜在的分子机制和预后因素，将有助于更好地理解乳腺癌的发生和发展，并为个体化治疗提供更为有效的依据。目前，lncRNA 被看作是癌症发展的关键因素，肿瘤的发生和恶性进展常与 lncRNA 失调密切相关11-12。因此，靶向 lncRNA 治疗对于抑制癌症进展可能具有重要意义。H19，一种长链非编码 RNA(lncRNA)，定位在染色体 11p15.5。其在多种肿瘤中的分子机制和功能已受到广泛关注。以食管癌为例，研究发现 H19 在癌组织中呈上调表达，通过激活 STAT3/EZH2 轴促使食管癌细胞的增殖和迁移。同时，H19 的高表达水平与食管癌患者的不良预后紧密相关13-14。这些研究成果揭示了H19 在食管癌中的重要作用，为深入理解其在其他肿瘤类型中的功能提供了有益的参考13-14。Li 等15发现 H19在甲状腺癌组织中发挥致癌作用，其机制主要是通过调节 PI3K/AKT 信号通路实现的。Ji 等16指出在卵巢癌组织和细胞中 H19 处于过表达状态，通过吸附 miR-675促进卵巢癌的发展，为卵巢癌的早期发现和预后提供了潜在的生物标志物。上述研究表明 H19 在肿瘤发展中具有促癌作用。但是，有关 H19 在乳腺癌中的表达情况及与患者预后的关系鲜有报道。本课题组详细分析 H19 的表达与乳腺癌患者的临床特征的关系，我们发现H19的高表达与淋巴结转移、组织分化程度、TNM 分期以及 HER2 状态密切相关。这一发现为我们提供了对乳腺癌患者病情的更全面认识，为 制 定 更 个 体 化 的 治 疗 方 案 提 供 了 依 据。Kaplan-Meier 生存分析结果进一步揭示了 H19 高表达患者的无进展生存率和总生存率明显降低的趋势。Cox多因素分析进一步证实了 H19 高表达作为乳腺癌患者独立的预后因素。这些结果不仅加深了我们对 H19 在乳腺癌中的生物学意义的理解，还为预测患者预后提供了新的可靠指标。综合而言，我们的研究结果强烈支持了 H19 在乳腺癌的发生和发展中的关键作用，表明其有望成为乳腺癌早期诊断和预后评估的潜在分子标志物。这为深入挖掘乳腺癌的分子机制以及开发相关治疗策略提供了重要线索，为未来个体化医疗的实现奠定了基础。内分泌治疗在乳腺癌综合治疗中扮演着至关重要的角色17。随着他莫昔芬、托瑞米芬、来曲唑、阿那曲唑等内分泌药物的广泛使用，年长患者和不能耐受手术的激素受体阳性乳腺癌患者的治疗选择显著增加，从而带来更多的生存益处18。然而，我们的研究并未观察到 H19 表达水平与 ER、PR 之间的显著相关性。这可能与我们研究所使用的标本数量较少有关，因此我们计划在后续研究中扩大样本规模以进行更深中文科技期刊数据库（全文版）医药卫生-82-入的分析。其次，有关 H19 在乳腺癌发生发展中的分子机制和生物学功能目前尚不清楚，下一步我们将在不同乳腺癌细胞系中对 H19 的表达情况进行差异性分析，通过干扰 H19 的表达量，观察相应乳腺癌细胞增殖、侵袭及迁移能力的变化。综上，H19 在乳腺癌组织中高表达，在诊断乳腺癌及评估预后方面具有重要作用，有望成为治疗乳腺癌的新靶点。参考文献 1Siegel RL,Miller KD,Jemal A.Cancer statistics,2020J.CA Cancer J Clin,2020,70(1):7-30.2Liu S,Li J,Kang L,et al.Degradation of long non-coding RNA-CIR decelerates proliferation,invasion and migration,but promotes apoptosis of osteosarcoma cellsJ.Cancer Cell Int,2019,19(1):1-15.3Zhu Y,Yang Z,Luo X H,et al.Long noncoding RNA TTN-AS1 promotes the proliferation and migration of prostate cancer by inhibiting miR-1271 level J.Eur Rev Med Pharmacol Sci,2019,23(24):10678-10684.4Sha M,Lin M,Wang J,et al.Long non-coding RNA MIAT promotes gastric cancer growth and metastasis through regulation of miR-141/DDX5 pathway J.J Exp Clin Cancer Res,2018,37(1):58.5Brannan CI,Dees EC,Ingram RS,et al.The product of the H19 gene may function as an RNA J.Mol Cell Biol,1990,10(1):28-36.6Zhu Z,Xu L,Wan Y,et al.Inhibition of E-cadherin expression by lnc-RNA H19 to facilitate bladder cancer metastasis J.Cancer Biomark,2018,22(2):275-281.7Gao LM,Xu SF,Zheng Y,et al.Long non-coding RNA H19 is responsible for the progression of lung adenocarcinoma by mediating methylation-dependent repression of CDH1 promoter J.J Cell Mol Med,2019,23(9):6411-6428.8Fu W,Wu X,Yang Z,et al.The effect of miR-124-3p on cell proliferation and apoptosis in bladder cancer by targeting EDNRB J.Arch Med Sci,2019,15(5):1154-1162.9刘静,钟玲,陈庆秋,等.乳腺癌发生过程中 ER、PR、HER-2 及 WT1 蛋白表达变化的研究J.临床肿瘤学杂志,2019,24(8):722-726.10 Dong Y,Xiao Y,Shi Q,et al.Dysregulated lncRNA-miRNA-mRNA network reveals patient survival-associated modules and RNA binding proteins in invasive breast carcinoma J.Front Genet,2020(10):1284.11 莫 智 媛,娄 俊.宫 颈 癌 组 织 中 长 链 非 编 码 RNA LINC00460 的 表 达 及 其 临 床 意 义 J.广 西 医学,2020,42(13):1654-1656.12Wu H,Yu DH,Wu MH,et al.Long non coding RNA LOC541471:A novel prognostic biomarker for head and neck squamous cell carcinoma J.Oncol Lett,2019,17(2):2457-2464.13Chen MJ,Deng J,Chen C,et al.LncRNA H19 promotes epithelial mesenchymal transition and metastasis of esophageal cancer via STAT3/EZH2 axis J.Int J Biochem Cell Biol,2019(113):27-36.14Li X,Yang H,Wang J,et al.High level of lncRNA H19 expression is associated with shorter survival in esophageal squamous cell cancer patients J.Pathol Res Pract,2019,215(11):152638.15Li X,Li Q,Jin X,et al.Long non coding RNA H19 kNockdown inhibits the cell viability and promotes apoptosis of thyroid cancer cells through regulating the PI3K/AKT pathway J.Exp Ther Med,2019,18(3):1863-1869.16 Ji F,Chen B,Du R,et al.Long non-coding RNA H19 promotes tumorigenesis of ovarian cancer by sponging miR-675 J.Int J Clin Exp Pathol,2019,12(1):113.17Keim MJ,Doede A,Showalter SL.Does patient health literacy impact adherence to adjuvant endocrine 中文科技期刊数据库（全文版）医药卫生-83-therapy in breast cancer patients?J.Patient Prefer Adherence,2018(13):47-51.18Choi J,Park CS,Seong MK,et al.Predicting the benefit of adjuvant aromatase inhibitor therapy in postmenopausal breast cancer patients with phosphorylated S6K1 expression status J.J Breast Cancer,2020,23(1):10-19.基金项目：自筹经费科研课题（Z20211113）。