平谷区马坊镇番茄病毒病的病原鉴定.pdf

北京农学院学报2 0 2 4，39（2）：15-2 0Journal of Beijing University of Agriculturehttp:/doi:10.13473/ki.issn.1002-3186.2024.0203平谷区马坊镇番茄病毒病的病原鉴定孙春辉，刘丽，鲁书豪，梁宇卿，王昀轩，崔雯莉，高佳仪，李永强*（北京农学院生物与资源环境学院/农业农村部华北都市农业重点实验室，北京，10 2 2 0 6）摘要：【目的】为了给平谷区马坊镇设施番茄病毒病防治提供依据。【方法】2 0 2 2 年10 月在河北村、果各庄、早立庄、梨羊村、小屯村番茄种植区采集到表现有黄化、蕨叶、褪绿等疑似病毒病症状的番茄叶片，利用小RNA深度测序技术对混合叶片进行病毒筛查，并利用PCR/RT-PCR验证。【结果】侵染当地番茄的病毒种类有黄瓜花叶病毒（cucumber mosaic virus）、南方番茄病毒（southern tomato virus）、番茄褪绿病毒（tomatochlorosis virus，T o CV）和番茄黄化曲叶病毒（tomato yellowleaf curl virus，T Y L CV），在12 份样品中的病毒检出率依次为58.3%、16.7%、16.7%、10 0%，两种及以上病毒复合侵染率为58.3%，并通过对5个TYLCV进行全序列扩增及构建系统发育树，表明其均与TYLCV北京分离物的亲缘关系最近。【结论】病毒病在马坊镇普遍发生且危害较为严重，检测结果表明，TYLCV是侵染当地番茄的主要病毒，且复合侵染现象严重。关键词：设施；番茄；病毒病；病原鉴定；小RNA深度测序中图分类号：S432.1文章编号：10 0 2-318 6（2 0 2 4)0 2-0 0 15-0 6 文献标志码：APathogen(s)identification of tomato viral disease inMafang Town,Pinggu DistrictSUN Chunhui,LIU Li,LU Shuhao,LIANG Yuqing,WANG Yunxuan,CUN Wenli,GAO Jiayi,LI Yongqiang(College of Bioscience and Resource Environment/Key Laboratory of Urban Agriculture(North China),Ministry of Agriculture and Rural Affairs,Beijing University of Agriculture,Beijing 102206,China)Abstract:ObjectiveJTo clarify the pathogen of tomato viral disease in Mafang Town,Pinggu District,and provide a basis forthe prevention and control of tomato virus disease in this area.MethodsJIn October 2022,tomato leaves from Hebei Village,Guogezhuang Village,Zaolizhuang Village,Liyang Village,and Xiaotun Village showing symptoms of viral diseases includingyellowing,fern leaves and chlorosis were collected and screened of potential viruses by small RNA deep sequencing,and the i-dentified viruses were further verified by PCR/RT-PCR.ResultsJThe main virus species infecting tomato plants were cucum-ber mosaic yirus(CMV),southern tomato virus(STV),tomato chlorosis virus(ToCV)and tomato yellow leaf curl virus(TYLCV).The detection rates of the corresponding virus in the 12 samples were 58.3%,16.7%,16.7%,and 100%,and themixed infection rate of two or more viruses was 58.3%,by performing full-genome amplification and constructing phylogenetictrees of 5 TYLCV,it was indicated that all of them are most closely related to the TYLCV isolates from Beijing.ConclusionThe viral disease was widespread and severe in Mafang town,and the test results indicated that TYLCV was the main virus in-festing local tomatoes,and mixed infection is common.Keywords:facility;tomato;virus disease;pathogen identification;small RNA deep sequencing近年来，随着安全饮食观念的不断深人，蔬菜产业在世界范围内得到了迅猛的发展，其种植区域不断扩大，带来巨大的经济效益 1。番茄（Solanumlycopersicum）营养价值高，广受欢迎，是全球蔬菜作物中产量最高的种类 2 。中国的番茄产业生产规模宏大，其产量居各国之首，在市场进出口作物中收稿日期：2 0 2 4-0 1-2 2基金项目：北京市农业农村局乡村振兴项目（2 0 2 2 0 2 0 4-0 3）第一作者：孙春辉，硕士研究生，主要从事植物保护研究，E-mail：Su n 1319936 8 2 0 16 3.c o m，刘丽为共同第一作者通信作者：李永强，博士，副教授，主要从事植物病毒学研究，E-mail：l y q b u a.e d u.c n16占有重要份额。但番茄的生产面临着一重大难题，番茄病毒病发生频繁，难以防控，严重影响番茄的产量和品质，如何有效应对病毒病的发生和发展，是当前番茄产业进一步发展中呕待解决的问题。根据最新报道，国内在番茄中鉴定到的病毒已更新为44种 3。在北京地区，报道的番茄毒原种类主要有番茄花叶病毒（tomato mosaic virus，ToMV）、黄瓜花叶病毒（cucumber mosaic virus，CMV）、马铃薯X病毒（potato virus X,PVX）、马铃薯Y病毒（potato virus Y,PVY）、烟草蚀纹病毒（t o b a c c o e t c h v ir u s，T EV）、首花叶病毒（alfalfamosaicvirus，A M V）、番茄褪绿病毒（tomatochlorosis virus，T o CV）、番茄黄化曲叶病毒（tomatoyellow leaf curl virus,TYLCV)、番茄斑萎病毒（to-mato spotted wilt virus,TSWV)4-7等。同时番茄病毒病在田间的症状表型特别复杂，不同生长周期表现出不同症状，且复合侵染现象严重，对番茄生产造成严重威胁。TYLCV是世界番茄种植区普通存在的一种植物病毒，在已被报道的番茄病毒中危害最大，其寄主除了番茄外，还包括辣椒、菜豆、棉花、拟南芥和烟草等30 多种植物 8 ，主要通过烟粉虱进行传播，不能通过机械摩擦传播。TYLCV在番茄的苗期就可引起发病，通常症状表现为顶部叶片黄化，出现黄绿斑，叶片变小，叶缘向内卷曲，严重时植株矮化，生长停止，不能正常开花结果，对番茄生产造成毁灭性打击。2 0 世纪中期，以色列首次报道了番茄黄化曲叶病毒病，7 0 年代末，引起该病的病原被正式命名为TYLCVE9。2 0 0 6 年，TYLCV在中国上海首次报道 10 1。最近几年，TYLCV已扩散到中国各省市的番茄种植区，每年造成的经济损失高达数十亿元，对番茄产业的发展造成了严重影响。近年来，小RNA深度测序技术在农业病害监测尤其是病毒病原鉴定领域得到广泛应用 1-13。小RNA深度测序技术检测病毒是基于RNA沉默原理的一种检测技术，病毒侵染后会将自身的基因组释放到植物体内，同时会触发植物的抗病毒防御机制,即RNA干扰,通过RNA干扰的方式，植物细胞内形成大量的病毒衍生小干扰RNA（V ir u s-derived small interfering RNAs,vsi RNA),获得这些小RNA序列，再通过生物信息学相关软件分析，将测序数据拼接，就可以获取植物中病毒的序列信息。该研究调查了北京市平谷区马坊镇番茄病毒病的发生情况，并利用小RNA深度测序技术检测北京农学院学报了侵染当地番茄的病毒种类，扩增了5个TYLCV基因组全序列，并对其进行了序列分析和系统发育分析,为当地番茄病毒病的预防和综合防治奠定基础。1材料与方法1.1番茄病毒病样品采集2020年在北京市平谷区马坊镇的河北村、果各庄、早立庄、梨羊村、小屯村的番茄大棚中采集到疑似病毒病的番茄叶片，液氮快速冷冻后放人一8 0 超低温冰箱中保存，以备后续使用。1.2小RNA深度测序的番茄叶片样品处理用植物RNA快速提取试剂盒（Takara）提取番茄叶片样品总RNA，用Nanodrop200o检测RNA样品的质量和浓度，用琼脂糖凝胶电泳和Agilent2100oBioanalyzer检测RNA样品的完整性，当测定质量浓度2 50 ng/L，体积10 L，OD260/2801.8,OD260/2301.0,RIN值7.0 时，样品检测合格。样品检测合格后委托华大基因公司，进行小RNA分离、建库和测序工作。将在河北村采集的KALF-HM、K A L F-X、K A L F-、K A L F-HJ、K A L F-JY 叶片等量混合，命名为KALF；在小屯村采集的YSF-JY、Y SF-T L 叶片等量混合，命名为YSF；将梨羊村采集的LY、早立庄村采集的ZLZ和果各庄村采集的 GGZ-JY、G G Z-H S、G G Z-HJ叶片等量混合，命名为GGZ,分别进行测序。1.3小RNA深度测序数据处理利用Perl语言脚本将小RNA深度测序原始数据中的低质量数据剔除，去除接头序列，得到有效序列（Clean reads），将有效序列通过Bowtie 2软件剔除基因组序列后，与未比对到的小RNA通过vlvet软件进行拼接，获得多个contigs，拼接所得的contigs 通过 NCBI 网站的病毒核酸数据库和蛋白质数据库进行BLAST比对,并对其分类注释。1.4 PCR/RT-PCR法验证根据小RNA测序结果及已有报道，设计候选病毒的特异性引物对其进行验证，引物信息见表1，DNA病毒TYLCV通过PCR方式验证，其余病毒通过RT-PCR方式验证。分别按照植物基因组DNA提取试剂盒（Takara）和植物总RNA提取试剂盒（Takara)的说明书提取病样叶片的总DNA、总RNA。以提取的2 L总RNA为模板，引物Oligo(dT)和Random各添加0.5L,dNTPMixture添加1.0 L,随后用DEPC处理过的水将反应体系体第39卷2024年第2 期积补充至18.5L，将上述反应体系在6 5水浴中孵育5min；向反应体系中添加5XM-MLV逆转录反应缓冲液5L,M-MLV反转录酶1L和RRI抑制剂0.5L，42，1h；7 0，15m i n，合成cDNA（试剂均采购于Takara）。表1用于检测病毒的引物Tab.1Primer usedfor detecting viruses引物PrimersTYLCVFTYLCVRCMVFCMVRSTVFSTVRToCVFToCVR以合成的cDNA和提取的DNA为模板进行PCR扩增。PCR扩增总体系为2 5.0 L，包括上、下游引物各1.0 L，2 T a q 预混液12.5L，d dH,O8.5L,cDNA2.0L;扩增程序为:9 4预变性5min；94变性30 s；52 6 0 退火30 s；7 2延伸1min，进行35个循环；7 2 补平10 min。扩增结束后，通过琼脂糖凝聚电泳观察片段大小，并将片段进行回收纯化后，克隆至pMD19-T载体(Takara)中,通过热激法将重组载体转化至大肠杆菌DH5感受态，之后通过菌落PCR鉴定阳性克隆。将阳性克隆送至生工生物工程（上海)技术服务有限公司测序。1.5序列拼接将对阳性克隆测序，获得的病毒序列利用DNAMAN软件进行序列拼接，拼接结果与NCBI中的BLAST进行同源比对分析，并下载相关序列数据。1.6TYLCV全基因组序列扩增根据小RNA深度测序结果，通过vlvet软件拼接得到五条不同的TYLCV序列。分两段对TYLCV全基因组序列进行扩增，所设计的2 对引物信息见表2。感病植株DNA的提取、扩增、回收、连接、及转化参考1.4进行。1.7序列分析和系统发育分析利用DNAMAN软件对扩增获得的TYLCV的序列进行组装。根据NCBI中“ORFFinder”鉴定TYLCV基因组上每个ORF的具体位置，并通过NCBI网站对拼接得到的这五条TLYLCV全长孙春辉等：平谷区马坊镇番茄病毒病的病原鉴定sequence of TYLCV引物PrimersTYLCVF1TYLCVR1引物序列(5-3)TYLCVF2Sequence(5-3)TYLCVR2CGGGATCCACTTCTAAATGCGGGATCCCACATATTGCAAGTGCTAGAAGTACACGGACCGAAGTGATCTCACAAGCAGAATCGACGGGGCCTCATTGATAAGACTATTACGCCATCTCAAGCACAGATACATCGACGATAGGTGTTTGGAGTCATGGGAGTGTACCTTCAATTTCCTTAACTCGT17序列进行核苷酸一致性分析。表2 TYLCV全长序列扩增所需引物Tab.21Primers required for amplification of the full-lengthACCGGATGGCCGCGCCTTTTTCAAGCAGAGAATGGCGTTTTTAATAGAGGGGAGTGTTTATCTCCCAATATTATACGGATGGCCGCTTT利用MEGA7.0软件，采用最大似然法，根据TYLCV的全序列构建系统发育树，可信度设置为1000次重复，分析其亲缘关系。2结果与分析2.1番茄病毒病样本的检测2.1.1样品RNA质量检测所提取RNA的质量结果如图1、表3所示，其RNA的2 8 s：18 s 均大于1.5，浓度均大于50 0 ng/L,RIN值均大于7。M2.000bp1 000 bp750bp500bp样品SampleGGZKALFYSF2.1.2番茄发病情况在平谷区马坊镇的河北村、果各庄、早立庄、梨羊村、小屯村的番茄大棚中采集的疑似病毒病叶片的症状包括黄化、卷叶、蕨叶、矮化、显脉和褪绿等，一部分叶片表现其中的一种症状类型，而大部分叶片则表现出复合症状。2.1.3深度测序结果分析通过小RNA深度测序技术，进行数据处理后对得到的contings序列在NCBI上进行BLAST比对，检测出番茄叶片上带有CMV、ST V、T o C V 以及 TYLCV 四种病毒序列。引物序列（5-3)Sequence(5-3)12图1样品RNA电泳Fig,1Sample RNA electrophoresis表3样品RNA质量检测Tab.3Sample RNA quality testingRNA质量浓度RNA concentration/(ng/L)149714965563rRNARatio RNAintegrity28 s/18 s2.21.92.1number8.18.28.518北京农学院学报第39卷表4Contigs结果Tab.4Contigs resultsContig数序号No.12342.2PCR/RT-PCR 检测根据文中设计的病毒特异性引物，以提取的番茄叶片DNA和反转录的cDNA为模板，经PCR/RT-PCR扩增、琼脂糖凝胶电泳检测,明确样品中确有测序结果中预测的 TYLCV、C M V、ST V、T o C V这四种病毒（图2），其中梨羊村的样品中检测到有M 123456789101112CK750bpTYLCV598P2506M 1 2 345 6750bpCMV500250M1234 5678 9 10 11 12 CKToCV750bp500bP2506M 1 2 3 4 5 6750bpSTV500bp250注：M.DL2000DNAMarker;1-12.样品；CK.阴性对照图2 疑似感染番茄病毒的番茄样品PCR/RT-PCR检测结果Note:M.DL 200o DNA Marker;1-12.sample;CK.negative controlFig.2PCR/RT-PCR test results of tomato samples sus-pected to be infected with tomato virusesAV1AV2AC1AC2AC3AC42.3.3病毒分离物相似性比对在NCBI网站上对拼接出的病毒全序列进行比对,发现 TYLCV-K2与分离物 TYLCV-SG1(GenBank登录号:MT969010.1)相似度最高，为96.48%,TYLCV-K3与分离物TYL-CV-YN4398clone 32(GenBank登录号:MN503087.1)病毒名称Nameofviruscucumber mosaic virus,CMVsouthern tomato virus,STVtomato yellow leaf curl virus,TYLCVtomato chlorosis virus,TovTYLCV-K22791055nt119469 nt1.5122.586 nt12251630nt10521455nt2 1782.458 ntGGZ322未检测到CMV、ST V 和TYLCV,果各庄和早立庄的样品中检测到有CMV和TYLCV，河北村的样品中只检测到了TYLCV,而小屯村的样品中检测到CMV、STV、T o C V 和TYLCV这4种病毒。由此表明小RNA测序结果具有可靠性。在12 份的样品中，4种病毒的检出率依次为58.3%、16.7%、16.7%、100%，2 种及以上病毒复合侵染率为58.3%。2.3番茄黄化曲叶病毒基因组全序列扩增2.3.1分段扩增番茄黄化曲叶病毒利用引物78 9 10 11 12 CK78 9 10 11 12 CK表55个TYLCV分离物的开放阅读框信息Tab.5Open reading frame information of five TYLCV isolatesTYLCV-K33081.090nt148503nt1 5492618 nt11971603 nt10871492nt2 1532 435 ntKALF未检测到未检测到3未检测到TYLCV1-F/R、T Y L C V 2-F/R对番茄病叶进行基因组扩增，分别获得大小约为150 0 bp的电泳条带。条带大小符合预期，且没有在健康植株中检测到条带。2.3.2病毒基因组结构分析拼接得到的五条TYLCV分离物的全长序列，命名为TYLCV-K2、TYLCV-K3,TYLCV-K4,TYLCV-Y1 和 TYLCV-Y2,其全长分别为2 7 0 2 bp、2 7 7 7 b p、2 7 7 7 b p、2 749 bp 和 2 7 50 bp。进一步分析5个分离物的分子特征发现，5个分离物与已报道的TYLCV具有相同的结构特征，基因组均为单链闭合环状DNA,编码6 个开放阅读框(open reading frame,ORF)141,其中病毒链和互补链的编码框信息如表5所示。TYLCV-K4TYLCV-Y13081088nt3081084nt148501 nt148498nt1.5412.616 nt1 541 2 607 nt12321640 nt12301632nt1.0851 484 nt1 0811 484 nt2 1852 467 nt2 183 2 465 nt相似度最高，为97.2 0%，TYLCV-K4与分离物TYLCV-BJTZ（M F59 0 7 33.1）相似度最高，为98.20%,TYLCV-Y1与分离物TYLCV-SG1相似度最高，为91.0 8%，TYLCV-Y2与分离物TYLCV-SG1相似度最高，为96.48%，拼接序列与YSF3124TYLCV-Y23061 083 nt146496nt1 5392.608 nt12261632nt10801 482 nt2 179 2 466 nt2024年第2 期其他分离物的核苷酸相似性比对见表6。Tab.6The similarity of the splicing sequence was compared with other TYLCV isolates分离物名称Isolate nameTYLCV-SG1TYLCV-BJTZTYLCV-YN4398clone32TYLCV-JSSQ-SYTYLCV-DL-1TYLCV-YL-2TYLCV-YL-4TYLCV-YL-5TYLCV-YL-6TYLCV-YL-11TYLCV-JY-4TYLCV-JY-62.3.55系统进化树分析将得到的病毒序列全长在NCBI网站上进行Blast比对,并基于比对结果与当前已经报道过的TYLCV的不同分离物，通过构建系统发育树，并以同科不同属的Ecomismicro-phyllaassociatedvirus做为外源病毒作为对照，进行分析。如图3，拼接得到的番茄黄化曲叶病毒TYLCV-K2、T Y L C V-Y 1 和 TYLCV-Y2 与中国北京番茄分离物TYLCV-SG1共聚与同一个分支上，TYLCV-K369TYLCV-K497-MF590733.1 Tomato yellow leaf curl virus isolate BJTZ complete genome12-MN503087.1 Tomato yellow leaf curl virus isolate YN4398 clone 32 complete genome75-MF590739.1 Tomato yellow leaf curl virus isolate JSSO-SY complete genome6ON093153.1 Tomato yellow leaf curl virus isolate YL-11 complete genomeON093139.1 Tomato yellow leaf curl virus isolate DL-1 complete genome-ON093149.1 Tomato yellow leaf curl virus isolate YL-4 complete genome411019219941989999图3番茄病毒TYLCV全序列系统进化树分析Fig.3 Phylogenetic tree analysis of tomato virus TYLCV whole sequence3结论与讨论该研究利用小RNA深度测序技术对采自平谷区马坊镇河北村、果各庄、早立庄、梨羊村、小屯村孙春辉等：平谷区马坊镇番茄病毒病的病原鉴定表6 拼接序列与TYLCV其他分离物相似性比对登录号TYLCV-K2GenBank accession No.MT969010.1MF590733.1MN503087.1MF590739.1ON093139.1ON093148.1ON093149.1ON093150.1ON093151.1ON093153.1ON093145.1ON093146.19919%TYLCV-K3TYLCV-K496.4889.9488.7397.2088.8497.1388.6196.9288.9096.4989.4696.5989.4996.5589.5396.5189.2496.5189.4996.5189.4996.4889.3596.41亲缘关系最近，TYLCV-K3和TYLCV-K4与中国北京番茄分离物TYLCV-BJTZ共聚与同一个分支上，亲缘关系最近，都与同属的中国云南番茄分离物TYLCV-YN4398clone32、中国江苏番茄分离物TYLCV-JSSQ-SY、中国陕西番茄分离物TYLCV-YL-2等10 个分离物聚在不同的分支上，亲缘关系较远。ON093146.1 Tomato yellow leaf curl virus isolate JY-6 complete genome-ON09315.1.1 Tomato yellow leaf curl virus isolate YL-6 complete genomeON093148.1 Tomato yellow leaf curl virus isolate YL-2 complete genome-ON093150.1 Tomato yellow leaf curl virus isolate YL-5 complete genomeON093145.1 Tomato yellow leaf curl virus isolate JY-4 complete genomeTYLCV-K2-MT969010.1 Tomato yellow leaf curl virus isolate SG1 complete genomeTYLCV-Y1TYLCVY2-MG001960.1 Exomis microphylla associated virus isolate 2-90-C1 complete genomeTYLCV-Y190.5591.0898.2086.3698.1086.2298.0386.1497.5686.2497.6686.7997.6686.7997.6386.7697.3886.6597.6686.7697.5986.8397.5286.65五个设施番茄基地的12 份疑似病毒病的混合叶片样品进行了毒原检测，共检测到CMV、ST V、T o M V和TYLCV4种病毒，对每份样品进行PCR/RT-PCR验证，发现每份番茄样品中都检测到有病毒侵TYLCV-Y296.4889.5989.6089.5089.54.90.1890.1490.1089.8990.1090.1890.0020染,其中检出最多的为 TYLCV,其检出率为10 0%，并且发现多数样品中存在2 4种病毒的复合侵染，复合侵染率达58.3%。综合到地区来看，梨羊村、果各庄和早立庄地区的样品在共检测到CMV、STV、T Y L C V 三种病毒，TYLCV和CMV 两种病毒的复合侵染严重；河北村的样品中只检测到TYLCV一种病毒；而小屯村中的样品中检测到CMV、ST V、T o C V 和 TYLCV 四种病毒,存在3种病毒甚至4种病毒的复合侵染。由此可认为，平谷区马坊镇番茄病毒病的毒原有 CMV、ST V、T o C V和TYLCV4种,其中TYLCV为优势种，病毒病发生较为普遍，病毒复合侵染严重。同时对各地区检测到的TYLCV序列拼接后得到5个TYLCV序列,对其进行了全基因组扩增，并分析各基因序列的分子特征及核苷酸相似性，证实5个TYLCV分离物的全基因序列分别为2 7 0 2 bp（T Y L C V-K 2）、2777 bp(TYLCV-K3)、2 7 7 7 b p(T Y L C V-K 4)、2 749 bp(TYLCV-Y1)和 2 7 50 bp(TYLCV-Y2),确认这5个病毒分离物是TYLCV分离物；并通过系统进化分析发现，TYLCV-K2、T Y L C V-Y 1 和TYLCV-Y2与中国北京番茄分离物TYLCV-SG1亲缘关系最近，TYLCV-K3和TYLCV-K4与中国北京番茄分离物TYLCV-BJTZ亲缘关系最近，由此可见,北京地区的番茄中TYLCV发生普遍，类型复杂，其防治工作面临严峻挑战。结合对当地番茄病虫害的调查分析，认为烟粉虱的迁、种苗来源不稳等可能是病毒迁人的主要途径。据此研究，为明确平谷区马坊镇番茄病毒病的发生情况提供了理论依据，为番茄病毒病的防控和抗病毒育种奠定了基础。北京农学院学报参考文献：1刘钦.乡村振兴战略背景下我国蔬菜产业发展分析 J.北方园艺,2 0 2 0(4)142-147.2 丁李君明，项朝阳，王孝宣，等.“十三五”我国番茄产业现状及展望 J.中国蔬菜，2 0 2 12）：13-2 0.3严婉荣，王宝，吉训聪，等。番茄病毒病种类及主要鉴定方法研究进展 J/OL.分子植物育种，1-13 2 0 2 4-0 4-0 9.http：/ J.中国蔬菜，19 9 1（5）：9-11.5J ZHAO R N,WANG R,WANG N,et al.First report oftomato chlorosis virus in ChinaJJ.Plant Disease,2013,97(8):1123-1123.6 李明远.黄化曲叶病毒病传人北京，番茄生产面临威胁J.植物保护，2 0 0 9,35（6）：17 9-18 0.7 李明远，陈东亮，李雪梅，等李明远断病手迹（八十六）北京蔬菜上的几种番茄斑萎病毒 J.农业工程技术，2 0 18,38（7）：59-61.8 张前荣，李大忠，朱海生，等.番茄黄化曲叶病毒研究进展J。分子植物育种，2 0 17，15（9）：37 0 9-37 16.9李明远.试说北京番茄病毒病40 年的变迁以番茄黄化曲叶病毒为主的时期 J.蔬菜，2 0 2 1(7）：8 1-8 4.10WU J B,DAI F M,ZHOU X P.First report of tomato yellowleaf curl virus in ChinaJ.Plant Disease,2006,90(10):1359-1359.11苏秀.小RNA深度测序在几种木本植物病毒鉴定中的应用D.杭州：浙江大学,2 0 15.12于云奇.小RNA深度测序在柑橘新发病毒的鉴定及TuMV诱导的抗病毒新机制中的研究 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