密度梯度离心法分离PBMC操作流程.doc

密度梯度离心法分离PBMC
1。　在15mL离心管中加入5mL淋巴细胞分离液Ficoll。
2.　取5mL抗凝静脉血与5mL无菌PBS按照1：1充分混匀，用移液管沿管壁缓慢叠加于分层液面上,动作一定要轻，注意保持清楚的界面。外周血，PBS，淋巴细胞分离液最终体积比为1:1:1。
3。水平离心400g×30分钟。(注意:为保证分离效果，需将离心机升降速率调至最低,即升速为1，降速为0，这样调整后,升降速会比较慢，总体离心时间约为1小时。)
4。　离心后可看见管内分为三层,上层为血浆和PBS,下层主要为红细胞和粒细胞，中层为淋巴细胞分离液。在上、中层界面处有一以单个核细胞为主的白色云雾层狭窄带（如下图），单个核细胞包括淋巴细胞和单核细胞。此外,还含有血小板.
淋巴细胞分离液
单个核细胞
血浆和PBS
红细胞和粒细胞

5。去除部分上层液体(用移液管吸取，不可倾倒），余下约1mL，用移液器插到云雾层，吸取单个核细胞.置入另一15mL离心管中,加入5倍以上体积的PBS,离心300g×10分钟，洗涤细胞两次。
6。　末次离心后，弃上清，加入红细胞裂解液，室温孵育2分钟，裂解红细胞,可根据情况适量增减时间.
7.加入10mL PBS，离心300g×10分钟，洗涤细胞两次.
8.末次离心后，弃上清，加入含有10％FBS的RPMI1640,重悬细胞,计数，计算细胞活力。
用本法分离PBMC,每1mL全血可分离得到1～2×106PBMC,不同人个体之间存在一定差异.活细胞百分率在95%以上。
注意：
1. 所有操作都应在无菌条件下进行。
2. 在分离前Ficoll和PBS等试剂均需在37℃恒温水浴中预热半小时以上。
3. 吸取单个核细胞时不可避免会吸到Ficoll，而Ficoll密度比细胞要大，因此步骤5中需加入足量PBS稀释，若PBS体积太小可能会导致细胞无法离心收集。