中药提取分离和纯化-.ppt

第二章中药化学成分的提取分离与鉴定主要内容l第一节 中药化学成分的提取方法l第二节 中药化学成分的分离方法l第三节 中药化学成分结构研究简介第一节 中药化学成分的提取方法l 提取前的准备工作：基源、产地、药用部位、采集时间与方法的考察及文献调研；l 提取前的预处理：粉碎、脱脂、酶的灭活；l 提取方法：溶剂提取法、水蒸汽蒸馏法及升华一、溶剂提取法l （一）基本原理l （二）溶剂的选择l （三）溶剂提取的方法（一）溶剂提取法的原理l 渗透l 扩散（二）溶剂的选择l溶剂提取法的关键是选择合适的溶剂，一种好的溶剂应对所提取的成分有较大的溶解度，而对共存杂质的溶解度很小。良好溶剂的选择应遵循“相似相溶”原理。l 一般说来，只要溶剂的极性与化学成分的极性相似，化学成分就易被溶解。l溶剂的极性与介电常数有关，溶剂的 值越大，极性越大。一些常用溶剂大家有疑问的，可以询问和交流大家有疑问的，可以询问和交流可以互相讨论下，但要小声点可以互相讨论下，但要小声点可以互相讨论下，但要小声点可以互相讨论下，但要小声点一些常见溶剂的亲水性或亲脂性的强弱顺序溶剂分类按照极性大小和溶解性能l l 1、水l 2、亲水性有机溶剂l 3、亲脂性有机溶剂1、水l 强极性溶剂，对药材细胞穿透力大，中药中亲水性成分，如无机盐、有机酸盐、生物碱盐、糖类、苷类、鞣质、氨基酸、蛋白质等都能被水提出。l 水作为提取溶剂有安全、经济、廉价易得等优点，缺点是水提取液（有其是含糖或蛋白质）易霉变，难以保存，而且不易浓缩和过滤。l (2)亲水性有机溶剂l 包括甲醇、乙醇和丙酮；l 这类有机溶剂具有较大的极性，与水可任意混溶；l 乙醇对中药材的细胞不仅有较强的穿透力，而且对许多成分的溶解性能好，价廉，回收方便，因此是提取中药成分最常用的溶剂。(3)亲脂性有机溶剂l 包括石油醚、苯、乙醚、氯仿、乙酸乙酯等。这是一类与水不能任意混溶的有机溶剂，对非极性成分溶解的选择性较强。天然药物中的挥发油、油脂、叶绿素、树脂、游离生物碱及一些苷元均可被这类溶剂提出。l 这类溶剂沸点低、浓缩回收方便，但易燃、有毒、价高，对设备要求高，穿透药材组织的能力较差，故应用这类提取溶剂有一定的局限性。2.提取方法l ()浸渍法l()渗漉法l()煎煮法l()回流提取法l()连续回流提取法l()超声提取法（）浸渍法 l 又称冷浸法，适用于遇热易破坏成分以及含大量淀粉、树胶、果胶、黏液质等多糖成分的药材，多用水、乙醇作溶剂。l 但本法提取时间长，效率不高，特别是在用水作溶剂浸渍时，提取液易发霉变质，必要时可加适量防腐剂。(2)渗漉法 l 该法适用于以水、稀醇为溶剂。用低沸点易挥发的溶剂提取，不宜用此法。因在室温下进行，故特别适用于遇热易破坏成分的提取。本法在渗滤过程 中，不断加人新溶剂，与渗滤液一直保持相当的浓度差，故提取效率比浸渍法高。但存在溶剂用量大、费时较长的缺点。(3)煎煮法l 本法属热浸渍法，提取效率比冷浸法高。但含挥发性成分及遇热不稳定成分的提取不宜用此法。含多糖类成分药材煎煮后，药液黏稠，过滤较困 难。此法仅适用于水作溶剂的提取（）回流提取法l 本法适用于有机溶剂的提取，提取效率与煎煮法相同。l 对热不稳成分的提取不宜用此法 (5)连续回流提取法索氏提取法 l 应用挥发性有机溶剂提取天然药物中的有效成分较多采用该法。本法仅需少量溶剂就能使有效成分提取完全，提取效率高。但提取液受热时间长，一般需410小时。(6)超声提取法l利用超声波强烈振动能传递巨大能量给浸提药材和溶剂，从而破坏植物药材的细胞，加强胞内物质的释放、扩散和溶解，加速有效成分的浸出。该方法具有提取时间短、提取效率高、无须加热等优点，但此法对容器壁的厚薄及放置要求较高。目前尚为实验室小规模使用。3、影响溶剂提取效率的因素l （1）药材粉碎度；l （2）湿度；（3）浓度差；（4）时间；l （5）溶剂；其中选择适当的溶剂是提取的关键，溶剂的选择主要从溶解度方面考虑，同时要注意到溶剂易回收、安全低毒、价廉等因素。增溶与助溶 l 由于在中药的提取液中，存在着复杂的混合物，各成分的相互影响，有时会产生增溶现象，增大了欲提取成分的溶解度。但有时又可能相互生成难溶性化合物，改变了欲提取成分的溶解性能而提取不出。增溶助溶现象举例l（1）已知含生物碱的中药与甘草配伍，生物碱与甘草酸产生沉淀，生物碱可能提取不出来。l（2）黄连等中的小檗碱与黄芩苷产生沉淀，生物碱与银花中的绿原酸发生沉淀，大黄鞣质与栀子、茵陈之间也有沉淀产生。（3）有的成分因其他成分的存在，溶解度有较大的改变，如油脂类杂质的存在可以使不溶于石油醚的香豆素溶解，含麻黄的方剂中如有葛根则麻黄碱的含量增加等等。增溶助溶现象的原因l （1）中药中含有某些能表面活性物质，如皂苷、树胶、蛋白质等。l （2）中药汤剂属于胶体溶液，由许多难溶物质的分子组成的微粒混悬于介质中成为溶胶或粗分散体系，也是使物质在溶液中含量增加的一个重要因素。(二)水蒸气蒸馏法l 水蒸气蒸馏法适用于能随水蒸气馏出而不被破坏的天然药物成分的提取。中草药中的挥发油、某些小分子生物碱、小分子酚性物质等都可采用本法提取。(三)升华法l 有些固体物质在低于其熔点的温度下加热，不经过中间液体阶段，直接转化为蒸气，蒸气遇冷又凝结为原来的固体，这种现象称为升华。天然药物中具有升华性的成分如咖啡碱、樟脑等，其提取可用升华法。二、有效成分的分离和精制l 用各种方法得到的提取物是包含诸多成分的混合物，要想得到所需成分或单体化合物，须经反复分离精制。提取液一般体积较大，所含成分浓度较低，因此须对提取液通过蒸发或蒸馏进行浓缩，进行进一步的分离和精致。l l (一一)系统溶剂分离法l (二)两相溶剂萃取法l (三)沉淀法l (四)吸附法l (五)盐析法l (六)透析法l (七)分馏法l (八)超临界流体萃取技术l （八）结晶l （九）色谱法分离和精制的方法(一)系统溶剂分离法l 此法一般是选用3-7种不同极性的溶剂，由低极性至高极性分步对总提取物进行提取分离。使总提取物中各组分，依其在不同极性溶剂中溶解度的差异而得以分离。l 本法操作较为复杂，对微量成分、结构性质相似成分的分离精制有很大局限性，但仍是目前研究成分不明的天然药物的最常用方法。中药成分及其适用的提取溶剂中药成分极性中药成分极性中药成分类型中药成分类型适用的提取溶剂适用的提取溶剂强亲脂性（极性小）挥发油、脂肪油、蜡、脂溶性色素、甾醇类、某些苷元石油醚、己烷亲脂性苷元、生物碱、树脂、醛、酮、醇、醌、有机酸、某些苷类乙醚、氯仿中等极性小某些苷类（如强心苷等）氯仿：乙醇（2：1）中某些苷类（如黄酮苷等）乙酸乙酯大某些苷类（如皂苷、蒽醌苷等）正丁醇亲水性极性很大的苷、糖类、氨基酸、某些生物碱盐丙酮、乙醇、甲醇强亲水性蛋白质、黏液质、果胶、糖类、无机盐类水（二）两相溶剂萃取法l 1简单萃取法 两相溶剂萃取法是分离天然药物化学成分的常用方法。少量样品的萃取用分液漏斗操作；l 萃取的基本原理是利用混合物中各种成分在两相互不相溶的溶剂中分配系数的差异而达到分离的目的。分配系数()可以下式表示：lu/Ll 乳化乳化现象象l 液-液萃取中常遇到乳化现象。产生的原因有：溶剂的组合、成分的种类等。操作中出现乳化现象，可采用下列破乳方法：l久置；l用一金属丝在乳化层中搅动使之破坏；l将乳化层抽滤；l将乳化层热敷或冷冻；l分出乳化层，再用新溶剂萃取；l加少量氯化钠，解决两相比重相差较小及两相溶剂部分互溶的问题；l滴加数滴醇类如乙醇或磺化蓖麻油等破乳类物质。2 2逆流逆流连续萃取法萃取法(三)沉淀法l 沉淀法是在天然药物提取液中，加入某些试剂使产生沉淀，通过过滤将成分分离的方法。依据加入沉淀剂的不同，沉淀法可分为以下几种：l 1酸碱沉淀法l .铅盐l .试剂沉淀法1酸碱沉淀法l在天然药物提取液中加入酸或碱试剂后产生沉淀从而达到分离的方法称为酸碱沉淀法。l 该方法是依据酸(碱)成分与碱(酸)试剂反应成盐而溶于水，再加酸(碱)试剂反应重新生成游离酸(碱)从溶液中析出。l 一些具有内酯结构的化合物遇热碱开环生成羧酸盐而溶于水，加酸后，又重新形成内酯环从溶液中析出。l 本分离法适用于酸或碱性成分，以及内酯类成分的分离。2 2铅盐沉淀法沉淀法 l在含天然药物成分的水或稀醇溶液中加人中性醋酸铅或碱式醋酸铅试剂后，某些成分生成铅盐沉淀，过滤使之分离的方法称为铅盐沉淀法。l中性醋酸铅可与酸性或酚性物质结合成不溶性铅盐。如有机酸、蛋白质、氨基酸、黏液质、鞣质、树脂、酸性皂苷、部分黄酮等；l 碱性醋酸铅除与上述物质产生铅盐沉淀外，还可沉淀中性皂苷、异黄酮、糖类及一些生物碱等成分。l 得到的铅盐沉淀悬浮于水或含水乙醇中，通入H气体进行复分解反应，即可得到纯化的有效成分。本法也可用来沉淀杂质。3试剂沉淀法 l（1）在天然药物的提取液中，加入某些试剂，使之与有效成分结合生成水不溶物，滤集沉淀，经复原处理后，即可得到有效成分。如加入雷氏铵盐可沉淀分离水溶性季铵碱等。此外，还可以用明胶、蛋白质溶液沉淀鞣质；用胆甾醇沉淀甾体皂苷。l （2）经浓缩的提取液加入另一种难溶性溶剂，改变了原溶剂的极性，使其中某种或某些成分析出，以达到纯化的日的。常用的方法有水-醇法、醇-水法、醇-丙酮法、醇-乙醚法等。（四）盐析法l 在天然药物的水提液中，加入无机盐，使其达到一定浓度或饱和，促使有效成分在水中溶解度降低而沉淀析出,与其他水溶性较大的杂质分离。常作盐析的无机盐有氯化钠、硫酸钠、硫酸镁、硫酸铵等。l 如三七的水提液中加硫酸镁至饱和状态，三七皂苷乙即可沉淀析出。有些成分如原白头翁素、麻黄碱、苦参碱等水溶性较大，在萃取分离时，也往往先在水提取液中加入一定量的食盐，再用有机溶剂萃取。l （五）透析法l透析法是利用小分子物质在溶液中可通过半透膜，而大分子物质不能通过半透膜的性质而达到分离的方法。例如分离纯化皂苷、蛋白质、多肽、多糖等大分子成分时，可用透析法除去无机盐、单糖、双糖等小分子杂质。l 透析成功与否和透析膜的规格关系很大。须根据欲分离成分的分子量大小来选择。透析膜有动物膜、火棉胶膜、羊皮纸膜(硫酸纸膜)、蛋白胶膜及玻璃纸膜等。l 透析法的分离速度较慢，为了加快透析速，可用电透析法，电透析可使带电离子的透析速度增加10倍以上。（六）分馏法l分馏法是利用各成分沸点的差异进行提取分离的方法，用于分离液体混合物。在天然药物有效成分研究中，挥发油及一些液体生物碱的分离常用此法。(七)超临界流体萃取技术l 超临界流体萃取是一种利用超临界流体对天然药物中有效成分进行萃取分离的新技术。l 有些物质在临界温度和压力下，可形成一种既非液体又非气体的特殊相态称为超临界流体。该流体既具有与气体相似的粘度，又具有与液体相似的密度，其扩散力和渗透力均大大强于液体，因而对许多天然药物成分有很强的溶解能力，且介电常（极性）数随压力增大而增加。可根据成分的极性大小，改变压力进行选择性提取及析出。l 临界流体萃取的优点l 用二氧化碳作为超临界流体物质具有无毒无味，不易燃易爆，无残留，安全、价廉，对大多数物质不反应，可循环使用的优点,故最常用于天然药物的提取。（八）结晶和重结晶l 结晶法是分离和精制固体成分的重要方法之一，是利用混合物中各成分在溶剂中溶解度不同达到分离的方法。对天然药物成分纯化精制的过程常常就是反复结晶与重结晶的过程。l 通常情况下，结晶的形成标志着化合物的纯度达到了相当程度，故获得结晶并制备成单体纯品，就成为鉴定天然药物成分、研究其分子结构的重要一步。1、结晶的条件l 结晶的关键是选择最佳的结晶条件，包括样品纯度、溶剂类型、溶液浓度、结晶温度与速度等。l （1）一般情况下，样品纯度越高，越容易结晶；样品中存在杂质较多，会阻碍或延缓结晶的形成。l （2）溶液的浓度高有利于结晶的形成，但若浓度过高，反而不易结晶；浓度较低的溶液可放置使溶剂自然挥发至适宜浓度而析出结晶。l （3）最合适的结晶温度为5l。长时间放置使结晶缓慢析出，所得结晶往往大而纯。2、结晶溶剂的选择l理想的结晶溶剂必须具备以下条件：l不与结晶物质发生化学反应；l对结晶物质的溶解度热时大、冷时小，而对杂质的溶解度很大或者很小；l沸点适中，容易挥发；l能给出较好结晶；l无毒或毒性很小，便于操作。l 3、结晶纯度的判断l 一种纯的化合物通常都具有一定的晶形和均匀的色泽，以及一定的熔点和较小的熔距。故可根据结晶的色泽是否均匀、晶形是否一致、熔点是否一定及熔距是否较小，并结合纸色谱或薄层色谱技术，对结晶纯度加以判断。如果经数种不同的展开剂系统展开后均为一近乎圆形的斑点，即可判断结晶的纯度较高。（九）色谱分离法l 色谱法是一种分离和鉴定复杂混合物的有效方法。近年来已被广泛应用于天然药物有效成分的分离、提纯及鉴定。对一些性质相近、结构类似化合物的分离，采用经典的溶剂法和结晶法不能达到分离的目的，使用色谱法往往可以收到很好的分离效果。l 根据色谱分离原理的不同，现将几种常用的色谱分离法介绍如下。按分离原理的色谱分类l 一、吸附色谱 二、分配色谱l 三、离子交换色谱l 四、大孔吸附树脂法l 五、凝胶色谱法l 一、吸附色谱l1、基本原理l2、吸附剂l3、洗脱剂l4、被分离物质l5、吸附剂、洗脱剂和被分离成分三者关系l6、操作方式l7、两种特殊的吸附色谱1、基本原理l 吸附剂、洗脱剂与待分成分称为吸附过程的三要素。l 吸附色谱是利用吸附剂(固定相)对混合物中各成分吸附能力的差别而达到分离目的的。l 当混合成分到达吸附剂表面对由于吸附剂表面分子对成分分子的吸附作用，使成分分子在吸附剂表面浓度增大，这种现象称为吸附；l 当洗脱剂(移动相)连续通过吸附剂表面时，吸附剂吸附洗脱溶剂，混合物中各成分分子被洗脱溶解，这种现象称为解吸附。l 被分离混合物中各成分对同一固定相和移动相之间的吸附解吸附平衡不同，就使各成分在两相的迁移速度不同而分离。此法特别适用于脂溶性中等分子量成分的分离。2、吸附剂l 常用的极性吸附剂有:硅胶、氧化铝l 非极性吸附剂常用：活性炭吸附剂的活化l 氧化铝吸附力大于硅胶，吸附剂的活度级别(吸附力)与其含水量有关。吸附剂含水量愈高，吸附力愈低，如硅胶含水量12，吸附力就很弱而不能作为吸附剂使用，但当加热到100110记时即可除去绝大多数水分。l 吸附剂受热除去水分，提高其吸附力的过程称为活化；l 加入一定量水，降低其吸附能力的过程称为去活化。l 适用范围l 硅胶适用于中性或酸性成分的分离，但不适用于碱性成分的分离；l 氧化铝适用于碱性成分的分离，但不宜用于醛、酮、酯、内酯等类型化合物的分离。l 活性碳多孔的结构导致接触面积大，吸附性强,可以除异味和某些液体的颜色.还可以净化气体与液体,如防毒面具就是以活性炭来净化空气.3、洗脱剂l 洗脱剂应具备以下条件：l纯度高，杂质含量少；l与样品、吸附剂不起化学反应；l对被分离成分有一定溶解度；l黏度小、沸点低、易挥发等。l 洗脱剂的极性一般用介电常数表示。对极性吸附剂来说，洗脱剂的介电常数愈大，极性愈强，其洗脱能力愈强；对非极性吸附剂而言则相反，洗脱剂的介电常数愈小，其洗脱能力愈强。4、被分离物质l 用硅胶、氧化铝等极性吸附剂作固定相的吸附色谱，对极性小的成分吸附力弱，洗脱时先流出；对极性大的成分吸附力大，洗脱时后流出。化合物的极性大小主要取决于其化学结构。5、吸附剂、洗脱剂和被分离成分三者关系l 在吸附色谱中，各成分的分离取决于它们的迁移速。成分的极性愈大，与固定相的吸附力愈大，迁移速度愈慢；反之则迁移速度愈快。l 洗脱剂的极性大，被吸附剂吸附的力大，则对成分的洗脱能力大；反之，洗脱力小。l 无论是吸附力还是洗脱力，过大或过小均不利于成分的分离。具体应用时必须从吸附剂、被分离成分、洗脱剂三个方面综合考虑。6、操作方式l （1）薄层色谱法l （2）柱色谱法l （1）薄层色谱法l 薄层色谱法是一种快速、简便、灵敏的分离检识方法。薄层色谱将吸附剂均匀地铺在玻璃板上，把欲分析的样品点加到薄层上，然后用合适的溶剂展开而达到分离、鉴定和定量的目的。l 薄层色谱的操作过程主要包括制板、点样、展开和显色四个方面。l （2）柱色谱法l 柱色谱法是天然药物成分研究中常用的色谱方法。其分离原理、吸附剂及洗脱剂的选择均与薄层色谱法相同。在操作上可以分为装柱、上样和洗脱三大步骤。l 柱色谱法分离样品量大，故大多数情况下均为制备性分离，但应注意上柱的样品一定要经过适当的纯化处理，如过滤、萃取、脱色、沉淀等，否则将影响分离效果。吸附柱层析常用混合溶剂l 已烷苯l 苯乙醚l 苯乙酸乙酯l 氯仿乙醚l 氯仿乙酸乙酯l 氯仿甲醇 l 丙酮水l 甲醇水极性递增7、两种特殊的吸附色谱l l （1）聚酰胺吸附色谱l （2）大孔吸附树脂（1）聚酰胺吸附色谱l 一般认为聚酰胺色谱是一种吸附色谱，因分子上的酰胺基能与酚类的羟基、酸类的羧基及醌类的醌基等形成氢键吸附。对黄酮类、酚类、醌类、有机酸、鞣质等成分的分离效果极佳，可使性质极相似的类似物得到分离。吸附性强弱取决于各种化合物与与之形成氢键缔合的能力。通常在含水 溶剂中大致有如下规律形成氢键的基团数目越多，吸附力越强成成键键位置影响吸附力。易形成位置影响吸附力。易形成氢键氢键者吸附力减弱者吸附力减弱分子中芳香化程度高，分子中芳香化程度高，则则吸附性增吸附性增强强，反之，反之，则则弱弱各种溶剂聚酰胺柱上的洗脱能力有弱至强可大致排列如下l 水l 甲醇l 丙酮l 氢氧化钠水溶液l 甲酰胺l 二甲基甲酰胺l 尿素水溶液（2）大孔吸附树脂法l 大孔吸附树脂是一种具有大孔结构的高分子吸附剂，具有选择性吸附与分子筛的双重功能。l根据聚合材料的不同，通常分为中等极性与非极性两类。它所具有的吸附性是由范德华引力或产生氢键吸附的结果，在水溶液中能选择性地吸附有效成分。分子筛的性能是由于其本身的多孔性网状结构决定的。l 可依成分分子体积大小及极性的强弱，在一定规格的大孔吸附树脂上，以适当的溶剂洗脱而分离。洗脱剂的选择l 常用的洗脱剂有水、甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯等，一般先采用水洗除杂质后，再采用对化合物有较大溶解度的溶剂将被吸附的成分洗脱。也可采用不同极性梯度的洗脱剂分别洗下不同组分。大孔吸附树脂的应用l大孔吸附树脂因具有吸附容量大、选择性好、吸附速度快、吸附容易及成本低、收率较高、易再生等优点，广泛用于天然化合物的分离与富集工作如苷与糖的分离、生物碱的精致。在多糖、黄酮、三萜类化合物的分离方面有很好的应用实例。二、分配色谱l(一)基本原理l （二）被分离成分与溶剂系统性质的关系l (三)操作方式(一)基本原理l 当硅胶含水量17时，其吸附性消失，硅胶成为支持剂(载体)，其吸附的水成为固定相，洗脱剂选择与水互不相溶的有机溶剂l 样品中的成分就在固定相和移动相之间分配而达到分离。在洗脱过程中，成分极性愈大，在固定相中溶解度愈大，迁移速度愈慢，洗脱时后流出；相反，成分极性愈小，洗脱时先流出，以此进行分离。正相色谱和反相色谱l 分离水溶性较大或极性较大的成分如生物碱、苷类、糖类、有机酸等化合物。固定相多采用强极性溶剂，如水、缓冲溶液等，流动像则用氯仿、乙酸乙酯等弱极性有机 溶剂，如此类色谱称为正相分配色谱。l 当分离脂溶性化合物，如高级脂肪酸、油脂、游离甾体时，固定相多采用石油蜡等亲脂性溶剂作固定相，水或甲醇等强极性溶剂为移动相，称为反相分配色谱。（二）被分离成分与溶剂系统性质的关系（二）被分离成分与溶剂系统性质的关系(三)操作方式l1、纸色 2、分配薄层色谱 3、分配柱色谱1纸色谱l 纸色谱是以滤纸作为载体(支持剂)，滤纸上吸附的水作为固定相，与水不相混溶的有机溶剂作为移动相的分配色谱。混合物中各成分在两相间的分配系数不同，在层析纸上移动的位置不同，产生比移值的差异，由此达到分离的目的。某种物质在一定溶剂系统的两相之间有固定的分配系数，因此在纸色谱上也有固定的比移值，借此可以达到分析鉴定的目的。2分配薄层色谱l 分配薄层色谱的原理和纸色谱相同。装置及操作与吸附薄层色谱相同，只是铺板用的不是吸附剂而是支持剂。在分配色谱中流动相应先用固定相饱和，否则在展开过程中，流动相流过支持剂就把支持剂上的固定相带走一部分或全部，最后只剩下支持剂，就不再是分配色谱了。3分配柱色谱l 装置同吸附柱色谱。将吸附固定相的支持剂装于柱中，样品溶于少量固定相加入柱上端，以移动相进行洗脱，分别收集。三、离子交换色谱法l(一)基本原理l(二)操作l（三）离子交换色谱的应用。(一)基本原理l 离子交换树脂解离的阳离子或阴离子和水溶液中的离子发生交换作用，并被吸附到柱上；再用强离子浓度的水溶液进行可逆交换，使被分离成分从柱上洗脱下来，即可实现分离。用于离子型成分的精制及解离有差异成分的分离。l 离子交换剂所含的可解离基团解离后，留在母体上的为阳离子的称阴离子交换剂，反之为阳离子交换剂。阳离子交换剂可以和溶液中的阳离子交换；阴离子交换剂可以和溶液中的阴离子进行交换。一种离子交换剂和溶液中不同离子交换能力不同。当不同的离子在柱上进行洗脱时，它们各自在柱上移动速度也不相同，最后可以完全分离。(二)操作 离子交换柱色谱操作方法与前述柱色谱法基本相似，包括装柱、上样、洗脱等步骤（三）离子交换色谱的应用l氨基酸、肽类、生物碱、有机酸和酚类等和分离四、凝胶色谱法l 凝胶粒子是具有网状结构的高分子水不溶性物质。分子内具有许多一定大小的孔隙。孔的大小，取决于制备凝胶时加交联剂的程度，加交联剂量高，则孔小；加交联剂量低，则孔大。l (二)分离原理l 凝胶具有分子筛的过滤作用。受网孔半径限制，大分子不能渗入凝胶颗粒内部，随洗脱剂在颗粒间隙移动，先被洗脱；小分子可自由渗入并扩散到凝胶颗粒内部，通过色谱柱时阻力增大，洗脱时后流出。l （三）应用l凝胶色谱法目前已被广泛应用于天然药物有效成分的分离纯化工作中，是水溶性大分子化合物分离上常用的方法之一，实践证明它对小分子量物质的分离也是有效的。随着新的凝胶材料的不断问世，凝胶色谱法的应用范围也在不断扩大。五、高效液相色谱法l 高效液相色谱法也称高压液相色谱法。它是在经典的液相柱色谱的基础上发展而成的一种高效、快速、高灵敏的色谱分离方法。根据柱内填料的不同及不同的分离机制，可分为吸附色谱、分配色谱、离子交换色谱及凝胶色谱。由于采用了高效填充剂，并配以高压输液泵、高灵敏检测器、自动记录装置及自动收集装置，使高效液相色谱法的分离速度及效率均大大提高，更趋于仪器化、自动化，且适用范围广。l 制备型的HPL能大量分离制备较纯的试样。随着计算机技术的不断发展，HP与质谱、核磁、红外等波谱技术的联用进展很快。在天然药物化学成分的研究领域中，HPL发挥着越来越重要的作用。六、气相色谱法l 气相色谱法是一种以气体为流动相的色谱分离方法。l根据固定相的不同，可分为气固吸附色谱及气液分配色谱两类。以气液分配色谱的应用最普遍。依据混合物各组分在气固或气液两相的吸附能力的不同或分配系数的差异进行分离。具有分离效率高，分析速度快，试样用量少(气体试样可为l mI，液体试样为0.1ml，固体试样可为几微克)等优点。特别适用于具有沸点低、易挥发特性的挥发油成分的分离、鉴定和定量分析。