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现代分子生物学资料第一章 绪论编辑：杜华伟一、三大发现：列文虎克的细胞学说、焦耳用实验确立的能量守恒定律、达尔文的进化论。二、分子生物学定义：从分子水平研究生物大分子的结构与功能从而阐明生命现象本质的科学 ，主要指遗传信息的传递（复制）、保持（损伤和修复）、基因的表达（转录和翻译）与调控。三、分子生物学研究内容：1、DNA重组技术（基因工程） 2、基因的表达调控 3、生物大分子的结构和功能研究(结构分子生物学） 4、基因组、功能基因组与生物信息学研究四、DNA发现的几个实验：美国科学家AVERY用S型和R型致病菌侵染小鼠的实验、美国科学家HERSHEY在1952年从事的同位素分子标记法噬菌体侵染细菌的试验。第二章 染色体与DNA一、染色体的结构和组成 原核生物：DNA形成一系列的环状附着在非组蛋白上形成类核。 真核生物染色体有蛋白质和DNA组成，蛋白质包括组蛋白（H1，H2A、H2B、H3、H4）和非组蛋白。2、C值是一种生物的单倍体基因组DNA的总量。 C值往往与种系的进化的复杂程度不一致，某些低等生物却有较大的C值，这就是著名的“C值反常现象”。 3、DNA的一级结构：指4种脱氧核苷酸的连接及其排列顺序， DNA序列是这一概念的简称。4、双螺旋的基本特点：双链反向平行配对而成；脱氧核糖和磷酸交替连接，构成DNA骨架，碱基排在内侧；内侧碱基通过氢键互补形成碱基对（A：T，C：G）。5、DNA 的二级结构指两条多核苷酸链反向平行盘绕所产生的双螺旋结构。是有Watson和Crick在1953年共同发现的。分类：右手螺旋（是其通常存在形式）：A-DNA，B-DNA。左手螺旋：Z-DNA。6、超螺旋：DNA双螺旋结构中，一般每转一圈有十个核苷酸对，双螺旋总处于能量最低状态。正常DNA双螺旋额外的多转或少转几圈，就会出现双螺旋空间结构改变，在DNA分子中形成额外张力，若此时DNA分子的末端是固定的或是环状分子，双联不能自由转动，额外的张力就不能释放而导致DNA分子内部院子空间位置的重排，造成扭曲，即出现 超螺旋结构。从DNA到染色体过程的压缩过程：核小体的形成是染色体中DNA压缩的第一个阶段，在核小体中DNA盘绕组蛋白八聚体核心，从而使分子收缩至原尺寸的1/7。 染色质细丝盘绕成螺旋管状的粗丝，每个螺旋管包含6个核小体，其压缩比为6。 螺旋管进一步压缩形成超螺旋，压缩比是40. 超螺旋圆筒进一步压缩5倍便成为染色体单体。 总压缩比是76405。7、DNA的半保留复制：由亲代DNA生成子代DNA时，每个新形成的子代DNA中，一条链来自亲代DNA，而另一条链则是新合成的，这种复制方式称半保留复制。8半不连续复制：DNA复制过程中，前导链的合成以53方向，随着亲本双链体的解开而连续进行复制；后随链在合成过程中，一段亲本DNA单链首先暴露出来，然后以与复制叉移动相反的方向，按照53方向合成一系列的冈崎片段，然后再把它们连接成完整的后随链。这种前导链的连续复制和后随链的不连续复制在生物界是有普遍性的，因而称为双螺旋的半不连续复制。9、从复制原点到终点，组成一个复制单位，叫复制子。复制时，解链酶等先将DNA的一段双链解开，形成复制点，这个复制点的形状象一个叉子，故称为复制叉。10、线性DNA双链的复制方式:、将线性复制子转变为环状或多聚分子。、在DNA末端相处发夹式结构。、在某种蛋白质的介入下，在真正的末端上启动复制。 环状双链DNA的复制分为型、滚环型和D-环型几种类型。11、后随链的复制由引发体来引发，引发体像火车头一样在后随链分叉的方向上前进，并在模板上断断续续的引发生成后随链的引物RNA短链，再由DNA聚合酶III作用合成DNA，直至遇到下一个引物或冈崎片段为止。由RNaseH降解RNA引物并由DNA聚合酶I将缺口补齐，再由DNA连接酶将两个冈崎片段连在一起形成大分子DNA。12、冈崎片段：DNA复制过程中，两条新生链都只能从5端向3端延伸，前导链连续合成，滞后链分段合成。这些分段合成的新生DNA片段称冈崎片段。13、DNA的修复包括错配修复（恢复错配）、碱基切除修复（切除突变的碱基）、核甘酸切除修复（修复被破坏的DNA）、DNA直接修复（修复嘧啶二体或甲基化DNA）、SOS系统（DNA的修复，导致变异）14、DNA的转座或叫移位（transposition)：由可移位因子(transposable element) 介导的遗传物质重排现象。 转座子（transposon Tn）：存在于染色体DNA上可自主复制和位移的基本单位。原核生物转座子的类型：1、插入序列 2、复合转座子 3、TnA家族15、DNA的复制酶：引物合成酶（此酶以DNA为模板合成一段RNA,这段RNA作为合成DNA的引物） DNA聚合酶原核生物中的DNA聚合酶（聚合酶主要是对DNA损伤的修复；以及在DNA复制时切除RNA引物并填补其留下的空隙。聚合酶修复紫外光引起的DNA损伤。聚合酶是 DNA 复制的主要聚合酶，还具有3-5外切酶的校对功能，提高DNA复制的保真性。）（真核生物中的DNA聚合酶：聚合酶：引物合成。聚合酶：损伤修复。聚合酶：线粒体DNA的复制。 聚合酶：核DNA的复制。 聚合酶：与后随链合成有关） DNA连接酶：DNA连接酶在DNA复制、损伤修复、重组等过程中起重要作用 DNA 拓扑异构酶：拓扑异构酶：使DNA一条链发生断裂和再连接，作用是松解负超螺旋。主要集中在活性转录区，同转录有关。拓扑异构酶：该酶能暂时性地切断和重新连接双链DNA，作用是将负超螺旋引入DNA分子。同复制有关。DNA 解螺旋酶 /解链酶：通过水解ATP获得能量来解开双链DNA。 第三章编辑：纪明昌中心法则：转录：是指拷贝出一条与DNA链序列完全相同（除了TU之外）的RNA单链的过程，是基因表达的核心步骤。包括：模板识别，转录起始，转录延伸，转录终止。转录单元（transcription unit）一段从启动子开始至终止子结束的DNA序列。有意义链和反义链：我们把与mRNA序列相同的那条DNA链成为编码链coding strand或称有意义链sense strand，并把另一条根据碱基互补原则指导mRNA合成的DNA链成为模板链template strand或称反义链antisense strand。原核RNA聚合酶：全酶: 2 核心酶：2 2（全酶 holoenzyme）=2+真核RNA聚合酶：根据它们对-鹅膏蕈碱（- amanitin）的敏感性不同分为RNA聚合酶I、II、III。 RNA聚合酶I 对-鹅膏蕈碱不敏感 ，RNA聚合酶II 对低浓度-鹅膏蕈碱敏感 ，RNA聚合酶III 对高浓度-鹅膏蕈碱敏感 酶位置转录产物相对活性对-鹅膏蕈碱的敏感性RNA聚合酶核仁rRNA50-70%不敏感RNA聚合酶核质hnRNA20-40%敏感RNA聚合酶核质tRNA约10%存在物种特异性RNA聚合酶全酶与启动子区闭合双链DNA结合形成二元闭合复合物（全酶、模板DNA）再解链为二元开链复合物，转录起始，形成三元复合物（全酶、模板DNA、新生RNA），s因子释放，RNA合成开始启动子定义：指能被RNA聚合酶识别、结合并启动基因转录的一段DNA序列。原核生物启动子结构-10 signal (TATA box,Pribnow box) 酶的紧密结合位点（富含AT碱基，利于双链打开） -35 signal（ TTGACA ）提供了RNA聚合酶全酶识别的信号 transcription start site10区和-35区的最佳距离-10区与-35区的最佳间距大约是1619bp.Pribnow区下降突变（TATAATAATAAT）Pribnow区上升突变（TATGTTTATATT）真核生物启动子结构1、核心启动子（core promoter）指保证RNA聚合酶转录正常起始所必需的、最少的DNA序列，包括转录起始位点及转录起始位点上游TATA区-25bp-30bp TATA box DNA解链开始转录位置2、上游启动子元件（upstream promoter element，UPE ）（1）CAAT box -75左右，RNA聚合酶结合有关（2）更上游 GC box 转录因子结合其上3、增强子顺式作用元件(cis-acting element)定义：影响自身基因表达活性的非编码DNA序列。能直接、间接辨认和结合转录上游区段DNA的蛋白质，现已发现数百种，统称为反式作用因子(trans-acting factors)。 反式作用因子中，直接或间接结合RNA聚合酶的，则称为转录因子(transcriptional factors, TF)。 原核与真核生物mRNA的特征比较原核生物mRNA的特征:原核mRNA的半衰期短，细菌内mRNA的转录、翻译与降解几乎是同时进行许多原核mRNA以多顺反子的形式存在原核mRNA的5端无帽子结构或只有短的Poly（A）尾巴在起始密码子AUG上游7-12个核苷酸处，有一段可与核糖体16S rRNA配对结合的、富含嘌呤的3-9个核苷酸的共同序列，一般为AGGA，此序列称SD序列. 使得结合于30S亚基上的起始tRNA能正确地定位于mRNA的起始密码子AUG真核生物mRNA的特征真核mRNA的5端存在帽子结构有利于核糖体对mRNA的识别，Cap0必需帽子结构具有增强翻译效率的作用：增加mRNA的稳定性，避免核酸酶的作用绝大多数真核mRNA具有Poly（A）尾巴mRNA穿越核膜的能力有关,影响到mRNA的稳定性和翻译效率。polyA+与polyA-终止分为两类： 强终止子内部终止子：不依赖Rho ()因子的终止。 弱终止子 需要因子（rho factor），又称为依赖性终止子（ Rho-dependent terminator不依赖于因子的终止 模板DNA上存在终止转录的特殊信号终止子又称为内在终止子，内在终止子1、终止位点上游一般存在一个富含GC碱基的二重对称区，由这段DNA转录产生的RNA容易形成发卡结构2、在终止位点签名有一段48个A组成的序列，所以转录产物的3端为寡聚U这种结构的存在决定了转录的终止依赖于因子的终止 r因子结合于新合成的RNA链，借助水解ATP的能量沿RNA 链运动，当RNA 聚合酶遇终止子停止时， r因子追上酶，促使转录终止。转录后加工5端加帽 3端加尾 RNA的剪接 RNA的编辑5端加帽5端的一个核苷酸总是7-甲基鸟核苷三磷酸（m7Gppp）。mRNA5端的这种结构称为帽子（cap）。能被核糖体小亚基识别，促使mRNA和核糖体的结合； m7Gppp结构能有效地封闭mRNA 5末端，以保护mRNA免受5核酸外切酶的降解，增强mRNA的稳定。3端加尾 提高了mRNA在细胞质中的稳定性RNA的剪接（Splicing）生物体内内含子的主要类型：P98将转录形成的mRNA前体（pre-mRNA）中的内含子剪除，将外显子连接起来的加工过程参与RNA剪接的物质：snRNA（核内小分子RNA）snRNP（与snRNA结合的核蛋白）RNA的编辑 是指转录后的RNA在编码区发生碱基的突变、加入或丢失等现象。内含子（intron）：真核细胞基因DNA中的不编码序列，这部分序列并不编码蛋白质，又称间隔序列。 外显子（exon or extron）：真核细胞基因DNA中的编码序列，这部分序列可转录为RNA，并翻译成蛋白质，也称表达序列。可译框架（ORF，open reading frame）真核生物断裂（不连续）基因在表达过程中时必须经历的步骤mRNA前体内含子的剪接hnRNA：(heterogenous nuclear RNA) mRNA原始转录产物或前体snRNA：(small nuclear RNA) 100-300 核苷酸，以U分类：U1-6snRNP：(small nuclear ribonucleoprotein) 核酶（ribozyme）指一类具有催化功能的RNA分子，通过催化靶位点RNA链中的磷酸二酯键的断裂，特异性的剪切底物RNA分子，从而阻断基因的表达。第四章 生物信息的传递（下）从mRNA到蛋白质编辑：王应卓n 遗传密码 (genetic code): DNA（或mRNA）中核苷酸序列与蛋白质中氨基酸序列之间的对应关系。（二）遗传密码的性质（特点）1.密码的连续性：读码无标点、无重叠，阅读方向为532.密码的简并性 大多数氨基酸都存在几个密码，由一种以上密码子编码同一个氨基酸的现象称为密码子的简并性（degeneracy）。密码子碱基数确定和对应性（64个密码子对20种氨基酸） 确定同一个氨基酸的不同密码称为同义密码（synonymous codons）。 密码的简并性可以减少碱基突变造成的有害效应。 在标准遗传密码表中，只有一个密码子的氨基酸是Trp和Met。3.密码的方向性 指阅读mRNA模板上的三联体密码时，只能沿53方向进行。4.密码的摆动性1966年，Crick提出摆动假说（Wobble hypothesis） tRNA上的反密码子与mRNA上的密码子配对时，密码子的第一位、第二位碱基配对是严格的，第三位碱基可以有一定变动，这种现象称为密码的摆动性或变偶性（wobble）。 I（肌苷，次黄嘌呤核苷）A、U、C配对。5.密码的普遍性与特殊性 遗传密码无论在体内还是体外，无论是对病毒、细菌、动物还是植物而言都通用。 在真核细胞线粒体中， UGA不是终止密码子，是Trp的密码子； AUA不是Ile的密码子，而是Met的密码子； AGA和AGG不是Arg密码子，而是终止密码子。第二节 tRNAtRNA：运送特定氨基酸到核糖体上合成蛋白质。一、tRNA的二级结构 二级结构：三叶草型 三级结构：倒L型 稀有核苷含量多tRNA的功能在蛋白质合成中，起着运载氨基酸的作用，按照mRNA链上的密码子所决定的氨基酸顺序将氨基酸转运到核糖体的特定部位。 3端CCAOH上的氨基酸接受臂 识别氨酰tRNA合成酶的位点 核糖体识别位点 反密码子位点（一）起始tRNA和延伸tRNA一类特异地识别mRNA模板上起始密码子的tRNA叫起始tRNA，其他tRNA为延伸tRNA. 原核起始tRNA携带fMet 真核起始tRNA携带Met氨基酰-tRNA的表示方法：真核生物： Met-tRNAiMet；原核生物： fMet-tRNAifMet。1、无义突变 在蛋白质的结构基因中,一个核苷酸的改变可能使代表某个氨基酸的密码子变成终止密码子(UAG、UGA、UAA),使蛋白质合成提前终止,合成无功能的或无意义的多肽,这种突变就称为无义突变.2、错义突变 错义突变是由于结构基因中某个核苷酸的变化使一种氨基酸的密码变成另外一种氨基酸的密码. 3、原核生物翻译过程中核糖体结构模式：P位：肽酰位(peptidyl site)、A位：氨基酰位(aminoacyl site)、E位：排出位(exit site)(一)原核生物翻译起始复合物形成1) 1、翻译起始需要的几种成分：30S小亚基、模板mRNA、fMet-tRNAfMet、三个翻译起始因子（IF-1、IF-2 、 IF-3）、GTP、50S大亚基、Mg 2四 、肽链合成的终止和释放I. 识别：RF（释放因子）识别终止密码，进入核糖体的A位II. 水解：RF使转肽酶变为酯酶，多肽链与tRNA之间的酯键被水解，多肽链释放III. 脱离：模板mRNA、RF以及空载tRNA与核糖体脱离IV. 分子伴侣（molecular chaperone） 2、 能够在细胞内辅助新生肽链正确折叠的蛋白质。是一类序列上没有相关性但有共同功能的保守性蛋白质。 按是否自发性折叠分为：热休克蛋白和伴侣素。4、信号肽假说：信号肽假说内容：（1）蛋白质合成起始首先合成信号肽（2）SRP（信号识别蛋白）与信号肽结合，翻译暂停（3）SRP与SRP受体结合，核糖体与膜结合，翻译重新开始（4）信号肽进入膜结构（5）蛋白质过膜，信号肽被切除，翻译继续进行（6）蛋白质完全过膜，核糖体解离信号肽： 常指新合成多肽链中用于指导蛋白质跨膜转移的N-末端氨基酸序列（有时不一定在N端）。3、蛋白质转运机制：蛋白性质 运转机制 主要类型 分泌 蛋白质在结合核糖体上合成，并以翻译-运转同步机制运输免疫球蛋白、卵蛋白、水解酶、激素等细胞器发育 蛋白质在游离核糖体上合成，以翻译后运转机制运输 核、叶绿体、线粒体、乙醛酸循环体、过氧化物酶体等细胞器中的蛋白质 膜的形成 两种机制兼有 质膜、内质网、类囊体中的蛋白质 5、蛋白质降解中泛素的参与：蛋白质的降解依赖于泛素（ubiquitin，Ub）。泛素由个高度保守的氨基酸组成，普遍存在于真核生物中，故名泛素。它最初是从小牛的胰脏中分离出来的。共价结合泛素的蛋白质能被蛋白酶体识别和降解，这是细胞内短寿命蛋白和一些异常蛋白降解的普遍途径。26S蛋白酶体是一个大型的蛋白酶，可将泛素化的蛋白质分解成短肽。泛素相当于蛋白质被摧毁的标签，被贴上标签的蛋白质就会被运送到细胞内的“垃圾处理厂”，在那里被降解。 降解涉及到的三种重要酶：E1,E2,E3的作用：n E1激活泛素分子，n E2就负责把泛素分子绑在被降解蛋白质上。n E3能识别被降解的蛋白质。7、核糖体循环步骤：核糖体循环包括多肽链合成的进位、转肽、脱落和移位三步反应。第五章分子生物学的研究方法（上）编辑：闫国栋 1.基因操作：主要包括DNA分子的切割与连接、核酸分子杂交、凝胶电泳、细胞转化、核酸序列分析以及基因的人工合成、定点突变和PCR扩增等。 基因工程：指在体外将核酸分子插入病毒、质粒或其他载体分子，构成遗传物质的新组合，使之进入新的宿主细胞内并获得持续稳定增值能力和表达。 基因工程技术实际上是核酸操作技术的一部分。重组DNA技术-基因工程流程 1.分载体和目的基因的分离2.切限制性内切酶的应用3.接载体与目的基因连接成重组体4.转基因序列转入细胞5.筛目的基因序列克隆的筛选和鉴定6.表目的基因在宿主细胞的表达限制性内切酶切割方式有两种1）、错位切割，产生互补性的粘性末端。 错位切割所产生的DNA末端，两条链不平齐，一条链凸出，一条链凹进，这种末端称为黏性末端。带有相同黏性末端的DNA分子很容易在末端互补配对，连接成新的重组分子。 2）、沿对称轴切割，产生平齐末端 基因库，也叫基因组文库， DNA文库（ DNA library)是指用克隆的方法将一种生物的全部基因组长期以重组体方式保持在适当的宿主中。 将生物细胞基因组DNA通过限制性内切酶部分酶解后所产生的基因组DNA片段随机地同相应的载体重组、克隆，所产生的克隆群体代表了基因组DNA的所有序列。这样保存的基因组是多拷贝、多片段，当需要某一片段时，可以在这样的“图书馆”中查找（没有目录）。cDNA文库首先获得mRNA，反转录得cDNA，经克隆后形成文库。cDAN文库和基因组文库的不同之处在于，cDNA文库除却了mRNA拼接过程中除去的内含子等成分，便于DNA重组的使用。其复杂性比基因文库低得多。 主要用于研究蛋白质的氨基酸顺序，可根据克隆的cDNA分子的核酸序列直接推倒出来。分子杂交： 是通过各种方法将核酸分子固定在固相支持物上,然后用标记的探针与被固定的分子杂交,经显影后显示出目的分子所处的位置的过程. 分子杂交包括：DNA-DNA杂交（原位杂交、点杂交、Southern杂交），DNA-RNA杂交（Northern杂交）及蛋白杂交（Western 杂交）等。 Southern杂交用途： 用来检查DNA样品中是否存在有某个特定的基因，而且还可知道其大小及酶切位点的分布。Northern RNA 印迹杂交用途：用来检查基因组中某个特定的基因是否得到转录 。聚合酶链式反应（PCR）体外酶促合成特异DNA片段的新方法，主要由高温变性、低温退火和适温延伸三个步骤反复的热循环构成 .SNP 单核苷酸多态性single nucleotide polymorphism指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性.只涉及到单个碱基的变异(转换或颠换)，也可由碱基的插入或缺失所致。环形双链质粒DNA分子具有三种不同构型：共价闭合环状的SC构型DNA（cccDNA），开环的OC构型DNA（ocDNA），线性的L构型DNA （LDNA），三者具有不同的电泳迁移率，可在琼脂糖凝胶电泳中分开。共价闭环线状开环蓝白斑筛选出阳性菌落:Lac Z 半乳糖苷酶基因，在含Xgal培养基上呈蓝色，插入外源DNA，重组子培养呈白色pUC质粒，可插入外源基因片段长度约10kb。将外源基因插入到MCS中，随质粒的表达而表达，增殖而扩增。外源基因插入到MCS后，-半乳糖苷酶的活性丧失而不显兰色菌落。如果不插入外源基因，则产生兰色。从而筛选阳性菌落。 第七章编辑：动药女生基因表达的方式 组成性基因表达 适应性表达（诱导和阻遏表达）1、组成性基因表达某些基因在一个生物个体的几乎所有细胞中持续表达，通常被称为管家基因 (house-keeping gene)。无论表达水平高低，管家基因较少受环境因素影响，而是在个体各个生长阶段的大多数或几乎全部组织中持续表达，或变化很小。区别于其他基因，这类基因表达被视为组成性表达。2、调节蛋白操纵子(operon)包括俩个区控制区：1）调节基因（Regulatory gene）为阻抑蛋白编码基因 2）启动基因（Promoter）为cAMP受体蛋白（CRP）和RNA聚合酶结合区。 3） 操纵基因（0perater）为阻抑蛋白结合位点。信息区由一个或数个结构基因串联在一起组成。由操纵基因以及相邻的若干结构基因所组成的功能单位，其中结构基因转录受操纵基因所控制。 操纵基因是顺式控制元件，阻抑蛋白是反式作用因子真核生物的顺式作用元件是指可影响自身基因表达活性的特异DNA 序列。通常是非编码序列。包括启动子、增强子及沉默子等。2、调节蛋白是调节基因转录的蛋白因子，如原核生物的阻遏蛋白和CAP蛋白（降解物基因活化蛋白）、真核生物的基本转录因子和特异转录因子等。原核基因调控机制的类型与特点（一） 原核基因调控机制的类型1、负调控 negative regulation在没有调节蛋白质存在时基因是表达的，加入某种调节蛋白质后基因活性就被关闭，这样的控制系统就叫做负控系统 。 其调节蛋白质叫做阻遏蛋白 两种类型：负控诱导和负控阻遏2、正调控 positive regulation 在没有调节蛋白质存在时基因是关闭的，加入某种调节蛋白质后基因活性就被开启，这样的控制系统就叫做正控系统。 其调节蛋白质叫做无辅基诱导蛋白（激活蛋白) 两种类型:正控诱导和正控阻遏系统（二）特殊代谢物调节基因表达的类型1、可诱导调节l 一些基因在特殊的代谢物或化合物的作用下，由原来关闭的状态转变为工作状态，即在某些物质的诱导下使基因活化.l 调节分解代谢的操纵子，同时受cAMP-CAP的活性调节2、可阻遏调节l 一些基因在特殊的代谢物或化合物的作用下，由原来开启的状态转变为关闭状态，基因的表达被阻遏.l 调节合成代谢的操纵子（三）原核生物基因表达调控的特点l 调节的主要环节在转录水平上进行l 因子决定RNA聚合酶识别特异性l 主要通过操纵子模式进行调节l 阻遏蛋白对转录的抑制作用（阻遏机制）是普遍存在的负调控作用原核生物中基因的组织形式 几个作用相关的基因在染色体上串连排列在一起，由同一个调控系统来控制。 这样的一个整体称为一个操纵元(operon)。 大肠杆菌至少有6种因子70：负责识别一般的启动子54：识别与氮代谢有关的基因启动子32：识别热激（heat shock）蛋白质基因启动子。 2、细菌的应急反应的机制：应急信号： 鸟苷四磷酸（ppGpp）、 鸟苷五磷酸（pppGpp） 诱导物：空载tRNA乳糖操纵子与负控诱导系统：乳糖操纵子(lac operon)的结构与组成酶的诱导-lac体系受调控的证据1、实验证据o 在不含乳糖及-半乳糖苷的培养基中，lac+基因型每个大肠杆菌细胞内大约只有12个酶分子。o 如果在培养基中加入乳糖，酶的浓度很快达到细胞总蛋白量的6%或7%，每个细胞中可有超过105个酶分子2、实验用诱导物 乳糖 IPTG(异丙基巯基半乳糖苷) TMG(巯甲基半乳糖苷) ONPG(O-硝基半乳糖苷)乳糖操纵子模型1、Z、Y、A基因的产物为一条多顺反子mRNA lacZ：编码-半乳糖苷酶，它可以将乳糖水解为半乳糖和葡萄糖； lacY：编码半乳糖苷透性酶，它能将乳糖运送透过细菌的细胞壁； lacA：编码硫代半乳糖苷乙酰转移酶，进行乳糖代谢。2、P区位于I与O之间，O为阻遏物结合位点：阻遏物与O区的结合影响了RNA聚合酶与启动子区结合形成转录起始复合物的效率。4、 CAP的正性调节：ATP在腺苷酸环化酶的作用下转变成环式 Catabolite activating protein, CAP 代谢激活蛋白，是cAmp的受体蛋白 (cyclic Amp receptor protein, CRP) cAmp-CAP复合物，是lac操纵元的正调控因子 无葡萄糖时camp浓度高，反之则低。5、 协调调节 当阻遏蛋白封闭转录时，CAP对该系统不能发挥作用； 如无CAP存在，即使没有阻遏蛋白与操纵序列结合，操纵子 仍无转录活性。 单纯乳糖存在时，细菌利用乳糖作碳源； 若有葡萄糖或葡萄糖/乳糖共同存在时，细菌首先利用葡萄糖lac操纵子的本底水平表达 因为诱导物需要穿过细胞膜才能与阻遏物结合，而运转诱导物需要透过酶。 在非诱导状态下有少量（1-5个mRNA分子）lac mRNA合成-本底水平组成型合成。 3、阻遏物lacI基因产物及功能4、葡萄糖对lac操纵子的影响 葡萄糖 腺苷酸环化酶活性降低 ATP 无法转变成 cAMP 不能形成 CAP-cAMP 复合蛋白 RNA 酶无法结合在 DNA 上 结构基因不表达。 代谢物阻遏效应 研究认为葡萄糖的某些降解产物抑制lac mRNA的合成，这种效应称之为代谢物阻遏效应.5、cAMP与代谢物激活蛋白cAMP-CRP复合物与启动子区的结合lac mRNA合成起始所必需的，有利于形成稳定的开放型启动子-RNA聚合酶结构。lac基因产物数量上的比较 Z、Y、A三个基因产物的拷贝数比例为1：0.5：0.2原因：在翻译水平上的调节 1、Lac mRNA可能在翻译过程中的核糖体相脱离，从而终止蛋白质链的翻译。 2、Lac mRNA分子内部，A基因比Z基因更易受内切酶作用发生降解，故Z基因的完整拷贝数要比A基因多。（三）操纵子的融合与基因工程操纵子的融合：由较弱启动子和强启动子的基因形成的融合基因，可以通过强启动子使弱启动子的转录增强，增加蛋白表达量。四色氨酸操纵子与负控阻遏系统特殊代谢物调节基因活性的类型l 可诱导调节：调节分解代谢的操纵子，同时受cAMP-CAP的活性调节l 可阻遏调节：调节合成代谢的操纵子阻遏型操纵子：辅阻遏蛋白无活性，不能与操纵基因结合，结构基因表达.l 色氨酸操纵子主要参与调控一系列用于色氨酸合成代谢的酶蛋白的转录合成。当细胞内缺乏色氨酸时，此操纵子开放，而当细胞内合成的色氨酸过多时，此操纵子被关闭。 l 色氨酸操纵子的调控机制与乳糖操纵子类似，但通常情况下，操纵子处于开放状态，其辅阻遏蛋白不能与操纵基因结合而阻遏转录。l 而当色氨酸合成过多时，色氨酸作为辅阻遏物与辅阻遏蛋白结合而形成阻遏蛋白，后者与操纵基因结合而使基因转录关闭。 弱化子与前导肽 在操纵区与结构基因之间的一段可以终止转录作用的核苷酸序列，当操纵子被阻遏时，RNA合成被终止，这段核苷酸起终止转录信号作用. 起调节作用的是某种氨酰-tRNA的浓度三）mRNA前导区的序列分析前导区mRNA上有两个连续的色氨酸密码子；前导序列上有4个分别以1、2、3、4表示的片断能以两种不同的方式进行碱基配对，有时以12和34配对，有时只以23方式互补配对.l 提高效率。二、稀有密码子对翻译的影响l 实验证据 RNA引物由dnaG基因编码的引物酶催化合成 dnaG、rpoD及rpsU属于大肠杆菌基因组上的同一个操纵子 基因转录出来的三个蛋白相应的mRNA拷贝数大体相同，由于翻译的调控使得蛋白的拷贝数发生了很大的变化。 由于细胞内对应于稀有密码子的tRNA较少，高频率使用这些密码子的基因翻译过程容易受阻，影响了蛋白质合成的总量。三、重叠基因对翻译的影响l 重叠基因对翻译的影响l 重叠的密码保证了同一核糖体对两个连续基因进行翻译的机制。l 偶联翻译是保证两个基因产物在数量上相等的重要手段。六、魔斑核苷酸水平对翻译的影响空载氨酰-tRNA对蛋白质和RNA的合成速度进行调控（一）严紧控制和松散控制1、严紧控制（基因型rel） 当细菌处于饥饿条件下，缺乏维持蛋白质合成的氨基酸，其大部分活性区域将被关闭，此称之为严紧控制。 严紧控制导致两种特殊的核苷酸积累：PPGpp、pppGpp2、松弛控制（基因型rel-）l 松弛突变株（基因型rel- ）去除了严禁控制反应；l 蛋白质合成停止，但RNA的合成速度没有下降；l 氨基酸的匮乏不会导致（p）ppGpp的合成；l 若有严紧因子存在，也能合成（p）ppGpp.（二）调控机制 应急信号： 鸟苷四磷酸（ppGpp）、 鸟苷五磷酸（pppGpp） 诱导物：空载tRNA第七章 真核生物基因表达（下）真核基因组的结构特点 1、在真核细胞中，一条成熟的mRNA链只能翻译出一条多肽链，不存在原核生物中常见的多基因操纵子。形式2、真核细胞DNA都与组蛋白和大量非组蛋白相结合，只有一小部分DNA是裸露的。3、高等真核细胞DNA中很大部分是不转录的，大部分真核细胞的基因中间还存在不被翻译的内含子。4、真核生物能有序地根据生长发育阶段的需要进行DNA片段重排，还能在需要时增加细胞内某些基因的拷贝数。一、基因家族 定义：真核基因组中来源相同,结构相似,功能相关的一组基因.可能由某一共同祖先基因经重复和突变产生。 基因家族的种类 ：简单的多基因家族、复杂多基因家族、发育调控的复杂多基因家族简单的多基因家族：以串联方式前后相连rRNA复杂的多基因家族：一般由几个相关基因家族构成，基因家族之间由间隔序列隔开，并作为独立的转录单位.。组蛋白基因家族 四、DNA甲基化与基因活性的调控（一） DNA的甲基化 DNA甲基化能关闭某些基因的活性，去甲基化则诱导了基因的重新活化与表达。 DNA的甲基化能提高该位点的突变频率，因而可作为诱变剂或致癌因子调节基因表达。1、甲基化的类型：5甲基胞嘧啶、N6甲基腺嘌呤、7甲基鸟嘌呤XistX染色体其他位点甲基化，不转录活性去甲基化，活性去甲基化，转录失活甲基化，失活（二） DNA的甲基化机制基因转录的机理l 甲基化达到一定程度时会发生从常规的B-DNA向Z-DNA的过渡。又由于Z-DNA结构收缩，螺旋加深，使许多蛋白质因子赖以结合的元件缩入大沟而不利于基因转录的起始。l DNA甲基化导致某些区域DNA构象变化，影响蛋白质与DNA的相互作用；抑制转录因子与启动区DNA的结合效率。（三） DNA的甲基化与X染色体n 雌性胎生哺乳动物细胞中两条X染色体之一在发育早期随机失活n X染色体失活中心(X-chromosome inactivation center,Xic): 定位在Xq13区（正好是Barr氏小体浓缩部位）n Xist基因(Xi-specific transcript)：只在失活的X染色体上表达.真核生物转录水平的调控：RNA聚合酶、顺式作用元件、反式作用因子、转录起始的调控一、顺式作用元件顺式作用元件：能与特异性转录因子结合，以决定转录的起始位点、转录效率及转录的时空特异性的DNA序列称顺式作用元件（一）启动子 promoter：真核基因启动子由核心启动子和上游启动子元件（UPE）两个部分组成. 在基因转录起始位点(+1)及其5上游大约100200bp以内的一组具有独立功能的DNA序列. 决定RNA聚合酶转录起始点和转录频率的关键元件.核心启动子(core promoter)：保证RNA聚合酶转录正常起始所必需的、最少的DNA序列。包括转录起始位点及转录起始位点上游-25-30bp处的TATA盒。核心启动子单独起作用时，只能确定转录起始位点并产生基础水平的转录上游启动子元件(upstream promoter element，UPE)：包括通常位于-7Obp附近的CAAT盒(CCAAT)和GC盒(GGGCGG)等；能通过形成转录前复合物调节转录起始的频率，提高转录效率。真核基因启动子的多元性：并不是每个基因的启动子区都包含这三个UPE真核基因启动子的UPE对转录起始的决定性作用可能是各个UPE之间的距离，而不是序列本身.。1、 启动子：核心启动子(core promoter)、上游启动子元件(upstream promoter element，UPE)2、增强子3、转录因子：TFIID（TBP（TATA-binding protein）、TAFIIs（TBP-associated factors）、TFIIA、TFIIB 、TFIIF 、TFIIE三、反式作用因子（一）) 反式作用因子/转录调节因子的概念及