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分子生物学复习提纲 一、名词解释(共5小题，每小题2分，共10分)1、cDNA文库：以mRNA为模板，经反转录酶催化，在体外反转录成cDNA，与适当的载体（常用噬菌体或质粒载体）连接后转化受体菌，则每个细菌含有一段cDNA，并能繁殖扩增，这样包含着细胞全部mRNA信息的cDNA克隆集合称为该组织细胞的cDNA文库。 2、DNA文库：某一特定来源DNA通过细胞DNA克隆技术构建成含有所用DNA片段的重组DNA分子，并转化至细菌内，构成DNA文库。依据DNA的来源不同，可分为，基因组DNA文库和cDNA文库。PS：书上P245页基因文库：是一个包括各物种DNA的克隆群，可以用于鉴定未知基因。基因文库包括基因组文库和cDNA文库，可以用重组DNA技术构建。CDNA文库：是这样一个克隆群，它包含了一种生物的基因组的全部基因的cDNA序列。3、蛋白质组：是一个细胞内存在的全部蛋白质，包括了基因组表达的全部蛋白质和修饰后的各种形式的蛋白质，是细胞内所有蛋白质的集合体。 4、基因:由核酸的一些特定的碱基序列构成的表达遗传信息的功能单位。 5、PCR：在模板DNA、引物和4种脱氧核苷酸（dNTP）存在的条件下，由耐热的DNA聚合酶在体外反复酶促合成双链DNA的反应称为聚合酶链式反应。是一项在短时间内大量扩增特定的DNA片段的生物学技术。 6、基因多态性;指生物体内决定性状的遗传因子及其组合的多样性。 7、基因组：一个体细胞所含的一套完整的染色单体成为染色体组，一个染色体组里所含的所有的DNA称为一个基因组。8、启动子：是RNA聚合酶识别、结合和启动转录的一段DNA序列，位于转录区的上游，属于调控序列。9、细胞凋亡：生物体内细胞在生理因素或非生理因素的诱导下，其死亡途径被激活，并在大分子合成和激活的严格调控下发生的程序性死亡过程。 10、RNAi：是正常生物体内抑制特定基因表达的一种现象，是指当细胞中导入与内源性mRNA编码区同源的双链RNA序列时，该mRNA发生降解而导致基因表达沉默的现象，这种现象发生在转录后水平，也成为转录后基因沉默。11、基因突变：是指基因组DNA分子发生的突然的可遗传的变异，是DNA分子中发生碱基对的增添、缺失或替换，而引起的基因结构的改变。12、基因诊断：是指应用分子生物学技术和方法，直接检测内源基因结构及其表达是否出现异常，或者是否存在外源基因，从而对人体状态和疾病做出诊断。13、基因治疗：是指把目的基因导入靶细胞，以纠正和弥补靶细胞基因缺陷，达到治疗的目的。14、信号转导：细胞通讯触发细胞内一系列的化学反应，这些反应的本质是将一种信号转化为另一种信号，最终产生细胞应答，包括代谢水平和代谢速度的改变，导致细胞的生长、分化、衰老和死亡速度的改变，这一过程成为信号转导。15、细胞周期：是细胞生长和细胞分裂形成的一个生长周期及有序发生的一系列有关事件，是生命形成、组织更新的基础。 16、中心法则：是DNA、RNA和蛋白质之间基本功能关系的解释，即DNA是自身复制和转录合成RNA的模板，RNA是翻译合成蛋白质的模板，因此遗传信息的流向是DNARNA蛋白质。17、原癌基因：是存在于细胞基因组中的一类正常基因，其编码产物在细胞增值、分化、凋亡及个体发育与组织修复等生命活动中起重要作用。原癌基因也称为细胞癌基因。18、癌基因：原癌基因激活后成为癌基因，是导致肿瘤发生的重要分子基础，其编码产物可以在动物体内导致肿瘤发生，或使培养细胞发生恶性转化。19、抑癌基因：是一类存在于细胞内，对细胞生长具有调节作用的基因，具有潜在的抑癌作用。（如果这类基因发生突变而失活，可以引起细胞恶性转化而导致肿瘤发生。）20、病毒癌基因：是存在于某些致癌病毒基因组中的癌基因，包括转导逆转录病毒的癌基因和致癌DNA病毒的癌基因，其中转导逆转录病毒的癌基因来源于原癌基因。广义的癌基因是原癌基因（细胞癌基因）、癌基因和病毒癌基因的统称。21、蛋白质组学：是通过应用组学技术，研究一定条件下的蛋白质组，包括组成、结构规律、分布、相互作用、功能和条件变异等，建立和应用蛋白质信息数据库。蛋白质组：即一个个体、一种组织、一种细胞或一种细胞器在一定的生理或病理状态下所拥有的全部蛋白质。P333 简答题1、根据被测定的对象，简述分子杂交印迹的种类及其特点、应用上优缺点分为DNA印迹法和RNA印迹法。DNA印迹法还包括斑点印迹法、夹缝印迹法、菌落杂交法和噬菌斑杂交法。由此衍生的有蛋白质印迹法。1）、DNA印迹法，要先电泳后变性、转移。RNA印迹法为先变性后电泳、转移。2）、RNase （核糖核酸酶）无处不在，可以将RNA降解为核苷酸，因而从制备RNA到分析都要绝对消除外源RNase的污染，并尽量抑制内源性RNase。 DNA印迹法则无此要求。3）、RNA印迹法不能采用碱变性，因为采用碱变性会导致RNA水解，所以只能采用甲醛、乙二醛、二甲基亚砜等变性。 （RNA印迹法可以用于定性或定量分析组织细胞内的总RNA或某一种特异RNA，特别是分析mRNA的长度和含量。）4）、斑点杂交法和夹缝杂交法的特点是用样量少、操作简便，提取的核酸不需要进行电泳和转移，但在同一张固定膜上可以点多个样本。5）、蛋白质印迹法也是由电泳分离、转移固定和检测分析等组成。 只能用电转移法进行转移。 用抗原-抗体反应检测目的蛋白.2、简述PCR引物设计原则.P2031）、引物长度。不应小于15nt，一般为15-30nt。2）、引物组成。G/C的含量以40%-60%为适宜；引物对的碱基组成要一致，以确保其最适退火温度一致。3）、引物结构。碱基应该是随机分布的，避免存在连续5个以上连续的嘌呤碱基或者嘧啶碱基序列；要避免引物内部形成影响退火的二级结构；引物之间不能存在互补序列，尤其是3端不能互补以免形成引物二聚体；引物3端不能修饰。（原因：3端是延伸的起点，决定扩增的效率和特异性，要求严格配对，特别是末端的两个碱基，最好是G/C。不过，引物3端不应有三个连续的G/C。）引物5端可以修饰。4）、引物特异性。引物与目的DNA扩增区以外序列（非特异扩增序列）的同源性不应超过70%。5）、引物浓度。一般为0.1-1molL。6）、引物质量。需要纯化，一般采用聚丙烯酰胺凝胶电泳或反向高效液相层析进行纯化。（原因：化学合成的引物中可能含有错误序列，这些序列会引起非特异性扩增）3、试述研究蛋白质组学的方法及意义。P333？1、方法：以蛋白质组为研究对象，从整体、动态和网络水平上对蛋白质进行研究。2、意义：蛋白质组研究是寻找疾病分子标记最有效的方法。为探索肿瘤、老年痴呆症等疾病的发生机制提供了新的方法。对病原微生物进行蛋白质组学分析，寻找致病因子并研制疫苗。推动新药的开发。蛋白质组研究不仅可以实现与基因组的衔接和确认，解读基因组天书，直接揭示生命活动的规律和本质；更可以研究人类重大疾患或病原体致病的物质基础以及发生和发展的病理机制。4、试述人类基因组计划的主要内容及意义。P341内容：(基本内容包括人类基因组作图与测序、模式生物组作图与测序、基因组信息采集与应用、相关伦理法律和社会等问题的研究、研究人员的培训、DNA分析技术的发展、技术转让及产业开发。)貌似主要内容等于核心内容：核心内容是解析人类基因组图谱，包括遗传图谱、物理图谱、基因图谱、序列图谱。意义：？人类基因组序列图谱的完成宣告了“功能基因组时代”的到来。功能基因组学研究基因结构，阐明所有基因产物的功能，研究基因表达的调控机制并绘制基因表达调控的网络图，在基因组水平上揭示生命的起源和进化。人类疾病相关的基因是人类基因组中结构和功能完整性至关重要的信息。对于单基因病，采用“定位克隆”和“定位候选克隆”的全新思路，导致了亨廷顿舞蹈病、遗传性结肠癌和乳腺癌等一大批单基因遗传病致病基因的发现，为这些疾病的基因诊断和基因治疗奠定了基础。对于心血管疾病、肿瘤、糖尿病、神经精神类疾病（老年性痴呆、精神分裂症）、自身5、原癌基因、癌基因、抑癌基因与细胞周期、细胞凋亡调控基因的关系1.原癌基因：1、ras基因一些生长因子如EGF和胰岛素可通过RTK（蛋白酪氨酸激酶受体）激活Ras蛋白，另一些生长因子如IL-2、3、5的受体无蛋白酪氨酸激酶活性，则通过激活PTK（细胞质基质蛋白酪氨酸激酶）而激活Ras蛋白。激活的Ras蛋白通过激活Raf和PI-3K途径调控细胞增殖和凋亡。2、mycMyc蛋白的N端含转录激活域。Myc蛋白参与正常细胞增殖、转化和分化的调控。高水平的Myc蛋白可以加速细胞生长。3、bcl-2一些原癌基因产物就是Cyclin一些原癌基因产物诱导Cyclin表达一些原癌基因产物调节CDK活性一些原癌基因产物是Cyclin，CDK底物2.癌基因：3.抑癌基因：1、Rb在G1期，蛋白是细胞周期抑制信号的集合点，低磷酸化的Rb蛋白阻止细胞G1/S期和G2/M期的过渡，从而抑制细胞分裂增殖。Rb蛋白通过对转录因子E2F的作用来调控细胞增殖和分化。2、p53野生型p53蛋白在维持细胞正常生长、抑制恶性增殖过程中起重要作用。促进DNA修复。3、p16蛋白既是细胞周期的有效调控者，又是抑制肿瘤细胞生长的关键因子。抑制CDK4，使Rb蛋白保持低磷酸化，抑制细胞从G1期向S期的过渡，从而抑制细胞增殖。4、nm23作为CDKI：p15、p16、p21和p27通过CDKI抑制细胞周期：p53，Rb扩增基因拷贝数的增加。原癌基因的扩增如果在不恰当的阶段发生，6、原癌基因被激活的，抑癌基因被抑制是如何发生的？P285原癌基因通过点突变、染色体重排、插入、缺失、扩增、去甲基化等机制激活成癌基因，其中以点突变最为常见。点突变、基因缺失、基因转换、有丝分裂重组、不分离(染色体丢失或加倍)7、试述细胞周期、细胞凋亡调控的分子机制1、bcl-2基因：可以抑制细胞凋亡，特别是抑制生发中心的B细胞凋亡。Bcl-2可以抑制由许多因素引起的细胞凋亡，如血清和生长因子的缺乏、膜脂质过氧化反应和Ca+通道激活剂、射线、化学药物的作用等。此外，Bcl-2能抑制p53诱导的细胞凋亡，并与Myc共同作用，抑制细胞凋亡，使细胞持续增生。2、p53：当DNA的损伤比较严重，超过了细胞的自我修复能力时，激活的p53通过诱导bax基因表达、抑制bcl-2基因表达等途径诱导细胞凋亡，清除损伤细胞，以保持正常的器官功能。3、凋亡抑制蛋白（IAP）家族：主要通过两个途径抑制细胞凋亡：一是直接抑制Caspases的活化；二是与TNF受体相关因子结合，激活NF-kB，使细胞表达生存必需的基因。4、病毒蛋白：许多病毒及其基因产物对宿主细胞凋亡具有重要的调节作用，一方面一些病毒在感染期间能够诱发细胞凋亡；另一方面一些病毒进化出抑制被感染细胞凋亡的机制，加速和维持感染，以产生更大量的子代病毒，如腺病毒编码的E1A蛋白既能激活静止期细胞进入细胞增殖期，又能在增殖受阻时促进细胞凋亡。而E1A的表达受P53的调控，同时E1A诱导的P53介导的细胞凋亡被腺病毒E1B蛋白抑制。8、试从细胞周期、凋亡调控的角度论述肿瘤的发生（试从细胞周期调控的角度论述肿瘤的发生）在正常情况下，高等动物细胞只有在受到生长因子的刺激时才发生分裂，这些生长因子是由其它细胞分泌的。肿瘤细胞恶性增生的一个重要原因是某些基因发生突变，导致细胞不需生长因子刺激就发生分裂，不再受正常的细胞增殖调控系统约束。这些基因的正常表达产物大都为信号转导蛋白，通过信号转导途径调控细胞的生长、分化和凋亡。这些基因的表达一旦出现异常，就会使生长信号的转导失控，最终导致细胞转化或癌变。1、Northern blot/Southern blot/western blot的的原理、操作过程及其应用。2、基因诊断和基因治疗的基本方法策略。 论述题1、已知某低等生物基因序列，如何克隆人细胞内与其同源的基因（包含启动子、外显子及内含子等序列）。2、肿瘤发生常常由于突变引起，那么，如何找出病人那些基因发生突变？另外，有些肿瘤患者肿瘤细胞根本就没有基因突变，原因为何？此时，我们如何找到肿瘤发病机制。3、已知蛋白质序列，如何克隆与其对应的基因（包含启动子、外显子及内含子等序列）。4、我们知道帕金森病是神经细胞退行性疾病，也就是细胞凋亡引起，凋亡时caspase蛋白会切割大量蛋白底物，目前，我们还不知道凋亡时caspase切割了那些蛋白，请用蛋白质组学提出实验方案寻找到那些蛋白被caspase切割了。 1、基因组测序发展迅猛，我们已经获取了人类和其它一些生物的基因组序列，那么，我们如何认识这些序列？从全基因组我们可以获取那些信息？ 2、诸多疾病内源受多基因调控，因此找出与疾病发生发展相关的关键基因对于疾病诊断和治疗至关重要。请提出两种策略筛选出某疾病相关的靶基因。3、你对转基因食品态度如何？说明理由。4、基因的概念，什么是基因克隆，请提出三种克隆基因的策略？5、基因序列已知后，弄清其功能才是问题的关键。请提出策略如何探索目的基因的功能？ 二、简答题(共2小题，每小题5分，共10分)1、Northern blot/Southern blot/western blot的的原理、操作过程及其应用。Southern Blotting：P187原理：即DNA印迹法，凝胶电泳分离待测DNA并转移固定到结合物上，然后与探针/抗体杂交分析的技术。应用：分析DNA长度、DNA指纹、DNA多态性、限制酶图谱。基因突变和基因扩增的等，从而应用于基础研究和基因诊断。过程:样品制备电泳分离变性印迹固定预杂交杂交洗膜分析 Northern Blotting：原理：即RNA印迹法，是指将RNA样品完全变性，通过琼脂糖凝胶电泳按分子大小分离，然后转移到固相膜上，固定后与探针进行杂交。应用：检测RNA操作过程：类似Southern印记杂交，主要区别是在变性剂存在下，以琼脂糖凝胶电泳分离RNA。Western Blotting：原理：即Western印迹法，是将获得的蛋白质样品通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，对不同分子量的蛋白质进行分离，然后通过转移电泳将凝胶上分离到的蛋白质转印到固相支持物上，固定后与探针进行杂交并分析。 Western Blot与Southern印迹杂交或Northern印迹杂交方法类似，但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素膜NC膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。 2、基因诊断和基因治疗的基本方法策略。基因治疗的基本方法和策略：基因修复/矫正、基因置换、基因增补/修饰、基因失活：RNAi和基因敲除、自杀基因：单纯疱疹病毒胸苷激酶基因HSV-tk(丙氧鸟苷GCV-磷酸化GCV)。基因诊断常用的技术和方法：1）、核酸分子杂交技术（具体方法有印迹杂交 (包括Southern 和Northern 印迹杂交)、 斑点杂交 (Dot blot) 和原位杂交 (In situ blot)等。）、2）、PCR技术、3）、基因芯片技术、4）、DNA测序。3、简述PCR引物设计原则。1）、引物长度。不应小于15nt，一般为15-30nt。2）、引物组成。G/C的含量以40%-60%为适宜；引物对的碱基组成要一致，以确保其最适退火温度一致。3）、引物结构。碱基应该是随机分布的，避免存在连续5个以上连续的嘌呤碱基或者嘧啶碱基序列；要避免引物内部形成影响退火的二级结构；引物之间不能存在互补序列，尤其是3端不能互补以免形成引物二聚体；引物3端不能修饰。（原因：3端是延伸的起点，决定扩增的效率和特异性，要求严格配对，特别是末端的两个碱基，最好是G/C。不过，引物3端不应有三个连续的G/C。）引物5端可以修饰。4）、引物特异性。引物与目的DNA扩增区以外序列（非特异扩增序列）的同源性不应超过70%。5）、引物浓度。一般为0.1-1molL。6）、引物质量。需要纯化，一般采用聚丙烯酰胺凝胶电泳或反向高效液相层析进行纯化。（原因：化学合成的引物中可能含有错误序列，这些序列会引起非特异性扩增）人类基因组计划的主要内容及意义。内容：(基本内容包括人类基因组作图与测序、模式生物组作图与测序、基因组信息采集与应用、相关伦理法律和社会等问题的研究、研究人员的培训、DNA分析技术的发展、技术转让及产业开发。)貌似主要内容等于核心内容：核心内容是解析人类基因组图谱，包括遗传图谱、物理图谱、基因图谱、序列图谱。意义：？人类基因组序列图谱的完成宣告了“功能基因组时代”的到来。功能基因组学研究基因结构，阐明所有基因产物的功能，研究基因表达的调控机制并绘制基因表达调控的网络图，在基因组水平上揭示生命的起源和进化。 人类疾病相关的基因是人类基因组中结构和功能完整性至关重要的信息。对于单基因病，采用“定位克隆”和“定位候选克隆”的全新思路，导致了亨廷顿舞蹈病、遗传性结肠癌和乳腺癌等一大批单基因遗传病致病基因的发现，为这些疾病的基因诊断和基因治疗奠定了基础。对于心血管疾病、肿瘤、糖尿病、神经精神类疾病（老年性痴呆、精神分裂症）、自身简述原癌基因、癌基因、抑癌基因的作用，及它们与细胞周期、细胞凋亡调控基因的相互关系。1.原癌基因：又称细胞癌基因，是病毒癌基因的同源序列，是存在于正常细胞基因组中的一种正常基因，其功能是调控细胞生长和变化，癌基因：是原癌基因激活后成为癌基因，是导致肿瘤发生的重要分子基础，其编码的产物可以在动物体内引起肿瘤的发生，使培养细胞发生恶性转化。1）、ras基因：ras是第一个在人体肿瘤内被鉴定的癌基因。一些生长因子通过RIK或PIK途径激活Ras蛋白，由Ras蛋白激活Raf和PI-3K途径调控细胞增值和凋亡。2）、mycMyc是细胞生长和分化的促进因子，高水平的Myc可以促进细胞生长和推动细胞周期。3）、bcl-2 一些原癌基因产物就是Cyclin 一些原癌基因产物诱导Cyclin表达一些原癌基因产物调节CDK活性，从而调节细胞周期和细胞凋亡。2.抑癌基因：是一类存在于正常细胞中调控细胞生长的基因，具有潜在的抑癌作用。1）、Rb(RB1):是第一被鉴定和克隆的抑癌基因。在G1期，低磷酸化的Rb蛋白（是细胞周期抑制信号的集合点）通过对转录因子E2F的作用，使细胞停滞于G1期，起到调控细胞增值和分化的作用。2）、p53（TP53）野生型p53蛋白在维持细胞正常生长、抑制恶性增殖过程中起重要作用。促进DNA修复。3、p16蛋白既是细胞周期的有效调控者，又是抑制肿瘤细胞生长的关键因子。抑制CDK4，使Rb蛋白保持低磷酸化，抑制细胞从G1期向S期的过渡，另外还可以通过稳定抑癌蛋白P53而抑制细胞增殖。三、论述题(3小题中任选2题回答，共15分)1、基因组测序发展迅猛，我们已经获取了人类和其它一些生物的基因组序列，那么，我们如何认识这些序列？从全基因组我们可以获取那些信息？ 2、诸多疾病内源受多基因调控，因此找出与疾病发生发展相关的关键基因对于疾病诊断和治疗至关重要。请提出两种策略筛选出某疾病相关的靶基因。3、你对转基因食品态度如何？说明理由。4、基因的概念，什么是基因克隆，请提出三种克隆基因的策略？基因：是由核酸的一些特定的碱基序列构成的表达遗传信息的功能单位，主要存在于染色体上，其编码的功能产物是肽链或RNA。基因克隆：是把外源基因与克隆载体进行体外连接，继而转化宿主细胞，筛选出含有目的基因重组质粒的转化子。基因克隆的策略：大致可分为表型克隆、定位克隆和侯选定位克隆三种。表型克隆利用病变组织与正常组织DNA或RNA水平上的差异，进行疾病相关基因的分离与克隆，由于直接联系疾病的表型与基因，故称为表型克隆；定位克隆首先是获取基因在染色体上的位置信息，然后采用各种方法对该基因进行定位和克隆；侯选定位克隆是对定位克隆的改进，该方法首先将致病基因定位到某一染色体区域，然后再找出区域内的所有基因，根据这些基因的生化特性、表达时空特异性、功能结构域等筛选与疾病相关的侯选基因，从中确定致病基因。5、基因序列已知后，弄清其功能才是问题的关键。请提出策略如何探索目的基因的功能？