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生物化学综述

题目： 蛋白质泛素化修饰及其应用
院系： 生命科学技术学院
专业： 生物化学与分子生物
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蛋白质泛素化修饰及其应用

摘要：泛素-蛋白酶体系统(Ubiquitin-proteasome system, UPS)介导了真核生物80%~85%的蛋白质降解,该蛋白质降解途径具有依赖 ATP、高效、高度选择性的特点。除参与蛋白质降解之外,泛素化修饰还可以直接影响蛋白质的活性和定位。由于泛素化修饰底物蛋白在细胞中的广泛存在,泛素化修饰可以调控包括细胞周期、细胞凋亡、转录调控、DNA 损伤修复以及免疫应答等在内的多种细胞活动。p53、NF－κB 和 GADD45α 是在细胞应激损伤反应中具有广泛调控作用的信号蛋白，发生在这些分子上的泛素化修饰反应是它们发挥相关分子机制的重要基础。
关键词：泛素化；p53；NF－κB；GADD45α；细胞应激

1 蛋白质的泛素化修饰反应
1.1泛素及泛素化
泛素(Ubiquitin)是一种由 76 个氨基酸构成、在真核生物中广泛存在并具有高度保守性的多肽[1]。一个或多个泛素分子在一系列酶的作用下与底物蛋白质分子共价结合的翻译后修饰过程称为泛素化修饰(Ubiquitination/Ubiquitylation)。泛素化修饰最早被发现的功能是标记靶蛋白,使之被蛋白酶体识别并降解,整个过程涉及泛素分子、底物蛋白、多种酶系统(如泛素激活酶(Ubiquitin-activating enzyme,E1)、泛素结合酶(Ubiquitin-conjugating enzyme, E2)、泛素连接酶(Ubiquitin-protein ligase, E3)、去泛素化酶(Deubiquitinating enzyme, DUB)), 以及蛋白酶体,它们共同构成了泛素-蛋白酶体系统(Ubiquitin-pro-easome system, UPS)。泛素-蛋白酶体系统介导了真核生物体内80%~85%的蛋白质降解,该蛋白质降解途径具有依赖ATP、高效、高度选择性的特点。
泛素化修饰是一种重要的翻译后修饰, 其扮演的角色远比最初认识的要多得多,还参与调控诸如转录因子活性、逆转录病毒的出芽、受体的内吞作用和溶酶体的运输、胰岛素水平和TGF-β通路等。研究表明泛素化修饰的作用已不仅仅局限于介导蛋白质的降解[2,3], 泛素化修饰还可以直接影响蛋白质的活性和定位。蛋白质修饰及降解贯穿几乎所有细胞活动,包括基因表达、细胞增殖、分化、衰老、凋亡和自噬,也调控着个体的生长、发育和衰老。蛋白质的调控异常往往伴随着个体的发育异常或疾病的发生,与各种人类重大疾病的发生、发展、诊断和治疗密切相关。由于底物蛋白广泛存在于细胞中,泛素化修饰调控的细胞活动主要包括细胞周期、细胞凋亡、转录调控、DNA 损伤修复及免疫应答等。

1.2泛素化修饰条件
泛素化修饰反应有3种不同的类型：单泛素化（mono－u-biquitination）， 即单个泛素分子结合到底物蛋白的Lys 残基，单泛素化的底物还能进一步被多泛素化；多个单泛素（multiplemonoubiquitination），即底物蛋白质的多个 Lys 残基同时被多个单泛素分子标记；多聚泛素化（polyubiquitination），即由数个泛素分子形成的泛素链 C 端的 Gly 与单泛素化底物特异性结合。蛋白质的泛素化修饰反应的重要生物学效应之一是介导靶蛋白进入26S蛋白酶体实现降解反应；另外，泛素化修饰反应最近也被证实是蛋白质功能调控的一种崭新模式[4]。无论是哪种效应，泛素化修饰反应在众多细胞生命过程中都发挥了重要的调节作用，如细胞凋亡、细胞周期控制、细胞应激反应（如感染、热激、紫外线刺激、氧化损伤）等。蛋白质的泛素化修饰反应首先是由蛋白质本身的一级结构特征决定的。蛋白质通常需要包含能被泛素系统识别的一级序列才能被修饰。如（Pro－Glu－Ser－Thr（PEST）四肽结构域被认为是靶蛋白上决定泛素化修饰反应发生的重要保守序列。另外，一些包含能被磷酸化的Ser和Thr残基的氨基酸序列（DpSGIHpS，LPpTPP）也被先后鉴定为决定蛋白质进入泛素化修饰途径的结构基础，并逐步明确了“泛素化修饰通常与磷酸化反应相偶联”的作用模式。除此之外，Varshavsky[5]的实验结果表明，蛋白质的泛素化与其N端序列有关，从而提出了N端规则，即通过蛋白质N 端的氨基酸来预测它的半衰期。蛋白质决定N端识别的因子，称为 N－降解决定子（N－degron），但N－degron 启动并标记泛素的机制还不清楚。某些情况下能被泛素系统识别的信号可能隐藏在疏水核中或被掩盖，那么通常这些蛋白就不能实现泛素化修饰。

1.3泛素化反应机理
泛素化修饰反应由E1的作用起始。泛素分子在E1的作用下活化，E1能够利用 ATP 提供的能量在泛素C端 Gly残基上的羧基集团与它自身的 Cys 残基上的巯基集团间形成高能硫酯键。激活的泛素通过转酰基反应再被转移到E2的Cys残基的巯基上。最终激活的泛素或者通过E2直接连到蛋白底物上，或是与E3共同作用在泛素分子 Gly76的C端和靶蛋白 Lys 残基的ε－氨基之间形成氨基异肽键。泛素被转移到与E2 结合的E3上，并通过相似的异肽键连接到靶蛋白Lys残基的ε－氨基上，就是单泛素化修饰反应。重复这个过程即可以形成多泛素化修饰反应。需要说明的是，泛素分子上包括7个 Lys 残基，分别位于6、11、27、29、33、48 和 63 位，目前研究较多的是Lys48和 Lys63参与的泛素化修饰反应。研究表明，与Lys48结合的多泛素链能够介导泛素化底物进入26S蛋白酶体降解途径；而与Lys63结合的多泛素链介导的泛素化反应不能诱导底物蛋白的降解，而是对蛋白质的功能产生调控作用，并在DNA损伤修复、炎症反应和核糖体蛋白的合成中发挥重要效应。细胞一般表达单一E1、约60种E2和近400种E3，而泛素化修饰反应的特异性主要由靶蛋白与其对应的特定E3发生结合的情况而决定。根据其结构特征，E3酶主要分为HECT家族（homologous toE6－AP carboxy terminus）、Ring－finger家族（reallyinteresting new gene）两大类。HECT家族E3酶的发现源于对与宫颈癌发病密切相关的人乳头瘤病（humanpapillomavirus，HPV）的研究。最初的研究发现，细胞中表达的E6－AP（E6 associated protein）能够与 HPV 编码的E6癌蛋白结合，二者形成的复合物能够介导 p53 的泛素化修饰反应，并最终导致p53 进入蛋白酶体降解途径。对 HECT 家族E3酶的研究还表明，有些E3酶能够作用于多种不同的蛋白质底物，说明它们可通过其他辅助因子的作用取得底物特异性。Ring－finger 家族 E3酶的一级结构通常包含由38个Cys和 His 残基组成的保守序列 Cys－X2－Cys－X（9－39）－Cys－X（1－3）－His－X（2－3）－Cys－X2－Cys－X （4－48）－Cys－X2－Cys，X代表任意一种残基），这一序列可形成环指结构[6]。
含有环指的蛋白质也是许多亚基 E3 酶的重要组成部分。常见的环指类E3酶有 SCF 复合体、VHL－CBC 复合体和 APC复合体等。其中SCF类E3酶是由至少 4种多肽组成的复合体，包括连接蛋白 Skp、Cullin 类蛋白 CulⅠ、底物识别蛋白 F－box 和含有一个 RINGH2 型结构域的 Rbx1（RING box 1）。目前已发现超过100种F－box 蛋白质，它们通常含有参与蛋白质－蛋白质相互作用的WD40重复序列或富Leu重复序列。SCF类E3 酶可利用不同的F－box蛋白质识别多种底物，甚至有时一种 F－box 蛋白质能识别多种不同的底物。
在细胞应激反应过程中涉及多种分子的泛素化修饰反应及其相关的蛋白质功能调控作用。以下将以 p53、NF－κB、GADD45α 为例，讲述蛋白质的泛素修饰反应在细胞应激反应过程中的关键作用。

2 泛素化的应用中的调控模式和几种重要因子及发展
2.1 p53 在细胞应激反应中的调控模式
p53是一种在细胞应激损伤条件下（如 DNA 损伤、缺氧、癌基因表达等）对维持基因组稳定性具有核心调控作用的转录因子型抑癌蛋白。其功能主要表现为通过诱导或抑制p53下游靶基因表达，介导应激损伤信号刺激作用下的细胞保护效应，如细胞周期行进抑制、DNA 损伤修复、诱导细胞进入衰老或凋亡状态等。在静息状态和细胞应激反应过程中，p53的表达水平主要由泛素化系统介导的翻译后修饰反应所控制。通常在正常细胞中，组成性合成的 p53 能够被迅速泛素化并进入26S蛋白酶体实现降解反应，所以正常细胞内的 p53水平极低。
Mdm2是催化p53实现泛素化修饰反应的关键 E3泛素化连接酶[7]。Mdm2 能够诱导 p53 的单泛素化和多泛素化修饰反应。[8] 当 Mdm2 低水平表达时，它能够催化 p53 实现单泛素化反应，并使之出核降解或在细胞质中进行进一步修饰；当Mdm2高水平表达时，p53 很快在核内实现多泛素化修饰反应，并进而被核蛋白酶体降解。在细胞应激损伤反应初期，细胞内的p53水平显著增高，活化的 p53 进一步诱导 Mdm2 表达水平升高；在 DNA 损伤反应后期，高水平的 Mdm2 可催化p53实现泛素化修饰反应并快速降解。这种 p53－Mdm2 的反馈作用机制能够实现对 p53 表达水平和功能的精确调控。虽然 Mdm2在 p53 的泛素化过程中具有非常重要的作用，但越来越多的证据表明，其他几种泛素连接酶也能够参与 p53 的泛素化降解反应。ARF－BP、COP1、Pirh2、TOPORS和 NIRF都具有E3酶活性，它们能够通过 Mdm2 非依赖途径使p53发生泛素化而降解，因此在 p53 的功能调节中亦发挥重要作用。

2.2 NF－κB 在细胞应激反应中的多种泛素化修饰作用
NF－κB 是一种分布与作用均十分广泛的真核细胞转录因子。 它可被多种外界刺激信号活化，参与细胞增殖、分化、凋亡、炎症等多种条件下的基因调控，具有十分重要的生理和病理作用。NF－κB 在诱导活化和发挥生物学功能过程中受到了泛素化修饰反应的精确调控。NF－κB 家族包括 5 种功能相关的蛋白亚基，分别是 p50（NF－κB1）、p52（NF－κB2）、p65（RelA）、c－Rel（Rel）和 RelB，它们之间可形成同型或异型二聚体。在细胞静止状态时，NF－κB通过与其抑制子 IκB结合，使 NF－κB以非活性的形式被阻滞在细胞浆中。NF－κB的诱导活化可通过经典途径和替代途径实现。 经典途径中，在某些应激信号如 TNF－α和IL－1刺激下，可通过特定信号通路激活 IκB 激酶（IKK）复合物。活化的 IKK 使 IκBα N 端的 Ser32和Ser36被磷酸化， 随后启动 IκBα的泛素化修饰反应并进入26S蛋白酶体降解。IκBα降解后使 NF－κB得以释放并转位到细胞核内，进而调节 NF－κB 下游靶基因的表达。 IκBα 的泛素化修饰由E2家族的UBC4／5[9]和SCF－βTrCP E3连接酶[10]执行。哺乳动物中的2种βTrCP蛋白（βTrCP1 和 βTrCP2）通过它们C端WD40重复序列连接到磷酸化后的 IκBα上，使 IκBαN 末端保守的 Lys21和 Lys22处形成 Lys48连接的多聚泛素化修饰反应。B细胞刺激因子（Bcell activating factor belonging to the TNF－family，BAFF）等主要以替代途径激活 NF－κB。BAFF与其受体 BAFF－R结合后可激活NIK激酶，后者能够催化 IKKα 活化，并使 NF－κB p100发生磷酸化和泛素化依赖的诱导性剪切反应，释放成熟p52亚基，并进一步与RelB形成复合物, 调控相应的NF－κB靶基因表达。由此可见，泛素化修饰反应在 NF－κB两条通路诱导激活过程中具有关键作用。另外，发生在 NEMO、TRAF 等分子上的多泛素化 修 饰 对NF－κB 信号通路的活化调控也至关重要.

2.3 GADD45α 泛素化调控的新机制研究
GADD45家族是一类能够在细胞应急损伤反应过程中参与细胞周期调控、细胞凋亡反应和维持基因组稳定性的重要信号分子，同时也是一类在肿瘤发生和发展过程中具有关键调控作用的肿瘤抑制因子，目前发现主要包括α、β 和 γ 等3个成员。近几年来，有关该家族分子的基因表达调控和多样性生物学效应机制研究一直倍受瞩目。

结语
泛素－蛋白酶体途径是调节细胞内应激反应过程中蛋白质表达水平与功能的重要机制，在越来越多的细胞生命过程已证实有泛素系统的参与，对维持细胞的稳态有十分重要的意义。该途径在20 世纪 80 年代初首先被 Hershko、Ciechanover 和 Rose所认识，3 人以此项成果共享 2004 年诺贝尔化学奖。随着蛋白质泛素化调控机制研究的逐步深入，一些新问题出现，成为该领域的研究热点和关键，例如泛素－蛋白酶体途径如何对蛋白质降解信号进行识别以及它们被标记的具体机制，E3酶结合泛素链的方式等。另外，泛素蛋白酶体途径的功能失常与许多疾病的发生存在密切联系，因此其临床医学意义越发受到重视。泛素化途径深层机制的揭示，不仅能够提供重要的基础理论创新性研究发现，同时也将展现出重要的医学价值。

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