重组新城疫病毒rL-RVG通过p53-YAP1-ACSL4通路诱导肺腺癌细胞铁死亡.pdf

论著(基础研究)重组新城疫病毒 rL-RVG 通过 p53-YAP1-ACSL4 通路诱导肺腺癌细胞铁死亡何瑛珏,李 洋,田仪督,贡克文,严玉兰 摘要 目的 旨在探究重组新城疫病毒 rL-RVG 是否通过 p53-YAP1-ACSL4 通路影响肺腺癌细胞铁死亡。方法体外培养人肺腺癌细胞系 A549、PC9,将处于对数增殖期的细胞分为对照组(NC 组)、新城疫病毒感染组(NDV 组)、重组新城疫病毒感染组(rL-RVG 组)、铁死亡诱导剂组(Erastin 组)及铁死亡抑制剂组(NAC 组)。在病毒感染和铁死亡诱导剂、抑制剂干预后,通过 CCK-8、划痕实验和 Transwell 来检测细胞的功能学变化,包括细胞活力、迁移能力和侵袭能力;光学显微镜观察细胞形态改变。使用流式细胞术和荧光显微镜来测定细胞中 ROS 的含量,用酶标仪对 MDA 含量进行测定,通过 Western blot和实时荧光定量 PCR 来检测铁死亡相关蛋白 p53、YAP1 及 ACSL4 的表达。结果与 NC 组相比,rL-RVG 组细胞生长、迁移及侵袭能力明显下降(P0.01);ROS 及 MDA 水平升高且与铁死亡诱导剂组相比含量显著提高(P0.01),铁死亡抑制剂干预后含量均减少(P0.01);铁死亡关键蛋白 p53、YAP1、ACSL4 表达量明显升高(P0.01);Si-RNA 敲减 YAP1 和 ACSL4 后相应蛋白的表达量减少(P0.01),并且 ROS 和 MDA 含量均减少(P0.01)。结论rL-RVG 可以有效地阻止肺腺癌细胞的增殖、迁移和扩散,并且能够通过 p53-YAP1-ACSL4 轴增加脂质过氧化物和细胞活性氧的含量,最终诱导肿瘤细胞铁死亡。关键词 重组新城疫病毒;肺腺癌;铁死亡;YAP1;ACSL4 中图分类号 R734.2;R329.2 文献标志码 A 文章编号 2097-2768(2024)01-0014-09 DOI 10.16571/ki.2097-2768.2024.01.003基金 项 目:广 东 省 基 础 与 应 用 基 础 研 究 基 金(2024A1515012336)作者单位:212013 镇江,江苏大学医学院(何瑛珏、李洋、田仪督、贡克文);518053 深圳,香港大学深圳医院呼吸内科(严玉兰)通信作者:严玉兰,E-mail:ylanyan2005 Recombinant Newcastle disease virus rL-RVG induces ferroptosis in lung adenocarcinoma cells through the p53 YAP1-ACSL4 pathwayHE Yingjue1,LI Yang1,TIAN Yidu1,GONG Kewen1,YAN Yulan2(1.Medical College of Jiangsu University,Zhenjiang 212013,Jiangsu,China;2.Department of Respiratory Medi-cine,The University of Hong Kong-Shenzhen Hospital,Shenzhen 518053,Guangdong,China)Abstract Objective The purpose of this study is to explore whether the recombinant Newcastle disease virus rL-RVG af-fects ferroptosis in lung adenocarcinoma cells through the p53 YAP1-ACSL4 pathway.Methods A549 and PC9 cell lines were cul-tured in vitro and cells in logarithmic proliferation were divided into control group(NC),Newcastle disease virus infection group(NDV),recombinant Newcastle disease virus infection group(rL-RVG),ferroptosis inducer group(Erastin)and ferroptosis inhibitor group(NAC).After viral infection and intervention with ferroptosis inducer and inhibitor,we determined the functional changes of cells,including cell vitality,migration ability,and invasion ability,using CCK-8,scratch experiments,and Transwell,and observed morphological changes in cells through optical microscopy.In addition,we used flow cytometry and fluorescence microscopy to deter-mine the content of ROS in cells,and used enzyme-linked immunosorbent assay to measure MDA content,and used Western blot and real-time PCR to detect the expression of ferroptosis related proteins p53,YAP1,and ACSL4.ResultsCompared to NC group,a significant decrease of cell growth,migration,and invasion of rL-RVG group was observed(P0.01).ROS and MDA levels were significantly augmented(P0.01).The levels of ROS and MDA in-creased significantly compared to the ferroptosis inducer group(P0.01),while the content of ferroptosis inhibitor decreased after inter-vention(P0.01).The expression of ferroptosis key proteins p53,YAP1,and ACSL4 were significantly augmented(P0.01).After 41医学研究与战创伤救治2024 年1 月 第37 卷 第1 期 J Med Res Combat Trauma Care,Vol.37,No.1,January,2024knocking down YAP1 and ACSL4 by Si-RNA,the level of corresponding proteins were decreased(P0.01),and the content of ROS and MDA were also decreased(P0.01).Conclusion rL-RVG can effectively prevent the proliferation,migration,and diffusion of lung adenocarcinoma cells,and increase the content of lipid peroxides and cellular reactive oxygen species through the p53 YAP1-ACSL4 axis,ultimately promoting ferroptosis of tumor cells.Key words rL-RVG;lung adenocarcinoma;ferroptosis;YAP1;ACSL40 引 言 肺癌已成为全球癌症患者的首要威胁,导致的死亡人数比乳腺癌、前列腺癌、结直肠癌的总和都要多,每天大约 350 例患者死于肺癌,肺癌的患者比例也在持续上升,目前肺癌已成为全球第一大癌症1。肺癌一般分为小细胞肺癌和非小细胞肺癌,其中非小细胞肺癌的患者比例更为突出,按其病理形态又可分为:肺鳞癌、肺大细胞癌及肺腺癌等。肺腺癌是此类肺癌中最常见的类型,且具有高度的异质性和恶性2。除手术及放化疗外,抗癌药物触发凋亡使细胞死亡也是杀死癌细胞的经典方法3。然而,细胞凋亡治疗肿瘤的效果有限,随着癌细胞耐药性的逐年上升,许多新的细胞死亡过程被发现。铁死亡作为一种全新的细胞死亡机制开始被认识,它的主要表现形式就是由于铁的代谢而导致的致死性的脂质过氧化产物的积聚4。近期研究表明,铁死亡在肺癌的发生发展具有至关重要的意义5,通过诱导肺癌细胞铁死亡可能会被视为一种抗肺癌治疗的新策略。新城疫病毒(newcastle disease virus,NDV)具有高度的特异性,它能够通过营养剥夺、吞噬铁蛋白等机制诱导肿瘤细胞铁死亡6。研究证明 NDV 可通过上调胶质瘤细胞中 p53 的表达和抑制 Xc-系统诱导脑胶质瘤细胞铁死亡7。而稳定表达狂犬病毒糖蛋白的重组新城疫病毒(recombinant newcastle disease virus with stable expression of rabies virus gly-coprotein,rL-RVG)不仅可以发挥 NDV 的溶瘤效应,还可以发挥狂犬病毒糖蛋白的 N 受体阻断效应,它的抗癌能力显著优于 NDV8。本课题组前期实验已经验证 rL-RVG 在抑制人肺腺癌细胞增殖过程中可能发挥类似铁死亡诱导剂 Erastin 作用,但rL-RVG 导致肺腺癌细胞铁死亡的相关机制尚不明确,故本研究旨在探讨重组新城疫病毒 rL-RVG 诱导人肺腺癌细胞铁死亡的部分机制研究。1 材料与方法1.1 材料 人肺腺癌细胞系 A549、PC9,人正常支气管上皮细胞 BEAS-2B(中国科学院上海生物科学研究院细胞中心);rL-RVG 和 NDV(哈尔滨兽医研究所);RPMI 1640 培养基和胎牛血清(Gibco 公司);脂质过氧化(MDA)检测试剂盒(碧云天生物公司);活性氧检测试剂盒(江苏凯基生物);BCA 蛋白定量试剂盒(南京福麦斯生物技术有限公司);兔抗 YAP1、ACSL4 抗体(Boster 公司);鼠抗 p53(CST 公司);鼠抗-actin 抗体、羊抗鼠和羊抗兔二抗(武汉三鹰生物技术有限公司);SiRNA-YAP1、SiRNA-ACSL4(吉玛基因);CCK8 试剂盒、RNA 快速提取试剂盒、反转录试剂盒、SYBR qPCR Master Mix(均南京诺唯赞生物科技有限公司)。1.2 方法1.2.1 细胞的培养与分组在恒温恒湿的环境下(37,5%CO2,100%的湿度)培养人肺腺癌细胞A549 和 PC9。待细胞长至 80%90%时,进行传代和铺板等处理。用病毒来感染细胞,将人肺腺癌细胞 A549、PC9 分为对照组(NC 组)、NDV 组(MOI=5)、rL-RVG 组(MOI=5)、Erastin 组(5 mol/L)、rL-RVG(MOI=5)+Erastin(5 umol/L)处理组、NAC 组(5 mol/L)、rL-RVG(MOI=5)+NAC(5 mol/L)处理组、Si-NC 对照组、SiRNA-YAP1 干预组、SiRNA-YAP1+rL-RVG 处理组、SiRNA-ACSL4 干预组、SiR-NA-ACSL4+rL-RVG 处理组进行培养用于后续实验。1.2.2CCK-8法检测细胞增殖能力 在 96 孔板上接种细胞(1000 个/孔),加入 100 L 含 10%胎牛血清的 RPMI1640 培育基,置于恒温恒湿的培养箱中培养,显微镜下观察细胞状态,贴壁后按照不同的病毒感染复数(MOI=1、3、5、10)进行处理,继续在细胞培养箱里进行培育,每个处理组都设置 3 个复孔。在 0、24、48、72 h 4 个时间段进行处理,每孔加入 10 L CCK8 试剂,避光培养 1 h 后使用酶标仪在 450 nm 波长处对样本进行吸光度检测,以确定不同时间段样本的细胞活性。公式如下:细胞活力(%)=(测量值-空白值)/(对照值-空白值)100%1.2.3 细胞划痕实验检测迁移率根据不同实验组将细胞悬液接种于 6 孔板中,每组设置 3 个复孔;当细胞贴壁增殖汇合至 70%80%时弃去板内原培养基,用 PBS 清洗 3 次,病毒感染后以 10 L 枪头51医学研究与战创伤救治2024 年1 月 第37 卷 第1 期 J Med Res Combat Trauma Care,Vol.37,No.1,January,2024从孔板的底部开始沿着每个孔的中心横和纵方向画出一条直线。将 6 孔板放置于细胞培养箱中继续培养,显微镜下分别拍照记录 0 h、24 h 直线宽度,计算细胞迁移率。公式如下:细胞迁移率(%)=(0 h 宽度-24 h 宽度)/0 h 宽度100%1.2.4Transwell细胞侵袭实验 Matrigel 基质胶经过(110)的稀释,把它均匀地平铺于 Transwell 的各个小室,置于 37 的环境 2 h 时使其变成凝胶状。使用 NDV、rL-RVG 感染肺腺癌 A549、PC9 细胞 24 h后,将细胞中的培养基更换成无血清培养液,饥饿12 h 消化细胞后用含 5%血清的培养基重悬,细胞密度控制在 5105/mL,向上室中加 200 L 上述细胞混合液,下室加入800 L 含20%血清的细胞培养基,继续放置在 37 细胞培养箱,孵育 24 h,倒掉Transwell 小室中的培养液,PBS 清洗 3 次,用 4%的多聚甲醛溶液固定,经过 0.5 h 的处理,将其脱离,使用 0.1%的结晶紫溶液染色 10 min 后取出,并用PBS 清洗小室中残留的染液,最后使用棉签轻轻地擦拭掉小室上层中没有穿透进入小室底的细胞,尽量减少对小室外观的破坏,以便更准确的分离和检测。在 200 倍倒置相差显微镜下记录视野中的细胞数并进行统计分析。实验均 3 次重复。1.2.5ROS的检测 流式细胞术:根据剂盒产品说明书,将不同处理组细胞置于 6 孔板(1 106/孔)中培养过夜。胰酶消化离心收集细胞后 PBS 洗涤 2次,37 下悬浮于 200 mL DCFH-DA 工作溶液中约30 min,离心收集细胞后继续用 PBS 洗涤两次,用400 L PBS 重悬,使用流式细胞仪在 485 nm 的激发波长下检测细胞内 ROS 的水平。对于每组样品,评估大约 20 000 个细胞。设置 3 组重复进行。ROS 荧光强度测定:6 孔板中接种细胞密度达80%左右,加入病毒感染24 h。将 DCFH-DA 荧光探针以 11000 的比例稀释,放置于 37、5%CO2的培养箱内,经过 30 min 的遮光处理,再经过 PBS 洗涤,通过荧光显微镜观察 ROS 荧光的强弱,进行相应的数据统计。1.2.6MDA水平检测根据说明书要求,首先配置 0.37%的 TBA 贮存液,然后按照比例配制新鲜的MDA 检测工作液。在 1.5 mL 离心管中加入 0.1 mL 稀释成不同浓度的标准品和待测样品,随后加入0.2 mL MDA 检测工作液,混匀后,99 金属浴加热 15 min,冷却至室温,1000g室温离心 10 min。取 200 L 上清液加入到 96 孔板中,酶标仪在 532 nm 测定吸光度。通过标准曲线计算出样品溶液中的 MDA 浓度后,以单位重量的蛋白含量(BCA 法测量)来计算最初样品中的 MDA 含量(mol/mg)。各处理组均设置 3 组重复。1.2.7Western blot检测蛋白表达 蛋白提取:将接种细胞后的 6 孔板置于冰上,加入适量裂解液于冰上裂解细胞,收集裂解液于 4,12 000g离心 10 min 后收集上清液。部分上清液以 BCA 蛋白浓度检测试剂盒检测各组总蛋白浓度。按照计算出的蛋白浓度取适量上清液加入 4Load Buffer,放于 100 水浴锅内水浴 5 min,冷却至室温后-80 保存。Western blot:制胶后,取 10 L 的上样量,恒压80V 电泳 30 min,待 marker 的分层条带跑至分离胶下 12 cm 后,调整电压至 120 V 继续电泳 1 h 左右;200 mA 恒流湿转 120 min 将蛋白转移至 PVDF膜,将膜置于无蛋白酶快速封闭液中 15 min;封闭后的条带浸泡在稀释后的一抗中置于 4 冰箱孵育过夜;TBST 洗膜 3 次,每次 10 min;再加入羊抗兔二抗、羊抗鼠二抗室温孵育 1 h;继续 TBST 洗膜 3 次,每次 10 min;最后置于 ECL 发光显影液内 3 min;凝胶成像仪拍照保存。1.2.8 细胞总RNA提取及实时荧光定量 PCR 根据诺唯赞 RNA 快速提取试剂盒说明书提取细胞总的 RNA,使用超微量分光光度计测定所提取的 RNA浓度,然后以 1000 ng 总量按照反转录试剂盒说明书将 RNA 逆转录为 cDNA,-80 保存。荧光定量PCR 仪进行实时荧光定量 PCR,以-actin 为内参,2-Ct法分析各目的基因 mRNA 相对表达水平。1.2.9Si-RNA干预将装有干粉状态的 Si-RNA的 EP 管瞬时离心后加入适量的的 DEPC 水(无菌)溶解 Si-RNA,使其浓度为 20 mol/L,根据需要分装并存储至-20 冰箱储存。首先,取无菌 1.5 mL EP 管 3 个分别标记 Si-NC、Si-YAP1、Si-ACSL4,每管加入 100 L 无血清 培 养 基 和 6 L 的 lipo-fectamine2000 并轻轻摇匀配制成 a 液体,静置 3 min。再取无菌 1.5 mL EP 管 3 个分别标记 Si-NC、Si-YAP1、Si-ACSL4,每管加入 100 L 无血清培养基和 8 L 的 Si-RNA 混匀配制成 b 液体,室温下放置5 min。将配好的 a 液与 b 液体相混合,室温放置 20 min 形成混合物。在实验组中每组加入 100 L 上述混合物后置于细胞培养箱继续培养 24 h,干预后的细胞可用于提取蛋白或提取 RNA 等。1.3统计学分析数据分析采用 GraPhPad Prism 9.4 软件,定量资料以均数标准差(xs)表示,两组间比较采用 t 检验;多组间比较采用单因素方差分析,进一步两两比较采用事后比较(Tukey 法);重复61医学研究与战创伤救治2024 年1 月 第37 卷 第1 期 J Med Res Combat Trauma Care,Vol.37,No.1,January,2024测量数据的比较采用双因素方差分析;以 P0.01为差异有统计学意义。2 结 果2.1 重组新城疫病毒 rL-RVG 感染后对肺腺癌细胞生长、迁移及侵袭能力及细胞形态的影响采用CCK-8 法检测细胞活性,病毒感染时间设定为 24 h时,不同 MOI 值的 rL-RVG 病毒感染 A549、PC9 及BEAS-2B 细胞,A549 及 PC9 细胞存活率在 rL-RVG的 MOI=5 时与 MOI 为 0、1、3 相比差异均有统计学意义(P0.05),通过对 BEAS-2B 细胞生存率分析可知,MOI=5 时对正常组织细胞不存在毒害作用,细胞存活率 97.67%,故选择 MOI=5 作为后续实验病毒感染复数。MOI=5 时,NDV 及 rL-RVG 对肺腺癌细胞活力抑制作用随时间增加而增强,且 rL-RVG的抑制作用更强(P0.01),见图 1。细胞划痕结果提示 rL-RVG 组细胞迁移率明显低于 NC 组(P0.01),见图 2。Transwell 实验结果也证明与 NC 组相比,NDV 及均抑制肺腺癌细胞侵袭能力,且 rL-RVG抑制作用更强(P0.01),见图 3。在光学显微镜下观察细胞状态,我们发现,NC 组细胞数量增加,胞体丰满,形态良好,而 NDV 组和 rL-RVG 组的细胞数量减少,细胞出现皱缩形态不佳,其中 rL-RVG 组变化更为明显,见图 4。上述结果显示,NDV 及 rL-RVG 均能抑制肺腺癌细胞 A549、PC9 的生长、迁移及侵袭,且 rL-RVG 对肿瘤细胞的抑制作用较 NDV更强。a:A549 细胞;b:PC9 细胞P0.01图 1 CCK8 实验检测各组细胞存活率Figure 1 CCK8 assay was used to detect cell survival rate in each group a:A549 细胞迁移及数目统计分析;b:PC9 细胞迁移及数目统计分析P0.01图 2 细胞划痕实验检测各组细胞迁移情况Figure 2 Cell scratch assay was used to detect cell migration in each gruop71医学研究与战创伤救治2024 年1 月 第37 卷 第1 期 J Med Res Combat Trauma Care,Vol.37,No.1,January,2024 a:各组细胞侵袭情况(结晶紫染色 200);b:各组细胞侵袭数量统计分析P0.01图 3 Transwell 实验检测各组细胞侵袭情况Figure 3 Transwell assay was used to detect the invasion of cells in each group图 4 光镜下观察各组细胞形态变化Figure 4 Observing the morphological changes of each group of cells under an optical microscope2.2 重组新城疫病毒 rL-RVG 感染肺腺癌细胞后ROS 及 MDA 水平变化流式细胞术检测铁依赖性的 ROS 含量,图 5 提示在 A549 和 PC9 细胞中,NDV、rL-RVG 和铁死亡诱导剂 Erastin 均能增加ROS 含量,其中 rL-RVG 作用强于 Erastin;rL-RVG+Erastin 组 ROS 含量大于 rL-RVG 组和 Erastin 组。相反,铁死亡抑制剂 NAC 可以减少 ROS 产生,rL-RVG 可以挽救 NAC 造成的 ROS 减少。同时,ROS荧光强度测定也出现类似结果,见图 6。用酶标仪法检测细胞内 MDA 含量,结果提示经过 NDV、rL-RVG 和 Erastin 处理的细胞中 MDA 含量明显增加(P0.01),且 rL-RVG 组 MDA 含量最高;NAC 可以减少 MDA 产生,rL-RVG 可以一定程度上挽救NAC 造成的 MDA 减少(P0.01),见图 7。a:A549 细胞;b:PC9 细胞图 5 流式细胞术检测各组细胞内 ROS 含量Figure 5Detection of intracellular ROS content in each group by flow cytometry81医学研究与战创伤救治2024 年1 月 第37 卷 第1 期 J Med Res Combat Trauma Care,Vol.37,No.1,January,2024 a:A549 细胞内 ROS 荧光强度及统计分析情况;b:PC9 细胞内 ROS 荧光强度及统计分析情况P0.01图 6 各组细胞内 ROS 荧光强度测定Figure 6 Measurement of intracellular ROS fluorescence intensity in each group of cells 1:NC 组;2:rL-RVG 组;3:NAC 组;4:NDV 组;5:rL-RVG+Erastin 组;6:rL-RVG+NAC 组;7:Erastin 组;8:NDV+Erastin组;9:NDV+NAC 组a:A549 细胞;b:PC9 细胞P0.05、P0.01图 7 各组细胞内 MDA 含量测定Figure 7Measurement of intracellular MDA content in each group of cells2.3 重组新城疫病毒 rL-RVG 感染后铁死亡相关分子 p53、YAP1、ACSL4 的表达水平 为进一步探究 p53-YAP1-ACSL4 通路在铁死亡中的作用,通过Western blot 证明 rL-RVG 感染后肺腺癌细胞 P53、ACSL4 和 YAP1 蛋白表达均上调(P0.01),见图8。Erastin 促进 P53、YAP1、ACSL4 表达,见图 9,NAC 抑制 P53、YAP1、ACSL4 表达且 rL-RVG 可以一定程度地减弱 NAC 的抑制效果,见图 10。接着,利用 Si-RNA 分别对细胞中的 ACSL4、YAP1 进行敲减,通过实时荧光定量 PCR 检测目的基因 mRNA 的相对表达量,与 Si-NC 组相比,Si-ACSL4 组中 mRNA表达量大幅下降(P0.01),证实 ACSL4 敲减成功。Si-ACSL4+rL-RVG 组 mRNA 水平较 Si-ACSL4 组增高(P0.01),但仍比 Si-NC 组要低(P0.01),见表1。Western blot 说明 Si-ACSL4 组中 ACSL4 蛋白表达水平较 Si-NC 组降低(P0.01),再次证明敲减ACSL4 是 成 功 的。相 应 的,rL-RVG 可 以 提 高91医学研究与战创伤救治2024 年1 月 第37 卷 第1 期 J Med Res Combat Trauma Care,Vol.37,No.1,January,2024Si-ACSL4 组中 ACSL4 的蛋白表达水平(P0.01),但仍比 Si-NC 组中低(P0.01),见图 11。上述结果提示 rL-RVG 可以上调 ACSL4 的表达。同样地,我们用 Si-RNA 敲减 YAP1,结果说明 rL-RVG 可以诱导肺腺癌细胞中 YAP1 在转录水平表达量上调,见表 2,敲减 YAP1 的同时可以降低 ACSL4 的蛋白表达量,rL-RVG 可以同时上调 YAP1 和 ACSL4 的蛋白表达水平,见图 12。a:A549 细胞;b:PC9 细胞P0.01图 8 Western blot 检测各组相关蛋白表达量Figure 8Western blot was used to detect protein expres-sion levels in each group 1:NC 组;2:NC+Erastin 组;3:rL-RVG 组;4:rL-RVG+Erastin组a:A549 细胞;b:PC9 细胞P0.01图 9 Western blot 检测 Erastin 干预后各组蛋白表达量Figure 9 Western blot detection of protein expression lev-els in each group after Erastin intervention 1:NC 组;2:NC+NAC 组;3:rL-RVG+NAC 组;4:rL-RVG 组a:A549 细胞;b:PC9 细胞P0.01图 10 Western blot 检测 NAC 干预后各组蛋白表达量Figure 10 Western blot detection of protein expression lev-els in each group after NAC intervention表 1 Si-RNA 干预后 ACSL4 的 mRNA 相对表达量Table 1Relative mRNA expression levels of ACSL4 after Si-RNA intervention组别ACSL4 mRNA 相对表达量A549PC9Si-NC 组1.001.00Si-NC+rL-RVG 组1.891.18Si-ACSL4 组0.43#0.47#Si-ACSL4+rL-RVG 组0.64#0.75#与 Si-NC 组比较,P 0.01;与 Si-NC+rL-RVG 组比较,#P0.01;与 Si-ACSL4 组比较,P0.01表 2 Si-RNA 干预后 YAP1 的 mRNA 相对表达量Table 2Relative mRNA expression levels of YAP1 after Si-RNA intervention组别YAP1 mRNA 相对表达量A549PC9Si-NC 组1.001.00Si-NC+rL-RVG 组1.961.20Si-YAP1 组0.59#0.43#Si-YAP1+rL-RVG 组0.80#0.59#与 Si-NC 组比较,P 0.01;与 Si-NC+rL-RVG 组比较,#P0.01;与 Si-YAP1 组比较,P0.012.4敲减 YAP1 及 ACSL4 后对 ROS 及 MDA 水平的影响 通过流式细胞术检测敲减 YAP1 及 AC-SL4 后细胞中 ROS 积聚水平,与 Si-NC 组相比,Si-YAP1 和 Si-ACSL4 组 ROS 水平均下降,rL-RVG 可以在一定程度上挽救敲减 YAP1 及 ACSL4 所导致的 ROS 的减少(P0.01),但较 Si-NC 组 ROS 水平仍显著下降(P0.01),见图 13。同样的,MDA 含量的变化和上述结果相符合,见图 14。02医学研究与战创伤救治2024 年1 月 第37 卷 第1 期 J Med Res Combat Trauma Care,Vol.37,No.1,January,2024 1:Si-NC 组;2:Si-ACSL4 组;3:Si-ACSL4+rL-RVG 组;4:Si-NC+rL-RVG 组a:A549 细胞;b:PC9 细胞P0.01图 11 Si-RNA 干预后各组 ACSL4 蛋白表达量Figure 11The expression level of ACSL4 protein in each group after Si-RNA intervention 1:Si-NC 组;2:Si-NC+rL-RVG 组;3:Si-YAP1+rL-RVG 组;4:Si-YAP1 组a:A549 细胞;b:PC9 细胞P0.01图 12 Si-RNA 干预后各组 YAP1 蛋白表达量Figure 12The expression level of YAP1 protein in each group after Si-RNA intervention a:A549 细胞;b:PC9 细胞图 13 Si-RNA 干预后各组细胞内 ROS 水平Figure 13 Intracellular ROS levels in each group after Si-RNA intervention1:Si-NC 组;2:Si-YAP1 组;3:Si-ACSL4 组;4:Si-NC+rL-RVG 组;5:Si-YAP1+rL-RVG 组;6:Si-ACSL4+rL-RVG 组a:A549 细胞;b:PC9 细胞P0.01图 14 Si-RNA 干预后各组细胞内 MDA 含量Figure 14Intracellular MDA content in each group after Si-RNA intervention3 讨 论 铁死亡(Ferroptosis)作为一种新型的调节性细胞死亡(regulated cell death,RCD),与细胞凋亡、坏死和自噬等传统的 RCD 有着本质区别,主要涉及铁稳态、脂质代谢和谷胱甘肽代谢的改变9。铁死亡的本质是 ROS 积累诱导脂质过氧化,并经铁离子催化后发生代谢异常,脂质不断积累,破坏细胞内氧化还原稳态,攻击生物大分子,从而引起细胞死亡10。由于强烈的膜脂质过氧化和氧化应激的发生而导致质膜选择性通透性丧失11,造成的线粒体嵴减少或消失,线粒体外膜破裂和线粒体膜浓缩是铁死亡的主要细胞学变化特征12。目前,人们已经对铁死亡进行深入探索,并且已经证实它与多种疾病的发生发展相关,其中与肿瘤之间的关系密切13,多种信号通路也被发现参与铁死亡调节14,因此铁死亡成为近年来肿瘤领域的研究热点之一。其中 Hippo 途径不仅能够有效地调节和整合上游信号而且还能够利用转录共激活因子 YAP 来指导细胞基因转录与生物学行为,对于细胞的生长发育、存活、增殖、迁移,组织器官大小的调节和肿瘤的形成和发展都有着重要的影响15。最近的一项研究表明,YAP1 可以促进铁死亡16。铁死亡的发生依赖于 Hippo 通路的活性,抑制Hippo 通路或者激活 YAP 均可以促进铁死亡17。此外,p53 和 YAP1 均在细胞周期和铁死亡中发挥调控作用,YAP1 可直接结合 TP53 基因启动子上调p53 表达,导致肝细胞癌化疗过程中的凋亡。反过来,P53 可以与 YAP1 启动子结合上调其表达,建立12医学研究与战创伤救治2024 年1 月 第37 卷 第1 期 J Med Res Combat Trauma Care,Vol.37,No.1,January,2024一个正反馈回路18。相关研究表明 p53-YAP1 轴在调节结肠癌铁死亡中发挥了一种新的肿瘤抑制作用19。由于 YAP1 靶向多个铁死亡调控因子包括ACSL420,所以我们推测 p53-YAP1-ACSL4 轴在诱导铁死亡的发生过程中起到重要作用。溶瘤病毒具备高度的特异性,能选择性地感染、大量复制并选择性杀伤肿瘤细胞。除了直接和局部的抗肿瘤活性外,还可以诱导有效、全身、持久的抗肿瘤免疫21。溶瘤病毒治疗肿瘤是安全且有效的22。新城疫病毒(new castle disease virus,NDV)是一种具有溶瘤作用的鸡瘟溶瘤病毒,对人类正常细胞无致病性。而安全、高免疫活性、稳定表达狂犬疫苗糖蛋白的重组新城疫病毒 rL-RVG 具有更强的扩散性,其抗肿瘤作用远远强于 NDV23。但目前尚未有相关文献报道 rL-RVG 对肿瘤细胞铁死亡的影响。故本研究旨在探索 rL-RVG 是否能诱导肺腺癌细胞铁死亡,并进一步探索其相关机制。在这项研究中,我们首先使用了两种病毒 rL-RVG 和 NDV 对肺腺癌 A549 和 PC9 进行感染,结果发现 NDV 和 rL-RVG 都有抑制肺腺癌细胞的增殖、迁移和侵袭的效应,而 rL-RVG 的效力比 NDV 更明显。其次我们发现 rL-RVG 可以与 Erastin 相媲美,在抑制肺腺癌细胞增殖过程中可能发挥类似铁死亡诱导剂作用,促进细胞内 ROS 积聚,诱导肿瘤细胞发生铁死亡。进一步研究其相关机制后发现 rL-RVG 感染肺腺癌细胞后 p53、YAP1 及 ACSL4 的蛋白表达量均增加,同时 Si-RNA 的实验结果也提示YAP1 及 ACSL4 参与调控铁死亡的发生,且 ACSL4是 YAP1 的下游靶点。这些发现共同提示重组新城疫病毒 rL-RVG 可以通过激活 p53-YAP1-ACSL4 通路诱导人肺腺癌细胞铁死亡,这可能为临床治疗肺腺癌提供新的思路,使 rL-RVG 有望成为有吸引力的抗癌剂。【参考文献】1 Siegel RL,Miller KD,Wagle NS,et al.Cancer statistics,2023J.CA Cancer J Clin,2023,73(1):17-48.2 Altorki NK