慢病毒(过表达)包装步骤.doc

慢病毒(过表达）包装步骤秦超1. 转染复苏293T细胞,传2-3代进行转染，转染推荐使用合元公司的慢病毒转染试剂.转染步骤:（以10cm培养皿为例)最好在铺细胞后20h左右进行转染，控制转染前细胞密度7090,保证细胞处于良好的状态，转染前一小时把一半培养基(约5ml）换成新的（含血清,因为此转染试剂不需换液）。加psin 10ug，pspax2 10ug，pmd2。g 5ug于800ul optimem,混匀加40ul慢病毒转染试剂于800ul optimem,混匀,室温静置5min将所得的转染试剂稀释液滴加到所得到的质粒稀释液中，边加边轻轻混匀，室温放置20min取出细胞培养皿，将得到的质粒转染试剂复合体加入到细胞培养基中，前后轻轻推摇使混合均匀，放回培养箱。2. 收毒（3648h)收毒前如果质粒带有荧光标签可先看一下转染效率，一般达到60即可。将培养皿中的病毒上清液吸出到15cm离心管中，然后2000rpm离心10min，以沉淀细胞碎片.取上清用0.22um滤清过滤到浓缩管（用蛋白质浓缩管即可）中。4000rpm离心至所需体积。浓缩完毕后,吸出浓缩后的病毒液，按每次的接毒量分装，80冻存。由于反复冻融会降低慢病毒滴度，因此避免反复冻融。3. 接毒接毒前1220h铺细胞,使接毒时细胞密度约为40%-50%，务必使用生长状态良好的细胞。将分装好的慢病毒滴加到细胞中，加polybrene使其终浓度为8ug/ml细胞密度6070时可以再接毒一次。4. 检测及培养细胞系（48h)如果带有荧光标签可直接显微镜看一下感染效率，如需用药杀用puromycin杀三天(对照组完全杀死），剩下的即为基因整合进去的细胞。如需培养成细胞系，可继续培养。如果剩下的细胞较少可用高浓度血清，待细胞聚团时用胰酶消化一下，使细胞铺匀。