慢病毒(过表达)包装步骤.doc

慢病毒(过表达）包装步骤
秦超
1. 转染
复苏293T细胞,传2-3代进行转染，转染推荐使用合元公司的慢病毒转染试剂.
转染步骤:（以10cm培养皿为例)
⑴最好在铺细胞后20h左右进行转染，控制转染前细胞密度70％—90％,保证细胞处于良好的状态，转染前一小时把一半培养基(约5ml）换成新的（含血清,因为此转染试剂不需换液）。
⑵加psin 10ug，pspax2 10ug，pmd2。g 5ug于800ul opti—mem,混匀
⑶加40ul慢病毒转染试剂于800ul opti—mem,混匀,室温静置5min
⑷将⑶所得的转染试剂稀释液滴加到⑵所得到的质粒稀释液中，边加边轻轻混匀，室温放置20min
⑸取出细胞培养皿，将⑷得到的质粒转染试剂复合体加入到细胞培养基中，前后轻轻推摇使混合均匀，放回培养箱。
2. 收毒（36—48h)
收毒前如果质粒带有荧光标签可先看一下转染效率，一般达到60％即可。
⑴将培养皿中的病毒上清液吸出到15cm离心管中，然后2000rpm离心10min，以沉淀细胞碎片.
⑵取上清用0.22um滤清过滤到浓缩管（用蛋白质浓缩管即可）中。4000rpm离心至所需体积。
⑶浓缩完毕后,吸出浓缩后的病毒液，按每次的接毒量分装，—80℃冻存。由于反复冻融会降低慢病毒滴度，因此避免反复冻融。
3. 接毒
接毒前12—20h铺细胞,使接毒时细胞密度约为40%-50%，务必使用生长状态良好的细胞。将分装好的慢病毒滴加到细胞中，加polybrene使其终浓度为8ug/ml
细胞密度60％—70％时可以再接毒一次。
4. 检测及培养细胞系（48h)
如果带有荧光标签可直接显微镜看一下感染效率，如需用药杀用puromycin杀三天(对照组完全杀死），剩下的即为基因整合进去的细胞。如需培养成细胞系，可继续培养。如果剩下的细胞较少可用高浓度血清，待细胞聚团时用胰酶消化一下，使细胞铺匀。