细胞工程习题(答案)(1).doc

细胞培养技术习题(含答案）第一章 动物细胞培养概述一、名词解释细胞培养：是指将动物活体体内取出的组织用机械或消化的方法分散成单细胞悬浮液，然后放在类似于体内生存环境中，进行孵育培养,使其生存、生长并维持其结构与功能的方法.组织培养：从生物体内取出活的组织在体外进行培养的方法。器官培养：将活体内的器官（一般是胚胎器官)、器官的一部分或器官原基取出，在体外培养的方法。 二、填空题1. 体外培养(或组织培养)主要包括_细胞培养_,_组织培养_，和_器官培养_ 三种类型。2. _Harrison_的实验开创了动物组织和细胞培养的先河，他建立了_盖玻片悬滴_培养法3. 在卡氏瓶原理的启发下，出现了用试管培养,继而又出现了多种类型的_培养瓶、_培养皿和_多孔培养板_的培养。从20世纪40年代开始,大多数培养工作都过渡到用_瓶子_培养4. 在动物细胞培养方法的发展过程中,具有历史意义的培养方法有盖玻片悬滴培养法，_旋转管培养的方法_，_灌注小室培养法_，和目前普遍应用的单层细胞培养法5. 早期细胞培养采用_天然_培养基,现在广泛采用添加_血清_的_人工合成培养基，近二十年来,动物细胞培养朝着无血清_培养基的方向发展。三 问答题1、动物细胞培养技术现已应用到那些领域？请举例说明。 动物细胞培养技术几乎已应用到生物、医学研究的各个领域。这门技术自创立至今，已在多个学科领域乃至生产实践中均发挥了巨大的作用。 一、在生物学领域的基础研究中的应用 离体培养的动物细胞具有培养条件可人为控制且便于观察检测的特点，因而可广泛应用于生物学领域的基础研究中。 1在细胞生物学上的应用 2在遗传学上的应用 除了可用培养的动物细胞进行染色体分析外，还可结合细胞融合技术建立细胞遗传学，进行遗传分析和杂交育种。 3在胚胎学上的应用 通过体外培养卵母细胞，并进行体外受精、技术而应用于家畜的繁殖生产中. 4在病毒学上的应用胚胎分割和移植己发展成了一种较成熟的在制备减毒活疫苗和诊断用抗原时，离不开细胞这一病毒增殖的场所。另外，在病毒学研究中，用培养的动物细胞代替试验动物做斑点分析5.在药理学领域的应用二、在临床医学上的应用1用于遗传疾病和先天畸型的产前诊断目前，人们已经能够用羊膜穿刺技术获得脱落于羊水中的胎儿细胞，经培养后进行染色体分析或甲胎蛋白检测即可诊断出胎儿是否患有遗传性疾病或先天畸型.2用于癌症的早期诊断和预防我国的科学工作者通过培养淋巴细胞，病人，以便进行及早的预防和治疗。3用于临床治疗并对其染色体进行对比分析检测出易患癌症的4用于药物效应的检测检测治疗肝病的药物可选用肝细胞、检测抗癌药物可选用癌细胞。三、在动物育种上的应用四、在生物制品生产上的应用2、动物细胞培养有哪些要求和那些方法?动物细胞培养工作的基本要求： 1.培养前准备 2操作间消毒 3洗手和着装 4火焰消毒5实验中的操作要求动物细胞培养工作的工作方法：细胞培养是一种操作程序比较复杂、需求条件多而严格的实验性工作，工作时必须注意一定的方法，主要有以下几点予以重视。 将所有操作程序如洗刷、配液、消毒等，制定出统一的规范和要求，并在一定时间内保持相对稳定和要求人人遵守。各种用液(培养液、胰蛋白酶、Hanks液、NaHCO2、抗生素液)均应由专人负责配制,并保证做到制备浓度精确、灭菌可靠。所有制备好的溶液和试剂瓶上都要有标签，注上名称、浓度、消毒与否和制备日期。一切培养用品都要有固定的存放地点，其中尤为重要的是，培养用品与非培养用品应严格分开，已消毒与末消毒品应严格分开存放. 以上一切措施都是为了避免各种杂质混入细胞生存环境、防止微生物感染和细胞“污染”。所谓细胞污染，是指不同细胞之间因操作不当造成的相互混杂，使细胞群体不纯的现象。近年来世界上不少实验室都出现过这种事故，应引起注意。第二章 动物细胞培养的基本知识一、名词解释贴壁依赖性细胞:细胞必须贴附于支持物表面才能生长，因此又称为贴壁型细胞.非贴壁依赖性细胞：细胞在体外生长时不需要贴附于支持物表面，可以悬浮状态在培养液中生长,这种细胞又称为悬浮型细胞。接触抑制：是指体外培养的细胞在贴附底物上连接成片、相互接触后失去运动的现象，这是某些贴附生长型细胞的特征之一。无限细胞系:由于某种因素的影响,细胞可能发生自发转化,即细胞获得持久性增殖能力，这样的细胞群体称为连续细胞系.脱分化:指的是细胞在体外不可逆地失去它们原有的特性.二、填空1. 体外培养的动物细胞其生长方式主要 贴壁生长 和 悬浮生长 两种,分别称为 贴壁型 细胞和悬浮型细胞。体外培养的动物细胞其生长方式以 贴附生长 为主。2。 贴壁生长的体外培养动物细胞，按形态来分，大体分为 成纤维细胞型 、 上皮细胞型、 游走细胞型、多形细胞型四种类型，最常见的为前两种.3. 细胞在体外生长时具有一些特点，其中主要是 贴附生长 、 接触抑制 和密度依赖性。4。 培养细胞生命期可分为 原代培养期 、 传代培养期 、 衰退期 三个阶段。三、问答题1. 什么是培养细胞的一代生存期?培养细胞的一代生存期可分为哪几个阶段？各有何特点？答：a，细胞的一代生存期指从细胞接种到下一次再传代接种的一段时间。b,培养细胞的一代生存期分为潜伏期、指数生长期、停滞期三个阶段。C,潜伏期:又分为悬浮期，细胞质回缩，胞体呈球形；贴壁期，细胞开始附着或贴附于底物表面上，并逐渐伸展;潜伏期,细胞可有运动活动，基本无增殖,少见分裂相。 指数生长期:是细胞一代中活动最好的时期,培养物中的细胞数量呈指数生长，在接种适宜的情况下,指数生长期持续一段时间后，随细胞数量不断增多，生长空间渐趋减少，最后细胞相互接触汇合成片。 停滞期：细胞数量达到饱和密度，细胞停止增殖,但仍有细胞代谢活动,接着培养液中营养渐趋耗尽，代谢产物积累，PH降低.2. 培养细胞需要哪些营养?它需要在什么样的环境下生长？这些环境如何获得？答：A.营养需要：氨基酸、碳水化合物、无机盐、维生素、促生长因子及一些生长必须的钾、钠、铁等元素。 B.生存环境：培养用水充足，培养温度及PH适宜，气体条件及渗透压适宜，还有无毒无菌无污染的培养环境。 C.环境的获得：3. 培养细胞需要哪些主要仪器？在使用时需要注意什么？第三章 动物细胞培养的准备工作一、填空题1、玻璃器皿的清洗程序主要包括浸泡 、刷洗、浸酸 、和冲洗。2、目前大多数实验室采用的浸酸酸液的主要成分是浓硫酸和重鉻酸钾。3、细胞培养用品的包装主要包括局部包装和全包装两种类型，如前者适宜的器皿有烧杯、容量瓶等，后者适宜的器皿有注射器、胶塞等.细胞培养中塑料制品中主要采用射线消毒方法进行灭菌，人工合成培养基和酶液采用过滤消毒方式进行灭菌.细胞培养实验前实验者的皮肤主要用75的酒精或新洁尔灭 来消毒灭菌，实验室地面采用来苏儿定期拖洗消毒，培养室空气可以用 紫外线或乳酸蒸汽 消毒。BSS中文名称为平衡盐溶液，具有维持渗透压、稳定PH等作用，常用作洗涤组织和细胞以及配置各种培养用液的基础溶液。动物细胞培养基中常用的消化液有胰蛋白酶消化液、胶原酶消化液 和EDTA2Na 三种,常在贴附型细胞原代培养或传代 培养中用来离散细胞.要想取得好的细胞培养效果，在合成培养基中添加天然培养基 构成完全培养基是非常必要的，通常它的灭活处理方法是热灭活。二、简答题1、塑料制品的清洗步骤是什么？答：塑料器皿耐腐蚀能力强,但质地软，大多不耐热。塑料器皿的清洗意识要防止划痕,二是用后要立刻浸入清水中，严防附着物干结。如果残留有附着物，可先用脱脂棉轻轻擦掉,再用流水冲洗干净，接着用2的NaOH液浸泡过夜，取出后用自来水冲洗8-10次，然后用3 5盐酸溶液浸泡1530分钟，取出后用自来水冲洗多次,在在双蒸水漂洗5-6次,倒净器皿内的双蒸水,置37度恒温箱内晾干即可。2、 用高压蒸汽灭菌锅进行湿热灭菌时应注意什么？答；湿热灭菌时，消毒品不能装得过满，以保证消毒器内气体的流通，在加热升压之前先要打开排气阀门,排除残留在容器内的冷空气，导气管一定要沿着灭菌锅内胆上的升制的通气孔道到达灌的底部并且不能堵塞.冷空气排尽后,关闭排气阀门；继而开始升压,当达到所需要的压力时,通过调节高压蒸气锅的电源开关,是压力稳定在所需数值后并开始计算时间。在消毒过程中,消毒者不能离开，要经常检查压力是否恒定，如有偏离，应及时调整。3、谷氨酸胺在培养基中的主要作用是什么？配液时应该注意哪些问题？答：1）谷氨酰胺的作用：在细胞的代谢工程中发挥重要作用，是细胞合成核酸和蛋白质的必需的氨基酸；缺少谷氨酰胺时,细胞会因为生长不良而死亡。培养液在4C冰箱中储存2周以上时，还应重新加入原来量的谷氨酰胺.一般来说 ，谷氨酰胺溶液都是单独配制的，以便在需要时加入培养液内。常把其配制成100倍的浓缩母液，浓度为200mmol/L(29。22g/L）。使用时，在每100ml培养液中加入0。5-2ml谷氨酰胺母液,使其终浓度为14mg/L即可.4、人工培养基常用的有哪些（列举12种）？采用人工培养基有什么优点？答：1）人工培养基常用培养基:主要有有MEM培养液,DMEM培养液，RPMI1640培养液，HamF12培养液等等。2）采用人工培养基优点:因为合成培养基是根据动物体内细胞生长所需成分人工模拟合成的、配方恒定的一种较理想的培养基，其主要成分是氨基酸,维生素，碳水化合物，盐离子和一些其他辅助物质,培养基成分固定,有利于控制实验条件的标准化,合成培养基的应用促进了培养细胞的发展，合成培养基可以用于特殊研究的细胞培养工作，杂交瘤技术细胞培养,肿瘤细胞培养，单细胞培养等等方面。2)配液时应该注意的问题:谷氨酰胺在溶液中很不稳定，应置于20C冰箱中保存，在使用前加入培养液中。因为谷氨酰胺在4C下放置7d就会分解50%，所以已含谷氨酰胺的5、胎牛血清在细胞培养中起什么作用？如何从外观大致判断血清质量的好坏？胎牛血清在细胞培养中对许多细胞系均有促生长作用，主要用于细胞株的保藏以及特殊娇贵细胞株的体外培养。 质量好的血清应该是透明清亮的土黄色或棕黄色，无沉淀或是极少量沉淀，比较粘稠。如发现血清浑浊、不透明、含有许多沉淀物，说明血清污染或是血清中的蛋白质变性;若血清呈棕红色,说明血清中的血红蛋白含量太高，取材时有溶血现象；如果摇晃时感觉液体稀薄,说明血清中渗入的生理盐水太多。6、完全培养基中各成分在细胞培养过程中的作用分别是什么?答:在基础培养基中添加血清、抗生素等物质后成为完全培养基,也叫（血清)细胞培养基。完全培养基根据添加血清量的多少,可分为细胞生长培养基和细胞维持培养基两种.完全培养基中的成分包括氨基酸，碳水化合物，维生素,无机盐类,促生长因子,辅酶，核酸，嘌呤，嘧啶，激素等等，除此之外，还需加入牛血清。各成分作用列举如下：1）氨基酸：细胞合成蛋白质的原料，保证细胞正常的生理代谢过程;2)碳水化合物：细胞生长主要的能量来源,有些糖类是合成氨基酸，脂肪，核酸的原料；3）维生素：细胞生长必不可少的有机化合物,帮助细胞维持渗透压平衡和调节细胞膜功能，有些无机盐是维生素，激素，酶形成中的原料；4)促生长因子：对于维持细胞功能，保持细胞的状态具有十分重要的作用；促进细胞增殖；5）牛血清:血清含有各种氨基酸，维生素，无机物，脂类物质，核酸衍生物都是细胞生长所需的基本营养物质;也提供激素，基础培养基中少有的营养成分,低分子营养物等；提供结合蛋白，识别维生素,脂类，金属离子，调变物质能力；与有毒金属和热源物质结合，起解毒作用；是细胞贴壁,铺展所需因子的来源,第四章 动物细胞培养的基本技术和方法一、名词解释原代培养原代培养也叫初代培养，是从供体进行细胞分离之后至第一次传代之前的细胞培养阶段。组织块培养法组织块培养是将组织剪切成小块后,接种于培养瓶进行培养。组织块培养法是常用的,简便易行的以及成功率较高的原代培养方法。消化培养法消化培养法是采用组织消化分散法将细胞间质包括基质、纤维等妨碍细胞生长的物质去除，使细胞分散，形成悬液，从而易于外界吸收养分和排出代谢产物.细胞生长曲线细胞生长曲线是测定细胞绝对生长数的常用方法，也是判定细胞活力的重要指标,是培养细胞生物学特性的基本参数之一。以培养时间为横轴，细胞浓度为纵轴作图,即得生长曲线。传代细胞由原培养瓶内分离稀释后传到新的培养瓶的过程称之为传代。二、填空1、组织块的分离方法有 机械分散法 、 剪切分离法 、 消化分离法 。2、目前，较常用的消化试剂有 胰蛋白酶 、 胶原酶 、 EDTA消化液 。3、接种培养瓶的细胞数量一般为 51051106/ml .4、培养细胞的污染一般包括 微生物污染 、 细胞交叉污染 、化学物质的污染。5、细胞冻存时DMSO常用的浓度为 10%的浓度 。三、判断(正确画“,错误画“X“）1、一般来说，成熟个体较胚胎容易培养，正常组织较肿胀净组织容易培养.（X)2、分离液体性原代细胞悬液时，可采用长时间高速离心。 （X）3、消化过程中使用的液体应不含Ca2+和Mg2+。 （）4、培养液变黄、常温，一般是由细菌污染引起。（）5、消化传代法一般用于悬浮细胞的传代。 （X）6、细胞冻存和复苏的方式应采用快冻慢融法。 (X)四、问答题1、原代取材培养时有哪些基本要求？P59 答：(1)无菌取材（2）取材器械要锋利（3）及时培养（4）剔除与培养细胞无关的成分（5）营养要丰富(6）采用易培养的组织进行培养（7)注意保存原代培养组织的相关材料及信息。2、如何分离原代组织材料?P61答：1。细胞悬液的分离方法：对于细胞悬液，可采用低速离心法分离。一般用5001000r/min离心510min.2。组织块的分离方法：（1）机械分散法 在对一些纤维成分很少的组织,如脑组织部分胚胎组织以及一些肿瘤组织等进行培养时，可以直接用机械方法进行分散。现在较为常用的是用注射器针芯挤压组织块通过不锈钢筛网的方法。（2）剪切分离法： 在进行组织块移植培养时，可以采用剪切法，即将组织剪或切成1mm3左右的小块后分离培养。（3）消化分离法： 消化法是结合生化和化学手段把已剪切成糊状的组织进一步的方法.常用的消化方法有：胰蛋白酶消化法和胶原酶消化法。3、细胞的常规检查包括哪些内容？P65答:细胞的常规检查包括：（1）培养液 重点观察培养液的颜色和透明度的变化.（2)细胞生长情况： 用倒置显微镜观察。（3）细胞形态变化： 对生长状态不良的细胞首先要查明原因，采取相应措施进行处理,如换液、排除污染、废弃等。(4）微生物污染: 主要包括细菌、霉菌、酵母菌、支原体等的污染。4、你如何认定培养细胞被微生物污染了？怎样排除微生物对培养细胞的污染？微生物污染主要包括细菌、霉菌、酵母菌、支原体等的污染。细菌、霉菌、酵母菌污染最典型的表现为培养液浑浊，液体内漂浮菌丝或细菌。支原体污染时则不同，对于传代稳定、生长规律的细胞系,往往表现为培养条件没有改变而细胞生长却明显变缓、胞质内颗粒增多、有中毒表现，但培养液多不发生浑浊，即可考虑为支原体污染.细菌和霉菌的污染多发生在传代、换液和加药等操作之后，霉菌和细菌繁殖迅速，能在很短时间内抑制细胞生长或产生有毒物质导致细胞死亡.真菌污染及排除: 污染培养细胞的真菌种类很多，常见的有烟曲霉、黑曲霉等，霉菌污染一般肉眼可见，交易被发现，短期内培养液多不浑浊，在培养液中形成白色或浅黄色漂浮物.瓶外的污染物需及时用酒精棉球擦洗清涂，以防其通过瓶口传入瓶内；如被污染可考虑采用制霉菌素25ug/ml或酮康唑10ug/ml对细胞进行处理。细菌污染及排除：常见的污染菌有大肠杆菌、白色葡萄球菌等。抗生素对预防和杀灭细菌有一定效果。抗生素联合使用比单独使用效果好,预防性应用比污染后使用效果好。如已发生细菌污染,在使用抗生素,常难以根除。有价值的细胞被污染后，可使用510倍常用抗生素剂量的冲击方法，加药作用2428h,在换入常规培养液中，有时可排除污染.支原体污染的排除：a抗生素处理，如使用四环素类、大环内酯类、泰乐菌素及一些氟喹诺酮等；b高热处理,将受污染的细胞置41作用510h，最长达18h，可以破坏支原体。;c巨噬细胞和抗生素联合处理；d鼠的传代处理；e血清处理。5、如何进行培养细胞的运输？P74应根据运输时间长短或距离远近来进行不同的细胞装运。1。长距离运输（几天）选择生长良好的单层细胞，去掉陈旧培养液,补充新培养液至瓶颈部，保留微量空气，拧紧瓶盖。这样可避免由于液体晃动导致的细胞损伤。瓶口用胶带缠紧密封，并用棉花包裹（做防震防压处理）。到达目的地后,吸出多余的培养液（此液可继续使用），保留细胞生长所需液量，常规培养数小时或过夜,次日传代。2.短距离运输（几小时)去掉大部分生长液，仅留少量液体覆盖单层细胞，防止细胞干燥,细胞面朝上。3。细胞悬液空运将浓度为6105 个/ml的细胞悬液于04放置24h。将细胞悬液混匀后，200r/min离心30min，弃去含酶的上清液,加4新鲜培养液，是细胞终浓度为2.4106个/ml。 将细胞装于4的冰盒内空运，到达目的地后以200r/min离心30min，弃去上清液，加新鲜培养液，调节细胞数为6105个/ml,然后接种于培养瓶。4。液氮咚存运输利用1L液氮罐或大号暖瓶装液氮，将冻存细胞管移入液氮中，这样可将细胞转送到其他场所。第五章 动物细胞的大规模培养一、 名词解释动物细胞大规模培养技术：是指在人式条件（除满足培养过程必需的营养要求外,还要进行pH和溶解氧的最佳控制）下,在细胞生物工程反应器中高密度大量培养动物细胞用于生产生物制品的技术。微载体：是指直径在60250m，能适用于巾壁细胞生长的微珠,一般是由天然葡聚糖或者各种合成的聚合物组成.微载体细胞培养：是在培养液内加入培养液及对细胞无害的颗粒-微载体，作为载体，使细胞在微载体表面附着并呈单层生长繁殖，通过持续搅动(为避免剪切力对细胞质的影响，搅拌速度一定要慢）使微载体始终保持悬浮状态的培养方法.微囊化细胞培养方法:是指在无菌条件下将拟培养的细胞、生物活性物质以及生长介质共同包裹在薄的半透膜中形成微囊，再将微囊放入培养系统内进行培养的方法。中空纤维细胞培养：是模拟细胞在体内生长的三维状态，利用一种人工的“毛细血管即中空纤维来为培养的细胞提供物质代谢条件而建立的事种大规模培养方法。二、 填空题1、 根据动物细胞的培养特性不同，可采用悬浮培养、贴壁培养和固定化培养等三种培养方法进行动物细胞大规模培养。2、 在动物细胞大规模培养中，能为细胞提供贴附表面的培养目前主要有旋转瓶、中空纤维、细胞工厂和微载体等。3、 制备固定化细胞的方法很多,在动物细胞培养中要考虑使用较温和的固定化方法，如吸附法、包埋法和微囊化法。4、 无论培养何种细胞，就操作方式而言，深层培养可分为分批式、流加式、半连续式、连续式和灌注式五种发酵工艺。5、 针对动物细胞培养特性开发的搅拌式生物反应器，主要有笼式通气搅拌反应器、双层笼式通气搅拌反应器等。6、 用气流代替不锈钢叶片进行搅拌,因而产生的剪切力相对温和，对细胞损伤较小的生物反应器是气升式生物反应器。三、 问答题1、 目前由动物细胞大规模培养的产物包括哪几类?请分别列举出23个产物。答：目前由动物细胞大规模培养的产物包括：1.疫苗类：狂犬病疫苗、乙肝疫苗、巨细胞病毒疫苗等；2。多肽和蛋白质类药物:生长激素、白细胞介素2和神经因子等；3.免疫调节剂及单克隆抗体:干扰素、免疫球蛋白等。P942、 动物细胞大规模培养的工艺流程主要包括哪些步骤?答：将组织切成碎片、用溶解蛋白质的酶处理而得到单个细胞、离心收集细胞、将细胞植入培养基中培养、酶解培养瓶中的细胞层、再接种到若干培养瓶中进行扩大培养3、 什么是悬浮培养？悬浮培养有何缺点？答：悬浮培养是指让细胞在生物反应器中自由悬浮生物增殖的培养方法。缺点:不能采用灌流培养,导致细胞密度较低，另外只有少数细胞适合悬浮培养。4、 微载体的选择有何要求?答：微载体：是指直径在60250m，能适用于巾壁细胞生长的微珠,一般是由天然葡聚糖或者各种合成的聚合物组成。具体要求如下:1.微载体表面性质要适于细胞附着、伸展和增殖;2.微载体材料没有毒性，且不会与培养基成分发生化学反应，也不会吸收培养基中的营养成分；3.微载体的密度一般为1.031.05g/ml，以便换液和收获;4。微载体直径要尽可能小最好控制在60250m之间,要尽可能均一；5。要具有良好的光学透明性，以便观察;6.能承受120高温；7。制作原料充分，价格便宜，制作简便，且经适当处理后能反复使用.5、 微载体培养的操作包括哪些步骤？答:微载体培养的操作包括五个阶段：培养初期阶段、黏附贴壁阶段、维持培养阶段、微载体培养的放大阶段。6、 微囊化培养中微囊的制备应注意哪些问题？答：微囊化培养中微囊的制备应注意：温和、快速、不损伤细胞，尽量在液体和生理条件下操作；所用试剂和膜材料对细胞无毒害;膜的孔径可控制，必须使营养物和代谢物自由通过；膜应有足够的机械强度可抵抗培养中的搅拌.7、 理想的动物细胞生物反应器应满足基本要求？试比较教材所介绍的几种生物反应器各自的优缺点。答：理想的动物细胞生物反应器应满足：1。在低剪切力及良好的混合状态下，能够提供充足的氧以供细胞生物及细胞进行产物的合成;2.生物反应器的结构要有比较好的传质、混合民及密闭的性能，既能保证培养细胞的正常生长和产物的合成，又能避免一切外来污染；3.制造反应器所用的各种材料要对细胞无毒性；4.培养环境的各种物理化学参数能自动检测和调节控制，并且精度要高，以利于培养过程的检测和调节；5。反应器应便于操作和维修。8、 几种生物反应器各自的优缺点的比较：第六章 特殊细胞培养概要一、 填空1. 为了促进上皮细胞的生长，需要从表皮分离、培养液和基质选择、增减适当的生长因子等方面抑制 微生物 生长。2。 上皮细胞培养器皿的表面需包被生长基质如 胶原 等。3。 在上皮细胞的实际培养中，常将 DMEM 和 HamF12 培养基按一定比例混合使用.4。 用于内皮细胞培养的标本多为 鼠脑皮质毛细血管 、 牛主动脉 、牛肾上脂皮质毛细血管、人脐静脉以及人皮肤和脂肪的毛细血管。5。 神经元细胞的培养底物需要经过 胶原 或 聚L赖氨酸 的特殊处理.6。 神经生长因子、有丝分裂抑制剂（如阿糖胞苷、5-氟脱氧尿嘧啶） 可以防止非神经元细胞的生长，用于神经元细胞的纯化.7。 肿瘤细胞培养过程中常用的促细胞生长因子有 胰岛素 、 氢化可的松 、 雌激素 .8。 神经胶质细胞主要取材部位为 中枢神经系统的皮质组织。9。 神经组织的体外培养主要包括 神经元 和 神经胶质细胞 的培养。10. 永生性 也称不死性，即在体外培养中细胞表现为可无限传代而不凋亡。11。 侵袭性 是肿瘤细胞的扩张性增殖行为，体外培养的癌细胞仍持有这种性状。二、判断1、上皮细胞培养中使用的各种液体包括细胞冻存液、分离液以及培养液都需要添加比其他组织培养浓度更高的抗生素。（ O ）2、 神经元细胞培养需要极高的营养条件，一般以RPMI-1640与Ham F12混合培养基（1：1，体积比）作为基础培养基。（ X ）3、 人肿瘤细胞主要来自外科手术或活检瘤组织。（O ）4、 制备肿瘤细胞时应尽量选用退变组织。( X ）5、 干细胞才是支持肿瘤生长的成分。（ X ）6、 饲养层细胞培养法是目前表皮细胞体外培养的较为成熟的技术。（X ）三、简答题1、体外培养肿瘤细胞的生物学特性有哪些？永生性 形态和性状 侵袭性 生长增长 细胞遗传 异质性2、应用体外培养技术进行肿瘤研究具有的优点。可以免受机体内部因素的影响，从而便于研究理化和生物因素对肿瘤细胞生命活动的影响便于眼睛肿瘤细胞的结构和功能肿瘤细胞可长期保存以便于观察其遗传行为的改变用于抗癌药物的快速筛选3、常用的排除成纤维细胞的方法有哪些？简述其操作过程。机械刮除法、反复贴臂法、消除排除法机械刮除法：a。制备无菌刮头 b。标记 c。刮除 d.用Hanks液冲洗一两次,冲洗被刮掉的细胞 e.注入培养液继续培养，如发现仍有成纤维细胞残留,可重复刮除至完全除掉为止反复贴臂法：a.细胞生长达一定数量后，倒出原瓶内培养液，用以蛋白酶消化后,Hanks液冲洗2次，加入不含血清的培养液，反复吹打制成细胞悬液b.取三个培养瓶，分别编号为A 、 B、C 先把悬液接种入A培养瓶中，然后置温箱中静止培养520min ，取出并轻轻倾斜培养瓶，让液体集中在培养瓶的一个角后,慢慢吸出全部培养液，再转接到B培养液中；向A瓶中补充少许完全培养液置温箱中继续培养。c。B 培养瓶中细胞培养520 min后，按A 瓶的处理方法，把培养液注入C培养瓶中置温箱中培养；再向B瓶中补加完全培养机制温箱中继续培养.第七章 与动物细胞培养相关的部分实验技术一、填空1. 制备单克隆抗体的融合是指将免疫小鼠的( 脾细胞 ）和（小鼠骨髓瘤细胞 ）融合.2. 融合过程中使用的促溶剂主要是（ 聚乙二醇 ）。3. 第一个单克隆抗体是( 1975 ）年制备成功的。4. 常用的细胞转染方法有（ 磷酸钙转染 ）、（ 脂质体转染）和（ DEAE-葡聚糖转染 )。5. 单克隆抗体的大量制备普遍采用的方法是( 杂交瘤技术 ）。其他参考答案：小鼠腹腔接种法6. 杂交瘤细胞克隆化的方法很多，常用的包括( 有限稀释法 ）和（ 软琼脂平板法 ）。7. 在细胞融合过程中瘤细胞株应用最多的是（ 杂交瘤 )细胞株。8. 细胞融合培养时加入在（ HAT ）选择系统，目的是保证只有杂交瘤细胞生长.二、名词解释单克隆抗体：是由一种B细胞克隆所产生的只针对某一特定抗原决定簇的抗体分子。细胞的基因转染:将外源性基因采用化学或物理的方法人工地导入细胞的技术，就叫做细胞的基因转染，又叫基因转移、基因转导。三、判断题1.脂质体法比磷酸钙法转染的效率高。( ）2.促溶剂PEG的最适使用浓度为60%80%。（ ）3。融合过程中PEG作用细胞的时间通常以12min为宜。( ）4.在单抗制备过程中可以采用任何品系的动物进行免疫。（ ）四、简答题1.HAT培养基筛选杂交瘤细胞的机理是什么?答：HAT培养基是含次黄嘌呤（H）、胸腺嘧啶核苷（T）及氨基蝶呤（A）的一种选择培养基，这三种成分均与细胞DNA合成有关.A可阻断细胞利用正常途径合成DNA，细胞在含有氨甲喋呤的培养基中不能通过正常途径合成DNA。这时正常细胞可以通过“补救途径,由TK和HGPRT酶利用T和H合成核酸而繁殖.瘤细胞是HGPRT酶阴性细胞，自身不能通过补救合成途径合成DNA而繁殖.B细胞虽含有HGPRT，但在体外培养只存活57d。融合细胞（杂交瘤细胞）含有B细胞和瘤细胞，其中瘤细胞能利用B细胞的HGPRT酶通过补救途径合成DNA而繁殖.因此在HAT培养基中，HGPRT- 或TK-瘤细胞死亡，淋巴细胞亦逐渐死亡,只有融合成功的杂交瘤存活。2.骨髓瘤细胞和脾细胞融合过程中应特别注意的几个问题是什么?答：(1)细胞比例。骨髓瘤细胞与脾细胞的比例可从1：2到1：10不等，常用1:5到1:10之间的比例。（2)反应时间。各个步骤都需在规定的时间下严格操作。（3)反应温度。整个融合过程都要在370C的水浴中进行，所需试剂要在370C预热。（4）PEG的选择.相对分子质量为10006000的PEG均可用，分子量越大，毒性越强,单分子量过小,又影响融合效果。3。单克隆抗体和多克隆抗体有何区别？答：如果用经免疫过的动物的脾细胞获得杂交瘤细胞，则得到单克隆抗体，如果用动物的血清,则得到多克隆抗体。单抗是有单个细胞起源的细胞克隆分泌的，所以只针对蛋白抗原的单一抗原决定簇，而多抗是有多个不同克隆的B细胞产生的,是多种细胞的混合物,但其中的每一种抗体也只是针对一种决定簇。多克隆抗体纯度较低、特异性较差、易引起交叉反应和过敏反应，且产量有限。单克隆抗体性质纯、效价高、特异性强，可以避免交叉反应，提高了抗原-抗体反应的敏感性和特异性。第八章 植物细胞培养概论一、名词解释外植体：在植物组织培养中由活体植物上提取下来的，接种在培养基上的无菌细胞、组织、器官等，称为外植体。愈伤组织：指在人工培养基上，由外植体的表面形成的一团不定形的排列疏松的薄壁细胞.脱分化:指在植物组织细胞培养中，一个成熟细胞或已分化细胞转变为未分化状态的过程。细胞全能性：每个细胞都携带着一套完整的基因组，因此具有发育成完整植株或个体的潜在能力。二、判断题1.愈伤组织是脱分化的植物组织细胞。（F）2。在植物组织培养和细胞培养中都包含愈伤组织培养。（T)3.植物细胞培养的主要目的是获得所需的细胞和各种所需的产物。（T）三、填空1、外植体经自来水冲洗后应进行（浸润灭菌、灭菌剂处理、无菌水刷洗）三步，完成灭菌过程。2、植物组织培养的理论依据是植物细胞的全能性3、1943年，(White）正式提出植物细胞全能性理论，认为每个植物细胞具有母株植物的全套遗传信息，具有发育成完整植株的能力。4、植物生长点附近的病毒浓度很低甚至无病毒,利用（茎尖分生）组织培养可脱去病毒，获得脱毒植株。5、用于外植体表面灭菌的灭菌剂主要有（次氯酸钙)、（过氧化氢）、（氧化汞）等。四、问答题1、植物细胞培养和植物组织培养的不同体现在哪些方面？答： 培养对象不同：一般来说，以各种植物的器官和组织，如根、茎、叶、花、未熟的果实、种子、愈伤组织等为培养对象的培养技术属于植物组织培养;而以各种形式的植物细胞，如脱分化的薄壁细胞（愈伤组织)、单细胞、单倍体细胞、原生质体、小细胞团、固定化细胞等为培养对象的培养技术属于植物细胞培养。愈伤组织培养既属于组织培养又属于细胞培养。 培养目的不同: 植物组织培养的主要目的是获得所需的植物组织和再生植株，还可以生产某些次级代谢物，在名贵花、木、瓜、果种苗(试管苗）的产业化生产、种苗的脱毒、植物的大规模快速繁殖等方面具有重要的意义和应用价值；而植物细胞培养的主要目的是获得所需的细胞和各种所需的产物，也可以利用植物细胞培养进行生物转化，将外源底物转化为所需的产物，还可以利用植物细胞培养进行种质保存、人工种子的制备和植株的大规模快速繁殖等.2、植物细胞培养在农业方面有哪些应用？答： 在植物育种方面的应用：（1）单倍体育种：通过花药（花粉)培养获得单倍体植株，然后通过秋水仙素处理使其染色体加倍，可以迅速使后代基因型纯和，加速育种进程。 （2）胚培养：采用幼胚（或胚胎、胚珠等）离体培养使自然条件下早熟的幼胚发育成熟，获得杂种后代。 （3）体细胞杂交:体细胞杂交是打破物种间生殖隔离，实现其有益基因的交流，改良植物品种，以达到创造植物新类型的有效途径。 （4）细胞突变体的诱变与筛选:在培养过程中，培养物的细胞处于不断分裂的状态，易受培养条件和外界压力的影响而发生变异。 （5）遗传转化:可以获得抗逆,高产及优质的转基因植株,能解决植物育种中用常规杂交方法所不能解决的问题，并能与常规育种方法相结合，建立高效育种技术体系。 在植物脱毒方面的应用:许多植物，特别是无性繁殖植物均受到多种病毒的侵染，造成严重的品种退化，产量降低，品质变劣,利用茎尖分生组织培养可脱去病毒，获得脱毒植株。 在离体快繁方面的应用：传统的植物繁殖是在田间或在温室中进行有性繁殖或无性繁殖，效率低，时间长，不利于优良品种和新品种的大规模推广应用。由于植物离体繁殖快速，而且材料来源单一，遗传背景均一，不受季节和地区等的限制,重复性好，离体快繁比常规方法快数万倍至百万倍。 在植物种质资源保存方面的应用:利用植物细胞继代培养或者冷冻保存的方法进行种质保存，不仅简单方便,而且可以使植物的遗传特性得以长期稳定地保存,对于稀有植物品种、优良植物品种和新型植物品种的种质保存具有重要的意义。同时，离体保存的材料不受各种病虫害侵染，而且不受季节的限制，所以利于种质资源的地区间及国际间的交换。3、外植体的清洗和灭菌如何操作？答：可应用70%酒精和一定浓度的次氯酸钠溶液来灭菌外植体，其方法如下： 材料的选取与清洗 1）选择无菌斑和虫害的植株作为母株。 2）剪取所需叶片、茎段（23厘米）及根等材料，在自来水下冲洗掉泥土等杂物。 3）在加有洗洁精的水中清洗材料，并用自来水冲洗干净，分装如干净的三角烧瓶中，备用。 灭菌（在超净工作台上操作） 1） 在装有材料的三角瓶中加入70酒精至浸没材料， 12分钟(可根据材料经试验而定）后迅速倒掉酒精。 2）在装有材料的瓶中加入620%的安替福明溶液530分钟（浓度和时间可根据材料经试验而定)，在此过程中不断摇晃三角瓶并用火焰烧瓶口数次. 3）在无菌条件下，用无菌水将材料冲洗至少三次，即可.第九章 植物细胞培养的条件一、选择题1. 接种工具灭菌常采用（A) A。灼烧 B.高压 C。过滤 D。熏蒸2.具有促进愈伤组织生产的物质是（B ) A。维生素PP B。维生素B1 C.维生素B6 D.甘氨酸3.微量元素母液的配制浓度（ B ） A.10倍 B。100倍 C。1mg/ml D.10mg/ml4.配制10倍大量元素母液,所需硝酸铵( C ）mg A.9000 B.3700 C。16500 D.44005.配制100倍有机物母液时，所需维生素B1( B ）mg A.0.4 B.10 C。100 D.