细胞工程练习题样本.doc

资料内容仅供您学习参考，如有不当或者侵权，请联系改正或者删除。细胞工程练习题第一章 细胞工程简介1、 什么叫细胞工程? 细胞工程( Cell engineering) 是指以细胞为对象, 应用生命科学理论, 借助工程学原理与技术, 有目的地利用或改造生物遗传性状, 以获得特定细胞、 组织产品或新型物种的一门综合性科学技术。2、 简述细胞工程的应用? 动植物快速繁殖。主要是指采用细胞工程技术实现优良动植物的快速繁殖以及濒危物种的保护。主要技术包括: 试管植物、 人工种子、 试管动物、 克隆动物等。细胞重组与新品种培育。主要是指在细胞、 细胞器、 染色体、 细胞核或组织水平上进行遗传性状改良或培育出生物新品种。细胞工程生物制品。利用动植物细胞、 组织培养或者转基因动植物生物反应器生产生物制品是现代细胞工程的一个代表性领域, 主要包括食品、 药物、 生物能源等。细胞疗法与组织修复。干细胞是当今生命科学最前沿领域, 有望给现代医学带来一场革命。利用培养的细胞或者离体再造的组织修复受损细胞与组织或器官的技术, 属于细胞工程最新发展领域之一。3、 细胞工程与其它学科的关系第五章 植物人工繁殖一、 名词解释细胞全能性(totipotency): 指分化细胞保留着全部的核基因组, 具有生物个体生长、 发育所需要的全部遗传信息, 具有发育成完整个体的潜能。细胞脱分化( Dedifferentiation) : 脱分化又称去分化, 是指分化细胞失去特有的结构和功能变为具有未分化细胞特性的过程, 即分化的细胞在适当条件下转变为胚性状态而重新获得分裂能力的过程。细胞再分化( Redifferentiation) : 是指在离体条件下, 无序生长的脱分化的细胞在适当条件下重新进入有序生长和分化状态的过程。细胞再分化过程事实上是基因选择性表示与修饰的人工调控过程。植物组织培养( Planttissue culture) : 是将植物器官、 组织、 细胞或原生质体等外植体材料无菌条件下培养在人工培养基上, 在适当条件下诱发长成完整植株的一种技术。外植体( Explant) : 主要指用于离体培养的植物或组织切段。愈伤组织: 由外植体组织增生的细胞产生的一团无特定结构和功能的薄壁细胞团。体细胞胚( Somaticembryo) : 又叫胚状体, 是指离体培养条件下没有经过受精过程而形成的胚胎类似物。人工种子( Artificial seed) : 又称合成种子(Syntheticseed)或体细胞种子(Somaticseed), 是指将植物离体培养中产生的胚状体或芽包裹在含有养分和保护功能的人工胚乳(Artificialendosperm)和人工种皮(Artificialseed coat)中形成的类似种子的颗粒。二、 简答题1、 植物组织培养的优点? ( 1) 周期短, 便于人工控制培养条件。繁殖速度快, 经济效益高。( 2) 占用空间小, 不受地区、 季节限制。( 3) 繁殖珍稀、 濒危苗木和突变体, 是优良品种培育的有效途径。( 4) 利于保持原来品种的特性。2、 植物细胞培养过程中植物激素的种类和作用? 植物激素(Phytohormone)是植物自然状态下产生的、 对生长发育有显著作用的微量有机物。能影响生长和分化。植物体内的激素与细胞内某种称为激素受体的蛋白质结合后, 影响DNA、 RNA和蛋白质的合成, 并对特殊酶的合成起调控作用, 从而表现出调节代谢的功能。生长素: 是由色氨酸经过一系列中间产物形成的。在植物组织培养中, 生长素主要用来刺激细胞分裂和诱导根的分化。常见的生长素有: 吲哚乙酸( IAA) 、 2, 4-二氯苯氧乙酸( 2, 4-D) 、 萘乙酸( NAA) 、 吲哚丁酸( IBA) 等。其中吲哚乙酸在植物体内普遍存在, 是生理活性最强的生长素。细胞分裂素( Cytokinin) : 大多是嘌呤族衍生物, 自然状态下分裂素主要在根中形成, 茎端、 萌发中的种子、 发育中的果实和种子也能合成分裂素。分裂素的生理作用主要是引起细胞分裂, 诱导芽的形成和促进芽的生长。细胞分裂素主要有激动素( KT) 、 6-苄基腺嘌呤( BA) 和玉米素( ZT) 等。其中最常见的是6苄基腺嘌呤。3、 植物组织培养再生植株的器官发生途径? 植物的器官发生是指离体培养的组织或细胞团( 愈伤组织) 分化形成不定根、 不定芽等器官的过程。启动期: 启动诱导外植体细胞脱分化和分裂。主要经过向培养基中添加一定浓度、 种类和比例的外源激素刺激外植体细胞改变原来的代谢途径来诱导细胞活化, 重新获得分裂能力, 需要选择合适的较高浓度的生长素诱导剂( 如NAA、 IAA、 2-4D等) 或细胞分裂素启动诱导外植体细胞脱分化和分裂。愈伤组织诱导: 即细胞开始分裂并不断增生子细胞的过程。这个阶段一般需要降低激素浓度, 有些情况下甚至不需要生长素和分裂素。外植体外层细胞开始分裂并脱分化。质量好的愈伤组织多呈淡黄( 绿) 色或无色、 疏密适中。拟分生组织的形成: 将愈伤组织转移到有利于有序生长的条件下培养, 细胞内部开始发生一系列形态和生理变化, 分化出形态和功能不同的细胞。此时, 表层细胞分裂减慢, 内部的局部细胞也开始分裂。在若干部位出现类似形成层的细胞群, 一般称为”生长中心”, 又可称为”拟分生组织”, 该过程是器官发生的一个转变时期。器官原基和器官的形成: 拟分生组织形成后, 一些细胞分化成为管状细胞, 进而形成维管组织, 形成不同的器官原基, 进一步分化出相应的组织和器官。4、 植物组织培养的常见问题? ( 1) 玻璃化问题植物组织培养中, 常会出现一些半透明状的畸形试管植物, 这类植物体被称为”玻璃苗”, 这种现象称为玻璃化( Vitrification) 现象, 又称过度水化现象。由于玻璃苗的组织结构和生理功能异常, 因此分化能力低, 难以增殖成芽, 也难以生根成苗, 移栽大田更难成活, 已成为组培的一大问题。组织培养过程中试管苗的玻璃化现象主要是适应性的生理问题, 是不能很好适应培养基和培养环境的结果。( 2) 褐变问题褐变( Browning) 可分为酶促褐变和非酶促褐变, 主要是酶促褐变。酶促褐变是由多酚氧化酶(Polyphenoloxidase, PPO)引起的。当外值体处于机械损伤等逆境时, 细胞膜的结构遭到破坏, 酚酶催化多酚类化合物, 使其发生氧化形成棕褐色的醌类物质和水; 醌类物质经过非酶促聚合, 形成黑褐色物质(羟醌与黑色素等), 引起褐变的发生。( 3) 微生物污染造成污染的病原菌主要包括外部污染菌和内源菌。微生物污染主要由外植体带菌或培养基灭菌不彻底以及操作人员操作不慎造成。外植体带菌引起的污染与外植体的种类、 取材季节、 部位、 预处理及消毒方法等密切相关。应该严格按照无菌操作, 取材时应选择嫩梢、 新芽或胚作为外植体材料, 对外植体进行彻底消毒。针对内源菌污染, 有能够采取以下防治措施: 改进外植体消毒方法。结合常规的消毒方法, 采用间隙消毒法。即经过一般的消毒过程后, 把外植体放在不含激素和维生素的培养基中, 培养一段时间后取出, 再消毒1次; 重复检查培养物。在初代培养成功后要重复检查, 不要急于扩大繁殖; 使用抗生素。( 4) 品种限制一些植物很容易经过组织培养进行无性繁殖: 无心插柳柳成荫。当前被子植物组织培养成功的比较多。然而, 裸子植物组织培养成功的比较少, 很难脱分化诱导成具有全能性的细胞。5、 人工种子的结构和优点? ( 1) 人工种子的结构: 从外向里包括三部分, 与天然种子具有类似的结构: 人工种皮外层, 保护胚状体中的水分免于丧失和防止外部力量冲击; 人工胚乳, 含有必须的营养成分和某些植物激素; 胚状体或芽。( 2) 人工种子优点: 便于运输和储藏。人工胚乳可根据不同植物的要求配制, 经过加入植物激素、 有益微生物或抗病、 抗虫成分, 使人工种子优越于天然种子。能够固定杂种优势, 加速良种繁育。可作为植物基因工程和遗传工程的载体。可保存珍贵稀有植物品种。利于快速繁殖, 生产效率高。第六章 动物人工繁殖一、 名词解释胚胎工程( Embryonic engineering) : 是对哺乳动物的胚胎进行操作, 让它继续发育获得人们所需要的成体动物的一种技术。包括胚胎培养、 胚胎移植、 胚胎分割与融合、 胚胎性别鉴定、 胚胎保存等。试管动物( test-tube animal) : 体外受精动物也称试管动物, 是指将供体的精子和卵子在体外受精, 体外培养胚胎发育到一定阶段经过胚胎移植移入受体完成发育出生的动物。胚胎移植(Embryo transfer, ET): 是指将受精卵或发育到一定阶段的胚胎移植到与供体同时发情排卵、 但未经配种的”受体”母畜输卵管或子宫的技术。发育阻滞(Developmental block): 体外受精的早期胚胎在体外发育中, 往往会停止在某一阶段不再发育, 这种现象称为发育阻滞。人造多胎: 是指应用人类辅助生殖技术(Assisted Reproductive Technology ,ART)使一次妊娠有两个以上的胎儿。细胞核移植( Cellnuclear transfer) : 是一种利用显微操作技术将一种动物的细胞核移入同种或异种动物的去核成熟卵细胞内的技术。克隆(Clone): 本意是指遗传上完全相同的分子、 细胞或来自同一生物个体的无性繁殖群体。广义上的克隆包含有基因水平、 细胞水平、 胚胎水平、 个体水平上的复制。细胞工程的克隆是指经过无性繁殖手段获得遗传背景相同的细胞群或个体的技术。体细胞克隆技术: 将动物体细胞经过抑制培养使其处于休眠状态, 利用细胞核移植技术将其导入去核卵母细胞, 培育成早期胚胎, 将胚胎移植至受体, 妊娠产仔培育出与核供体一样的成体动物的一种细胞工程技术。第三代试管婴儿: 经过种植前遗传学诊断培育出的试管婴儿被称为第三代试管婴儿。二、 简答题1、 试管动物的优点( 1) 发挥优良母畜的繁殖潜力: 一头优良品种母牛的卵巢内有几万个生殖细胞, 但在一个正常性周期内只有几个卵泡同时发育, 最后一个卵泡成熟并排卵。一只良种母畜一生大约只能繁殖10个左右的后代, 大部分时间用于妊娠和哺乳。加快优良家畜品种的推广速度一直是畜牧科研的主攻方向之一。试管动物繁殖技术能够充分利用母体生殖潜力, 满足大规模、 快速繁殖优良动物品种的需要。( 2) 促进家畜改良的速度: 繁殖能力的提高能够使一头母畜在一个性周期内繁殖更多的仔畜, 从而促进家畜改良速度, 加速育种过程。( 3) 保存遗传资源: 由于胚胎超低温冷冻技术在生产中的应用, 人们能够不受时间、 地点的限制, 进行受精卵或胚胎的长期保存, 优良胚胎的利用率大大提高。对优良或稀有哺乳动物建立”胚胎库”, 意义重大。2、 X、 Y精子的分离方法? X、 Y精子在物理和化学上存在差异, 例如精子的耐酸碱性, Y精子有嗜碱性, 而X精子有嗜酸性, 能够采用相应的方法分离, 选择相应的雄性配子。离心分离法: X精子DNA含量略大于Y精子, 因此X精子密度较Y精子略大, 因此能够采用离心分离。优点是分离时间短、 对精子损伤小。缺点是因为X、 Y精子密度相差不大( 0.007g/m3) , 分离困难, 对仪器精度要求高。电泳分离法: 利用表面电荷差异采用电泳进行分离。精子带负电荷, Y精子负电荷略小于X精子, 因此在中性缓冲液中, X精子向阳极移动的速度较快。优点是操作方便, 缺点是分离效率不高。免疫学分离法: Y精子上存在雄性特异性组织相容性抗原( H-Y抗原) , 利用H-Y抗体检测精子质膜上是否存在H-Y抗原, 以此分离X精子( H-Y抗原阴性) 和Y精子( H-Y抗原阳性) 。流式细胞仪分离法: 根据X、 Y精子上DNA含量的微小差别, 经过流式细胞仪(Flowcytometer)进行分离。首先将精子稀释并与荧光染料Hoechst 33342混合, 这种染料能够定量地与DNA结合。精子经过检索仪时被激光束激发, 由于X精子比Y精子含较多的DNA, X精子放射出较强的荧光信号。放射出的信号经过计算机系统分辨X精子和Y精子。借助两块各自带正电或负电的偏斜板, 把X或Y精子分别引导到2个收集管中。3、 细胞核移植克隆动物技术的主要环节? 核供体细胞获得与取核供核细胞能够是动物原代细胞或传代细胞。分离制备单个动物细胞, 体外培养得到正常二倍体体细胞系, 然后进行15 天的缺血饥饿培养, 诱使细胞处于”静止”状态( 一般进入G0 期) 。采用细胞松弛素B( CytochalasinB) 诱发细胞排核或者显微操作取核等方法得到细胞核。受体细胞去核能够用微细玻璃管吸除第一极体及处于分裂中期的染色体和周围的部分细胞质。也用荧光染料Hoechst33342对卵细胞DNA进行染色, 在紫外观察下去核可提高去核成功率。也能够使用Hoechst33342与卵细胞DNA结合后, 用紫外线定点照射使核功能丧失。细胞核移植细胞核移植能够采用胞质内注射和透明带下注射方法。前者是用微吸管吸取供体核后, 直接注射进卵子细胞质; 后者是把细胞核注射进透明带和卵细胞间的卵周隙中。激活正常受精卵的发育启动和早期卵裂主要由卵母细胞胞质中母源信息所控制, 成熟的卵母细胞质能使移入的细胞核在形态上和功能上发生变化, 从而导致供核回复到初始状态, 基因从头开始顺序表示。重组胚的发育需要进一步激活, 能够采用电激活和化学激活方法。电激活是可把重组胚放在电融合槽两极之间, 用几次瞬时直流脉冲刺激使其激活。化学激活常见的激活剂包括乙醇、 SrCl2、 放线菌酮、 离子霉素等。重组胚培养和移植激活后的重组胚能够采用体内和体外两种培养方式。体内培养是将重组胚植入同种或异种动物的输卵管中发育至囊胚或桑葚胚, 然后进行胚胎移植。体外培养是将重组胚在特定培养液中培养至囊胚, 选择优质胚胎移入同种的同期发情的受体中继续发育。体细胞核移植后代的鉴定对于体细胞核移植培育的动物, 能够从形态性别上鉴定, 还能够采用分子生物学技术鉴定。第七章 细胞重组与细胞融合一、 名词解释细胞重组( Cellrecombination) : 是指从活细胞中分离出细胞器及其组分, 在体外进行重新装配成为具有生物活性的细胞的一种技术。细胞融合( Cell fusion) : 也叫细胞杂交( cell hybridization) 是指使用人工方法使两个或两个以上的细胞合并形成一个细胞的技术。同核体( Homokaryon) : 基因型相同的细胞融合成的融合细胞称为同核体。异核体( Heterokaryon) : 来自不同基因型的融合细胞则称为异核体。对称融合( Symmetricfusion) : 两个完整的细胞间的融合。不对称融合( Asymmetricfusion) : 利用物理或化学方法使某亲本的核或细胞质失活后再与另外一个完整的细胞进行融合。原生质体: 去除细胞壁后裸露的细胞称之为原生质体。二、 综述细胞融合的方法? 细胞融合的方法: 物理法、 化学法及生物法。原理: 增加细胞间的粘附、 改变膜的通透性, 随机结合、 融合。物理法电融合诱导法在直流电脉冲的诱导下, 极化产生偶极子, 彼此靠近, 定向排列成串球状。它包括三个过程, 第一阶段: 排列。细胞膜紧密接触彼此吸引; 第二阶段: 在高电场下非常短的电脉冲, 在细胞膜上产生电穿孔; 第三阶段, 细胞膜相互接触直到形成稳定的胞膜联接。生物法各种病毒都具有凝集细胞的能力, 它一边粘接在一个细胞表面, 另外一边粘接在另一个细胞表面, 从而使两个细胞在病毒的作用下靠近发生凝结。灭活后的病毒颗粒结合到原生质体表面。两受体细胞开始凝聚。两细胞的膜紧密结合。病毒被膜与受体细胞的浆膜融合。病毒颗粒周围的膜脱离整个膜, 产生破口, 在两细胞间形成细胞质通道( 37度下1-2分钟) , 通道继续扩大, 病毒颗粒流入细胞质内, 细胞质互相融合。融合细胞变圆, 融合结束。化学法包括PEG诱导、 高Ca2+和pH诱导PEG结合诱导等。聚乙二醇(Polyethylene glycol,PEG)是一种多聚化合物, PEG与溶液中自由水结合, 高度脱水后引起原生质体凝聚、 扭曲变形、 细胞膜连接处发生融合, 形成很小的细胞桥, 之后扩大, 最终彻底融合。高Ca2+和pH诱导PEG结合诱导。高Ca2+机制: 带负电荷间的原生质体在钙离子的连接下形成静电键钙桥, 促使异源的原生质体间粘着和结合。高pH: 增加Ca2+在细胞表面的黏附, 从而促进两原生质体的接触。进一步提高了PEG法的效率。三、 对融合细胞进行筛选的原因与方法1、 筛选的原因与必要性细胞融合是一个随机的物理过程, 经融合后细胞将以多种形式出现, 需要经过培养和筛选, 除去不需要的细胞, 分离出需要的杂种细胞, 从而解决融合细胞的选择问题。2、 杂种细胞筛选方法( 1) 细胞形态大小差异。( 2) 选择性培养基筛选法: 利用原生质体对培养基成分要求与反应的差异选择杂种细胞的方法。例如: 利用抗性标记、 酶缺陷型、 激素需求差异等。亲本原生质体生长要求外源激素, 而有的杂种细胞由于双亲互补作用会产生内激素, 从而使杂种细胞能在无激素的培养基上生长。( 3) 再生后杂种与亲本形态、 性质差异。第八章 新品种培育一、 名词解释体细胞杂交( Somatic cell hybridization) : 是指将不同来源的体细胞融合并使之分化再生、 形成新品种的技术。同工酶( isoenzyme) : 是催化的化学反应相同而理化性质、 免疫学活性都不同的一组酶。染色体工程: 按照一定的设计, 有计划地消减、 添加或代换同种或异种染色体, 从而达到定向改变遗传性和选育新品种的目的的技术。二、 简答题1、 体细胞杂交的步骤? ( 1) 一般先将两种不同植物的体细胞经过纤维素酶、 果胶酶消化, 除去其细胞壁得到原生质体。( 2) 再经过物理或化学方法诱导细胞融合形成杂种细胞。( 3) 继而再以适当的技术进行杂种细胞的分检和培养。( 4) 促使杂种细胞分裂形成细胞团、 愈伤组织、 直至形成杂种植株, 实现基因在远缘物种间的转移。2、 体细胞杂种植物的鉴定方法? 形态学鉴定: 根据茎、 叶、 花等组织的形态、 颜色来鉴别杂种。两亲本的亲源关系较远时, 杂种植物的形态倾向于亲本之一, 但存在差异。细胞学鉴定: 原生质体融合的亲本材料一般为二倍体, 杂种细胞的染色体应该为双二倍体。如果亲本的亲源关系较远, 染色体差异会较大; 同时, 杂种细胞中一亲本的染色体可能会受到另外一亲本的排斥, 可能会产生大量非整倍体。因此能够从杂种植物染色体的形态、 大小和数目上鉴定是否是杂种植物。同工酶( isoenzyme) 鉴定: 同工酶是催化的化学反应相同而理化性质、 免疫学活性都不同的一组酶。由于蛋白质分子量和表面所带电荷不同, 其等电点也不同, 故在电场中移动的速率不同而使蛋白质分离。由于同工酶理化性质、 免疫学活性都不同, 因此能够用电泳法分离。杂种植物的同工酶谱是双亲本酶谱的总和, 表现为条带增多、 酶带颜色加深、 宽度加大, 有时还出现两亲本都不具有的新谱带或者丢失部分亲本酶带。常见来作为分析对象的有乙醇脱氢酶、 乳酸脱氢酶、 过氧化物酶、 酯酶、 氨肽酶、 核酮糖二磷酸羧化酶等。DNA分子标记鉴定: 是在分子水平对亲本和杂种植物遗传性状差异进行鉴定, 能正确揭示出生物个体间核苷酸序列的差异。3、 为什么植物的多倍体比动物的多倍体多? 植物多倍体现象比动物广泛, 植物远源杂交能力强, 异花传粉。多为异源多倍体。动物多倍体少, 高度不育。低等动物存在, 多为同源多倍体。植物的繁殖比较容易, 如果多倍体植物不能形成种子, 它还能依靠营养器官的无性繁殖来产生后代, 因此在生物进化过程中, 植物多倍体有可能被保存下来。而动物则不同, 特别动物有性别分化后, 大多数动物是雌雄异体, 染色体稍不平衡, 就会造成联会紊乱, 引起不育, 甚至使动物个体不能成活。即使有多倍体的动物个体的话, 一般也只能靠无性生殖来维持, 而无性生殖的个体对环境的适应能力很弱, 因此进化中很难形成一稳定的种。第九章 植物细胞代谢产物制备一、 名词解释植物细胞培养( Plantcell culture) : 在离体条件下, 将分离的植物细胞经过继代培养增殖, 获得大量细胞群体的一种技术。看护培养( nursingculture) : 用一块活跃生长的愈伤组织来看护单个细胞, 使其持续分裂和增殖。这块愈伤组织被称为看护组织。饲养层培养( Feederlayer culture) : 把处理过的( 如X射线处理) 无分裂能力或分裂很慢的细胞来饲养所需培养的细胞, 使其分裂和生长。细胞悬浮培养( Cellsuspension culture) : 将细胞接种于液体培养基中并保持良好的分散状态的培养方式。生物反应器( Bioreactor) : 一般所说的生物反应器是指细胞培养生物反应器, 是为细胞生长提供合适的化学与物理环境并能检测控制细胞生长的装置。毛状根( Hairyroot) : 毛状根又名发状根, 是植株或组织、 器官受到发根农杆菌感染后而形成的类似头发一样的根组织。二、 简答题1、 获得植物单细胞的方法? 植物细胞培养首先需要从植物样品制备单细胞。植物单细胞的获得一般有三种方法: 机械法、 愈伤组织法和酶解法。机械法经过机械磨碎、 切割等操作获得游离的细胞, 效率低, 容易对细胞造成损伤。酶解法选择专一性水解酶在温和的条件下将植物细胞壁物质降解, 从而使细胞彼此分开, 这种方法称为酶解法。经常采用的生物酶包括: 琼脂酶、 果胶酶、 蜗牛酶、 纤维素酶等。愈伤组织法经过培养植物外植体诱导产生愈伤组织, 并使其大量增殖, 再经过机械震荡或者酶解的方法使细胞分离从而获得游离的细胞。2、 植物细胞分化与代谢产物的关系? 大多数植物次级代谢产物与细胞分化有关。离体培养的植物细胞存在不稳定、 目标产物含量低、 需要激素等不足。因此, 分化程度较高、 遗传更稳定的植物组织培养在有价值次级代谢产物生产上展现了应用潜力。细胞分化与次生代谢产物: 许多植物次生代谢产物的合成与叶绿体的分化有关。反映了细胞分化程度的提高与次生代谢产物含量有一定的相关性。细胞聚集和组织水平上的分化: 在聚集的细胞团块中, 位于表面和中央的细胞处于不同的分化状态, 从而常表现出与游离细胞不同的次生代谢能力。例如: 小果咖啡培养物中嘌呤环生物碱的合成取决于细胞团块的大小。器官水平上的分化: 有些植物的某种次生代谢产物在某个器官中含量较高, 在悬浮培养细胞中含量较低或没有。例如: 柴胡根中含有效成分柴胡皂苷, 其愈伤组织一般不能合成这类化合物。有些植物的培养物在合成次级代谢产物时要求有芽的形成。例如: 长春花的脱分化培养细胞中很难获得具有抗癌活性的长春花碱, 而在培养的长春花簇芽中能测定出长春花碱。3、 农杆菌诱导植物组织形成毛状根的方法? ( 1) 农杆菌含有Ri质粒, Ri质粒是位于农杆菌染色体之外的独立的双链环状DNA, 具有2个主要的功能区: T-DNA区和Vir区。T-DNA上有生长素合成基因tms1和tms 2, 指导IAA(吲哚乙酸)的合成。在一般状态下,Ri质粒上Vir区的基因处于抑制状态, 当农杆菌感染寄主植物时, 受损伤的植物细胞合成的低分子苯酚化合物乙酰丁香酮使Vir区处于抑制状态的基因被激活, 产生一系列限制性核酸内切酶, 在酶的切割作用下产生T-DNA链, T-DNA进入植物细胞核内, 整合进植物细胞的基因组。T-DNA在植物细胞中得到转录和翻译, 刺激植物细胞形成毛状根。( 2) 外植体接种法: 取植物的叶片、 茎段、 叶柄等无菌外植体, 与发根农杆菌共同培养23天, 将植物的外植体移到含有抗生素的选择培养基上进行培养, 经过多次继代培养, 转化的植物细胞产生愈伤组织, 并可产生毛状根。( 3) 茎杆接种法: 将植物种子消毒后, 在合适的培养基上萌发, 长出无菌苗。取茎尖继续培养, 等无菌植株生长到一定时候, 将植株的茎尖、 叶片切去, 剩下茎杆和根部, 在茎杆上划出伤口, 将带Ri质粒的发根农杆菌接种在伤口处和茎的顶部切口处, 经过一段时间培养, 在接种部位产生毛状根。( 4) 原生质体-农杆菌共培养法: 原生质体培养3-5天后, 加入带Ri质粒的发根农杆菌进行共培养, 然后借助于转化后的细胞激素自养型特性或T-DNA上的抗菌素标记筛选出转化成功的细胞。分裂形成愈伤组织, 在无激素培养基上可产生毛状根。第十章 微藻培养与应用一、 名词解释微藻( Microalgae) : 一般是指那些在显微镜下才能辨别形态微小的藻类。光生物反应器( Photobioreactor) : 是设计有光源系统的主体为透明材料的生物反应器, 主要用于可进行光合作用的微藻、 植物细胞、 光合细菌的培养。二、 简答题1、 微藻作为培养对象生产生物制品有哪些特点? 利用太阳能和CO2经过光合作用生产有机物, 生长速度快、 效率高、 能耗低。微藻提取有效成分不需要复杂的前处理。种类多, 许多微藻可产生有生理活性的化合物。能够利用贫瘠土地、 盐碱地等极端环境。微藻培养简单, 容易产业化。微藻中含有丰富的蛋白质、 多不饱和脂肪酸、 维生素、 多糖、 矿物质等。微藻中的许多生物活性物质具有抗肿瘤、 抗病毒、 抗真菌、 防治心血管疾病、 防治老年人痴呆症等功能。例如: 多不饱和脂肪酸( EPA/DHA)可预防动脉硬化、 血栓形成和高血压, 对大脑发育和增强记忆有重要作用。胡萝卜素具有防癌、 预防心血管疾病、 提高机体免疫力、 抗衰老等作用。藻胆蛋白具有抗癌作用。螺旋藻多糖具有减少辐射损伤、 保护造血功能、 增强免疫力、 抗肿瘤等特性。2、 微藻有哪几种营养方式? 对应的能够采用怎样的反应器或培养方式? ( 1) 微藻的营养模式模式能源碳源光能自养光二氧化碳混合营养/兼性异样光有机碳和二氧化碳光能异养光有机碳化能异养有机物有机碳( 2) 微藻培养方式光能自养培养技术A、 敞开式培养: 跑道池B、 光生物反应器培养光生物反应器( Photobioreactor) 是设计有光源系统的主体为透明材料的生物反应器, 主要用于可进行光合作用的微藻、 植物细胞、 光合细菌的培养。优点: 培养密度高, 收获效率也显著提高; 培养条件易于控制, 易于实现高密度培养, 对代谢产物积累有利; 无污染, 可实现纯种培养; 不受地域环境限制, 生产期长; 适合于所有微藻的光自养培养, 特别适合于微藻代谢产物产品的生产。异养培养技术: 指在无光照条件下, 利用外源有机物包括糖类、 蛋白水解物、 有机酸等生长。与自养相比的优点: a、 微藻生长速度快、 细胞密度高。在异养培养时, 微藻细胞密度可达到或接近大肠杆菌及酵母的浓度。b、 从工业化角度分析, 异养培养系统更便于生产过程的控制及稳定生产。在封闭的生物反应器中进行微藻异养培养不但可实现纯种培养而且可保证生产的重复性和连续性。c、 解除了光对微藻生长的限制, 降低了微藻生产成本。d、 微藻异养培养可采用微生物培养中的成熟技术及设备, 易于规模放大, 加快微藻及其产品的产业化进程。混养培养技术特点: 有光照的条件下, 既利用CO2进行光合作用又利用外源有机物生长, 培养。第十一章 动物细胞培养生物制药一、 名词解释动物细胞培养( Animal cell culture) : 模拟体内生理环境使分离的动物细胞在体外生存、 增殖的一门技术。接触性抑制(Contactinhibition): 是某些动物细胞体外培养的生长特性之一,是指由于细胞相互接触而抑制细胞运动性的现象。密度抑制(Densityinhibition): 细胞接触汇合成片后, 只要营养充分, 细胞仍能进行增殖分裂,可是当细胞密度达到一定程度后, 营养相对缺乏, 代谢产物增多, 发生密度抑制现象。无血清培养基(Serumfree medium,SFM): 是不含血清的动物细胞培养基, 由基础培养基和添加组分组成, 试图全部替代血清成分。原代培养( Primary culture) : 接种组织块直接长出单层细胞或将组织分散成单个细胞再进行培养, 在首次传代前的培养称为原代培养。传代培养( Passage culture/Subculturing) : 是指将原代培养的细胞继续转接培养的过程。细胞系(Cell line): 是由原代培养经传代培养纯化, 获得的以一种细胞为主的、 能在体外长期生存的不均一的细胞群体。第一次传代培养后的细胞即称之为细胞系。细胞株(Cell strain): 是指从一个经过生物学鉴定的细胞系用单细胞分离培养或经过筛选的方法, 由单细胞增殖形成的细胞群, 称细胞株。原代细胞(primary cell): 从动物体内直接分离得到的细胞。传代细胞(passage cell): 原代细胞转接后培养的细胞。工程细胞系: 采用基因工程技术对宿主细胞的遗传物质进行修饰改造或重组, 获得具有稳定遗传的独特性状的细胞系。转化细胞系: 染色体的断裂变成异倍体, 失去了正常细胞的特点, 获得了无限增殖能力的细胞。细胞转化: 指细胞发生遗传改变而产生永生化, 即由限定性细胞系转化为连续性细胞系, 能够在体外进行无限传代和生长繁殖。动物大规模培养( cell large-scale culture) : 是指在人工条件下( 设定pH、 温度、 溶氧等) 在生物反应器中高密度大量培养动物细胞生产生产生物制品的技术。球传球接种技术: 将贴满细胞的微载体与新鲜微载体混合, 实现细胞因随机碰撞而实现转移贴附在新载体表面的技术。杂交瘤技术: 将瘤细胞( 骨髓瘤) 与免疫动物的脾或淋巴细胞融合而制成杂种细胞的技术。二、 简答题1、 动物培养细胞的类型? ( 1) 悬浮型细胞: 与微生物、 植物细胞不同, 动物细胞中只有极少数细胞体外生长不必贴壁, 可在培养液中悬浮生长, 称之为悬浮型细胞。血液白细胞、 淋巴细胞、 某些肿瘤细胞等属于此类细胞。( 2) 贴附型细胞: 大多数哺乳动物细胞必须附着在带适量正电荷的固体或半固体表面才能生长。属于贴壁依赖性细胞,大致分成以下四型: A、 成纤维细胞型细胞外形与体内成纤维细胞形状相似, 细胞大致呈梭形或不规则形。成群细胞呈现放射状、 旋涡状等形式。多数细胞之间排列疏散, 有较大的细胞间隙。B、 上皮型细胞类似上皮细胞的细胞, 特点是: 扁平状, 形态较为规则, 细胞贴壁后呈三角形及不规则扁平的多角形, 中央有扁圆形核, 生长时彼此紧密连接成单层细胞。因为相互拥挤而呈现”铺路石状”, 局部能够单层的上皮状”膜片组织”。皮肤的表皮细胞、 消化管与呼吸道的上皮细胞、 肺泡上皮细胞、 消化腺上皮细胞、 血管内皮细胞等。C、 游走型细胞呈散在生长, 一般不连成片, 胞质常突起, 呈活跃游走或变形运动, 方向不规则。此型细胞不稳定, 有时难以和其它细胞相区别。D、 多形型细胞多形型细胞是一些形态上不规则的细胞。多形型细胞不常见, 只有某些像神经组织细胞等难以确定其稳定形态的, 才可归于多形细胞。体外培养呈现多形型细胞的细胞最常见的是神经原和神经胶质细胞。2、 动物细胞培养的方式? 动物细胞培养能够分为贴壁培养、 固定化培养、 悬浮培养三大类。A、 贴壁培养( Adherent culture) 是指细胞贴附在一定的固相表面进行的培养。优点: 容易更换培养液; 容易采用灌注式培养、 不需过滤系统; 同一设备可采用不同的培养液/细胞的比例、 适用于所有类型细胞。缺点: 扩大培养比较困难、 投资大; 占地面积大; 不能有效监测细胞的生长。( 1) 贴壁材料要求: 具有亲水性、 正电荷。常见材料: 硅硼酸玻璃( 卡氏培养瓶等) 、 聚苯乙烯( 96孔培养板等) 对微载体而言还要求具一定三维结构。( 2) 生长阶段游离期接种的细胞在培养液中呈悬浮态, 由于细胞质的回缩, 各种形状的细胞开始变圆。吸附期不同类型的细胞的贴壁时间有所差异, 多数细胞都可在24小时内贴壁。细胞状态不好、 培养基偏酸或偏碱、 培养瓶不洁等都不利于细胞贴壁。繁殖期悬浮细胞贴壁后经过一段停滞后开始分裂。随着细胞数量的增多, 细胞间开始接触并连接成片。出现接触性抑制。退化期细胞长满培养瓶壁, 随着营养物的消耗和代谢物的积累, 密度抑制现象出现, 细胞开始退化。细胞轮廓开始清晰, 细胞内有膨胀的线粒体颗粒堆积。如不及时传代培养, 细胞会从瓶壁上脱落死亡。B、 固定化培养能够采用类似植物细胞固定化培养的方法对动物细胞进行固定化培养。具有细胞生长密度高、 抗剪切力和抗污染能力强等优点, 细胞易于产物分开, 有利于产物分离纯化。固定化方法与植物细胞类似。C、 悬浮培养:是指细胞在反应器中自由悬浮生长。主要用于非贴壁依赖型细胞培养, 杂交瘤细胞、 血液白细胞、 淋巴细胞, 某些肿瘤细胞等属于此类细胞。贴壁型细胞贴附在微载体上或者包裹在微囊中后能够接种在适当生物反应器中实现悬浮培养。3、 微载体培养技术? 微载体培养技术是将将贴壁培养与液体培养相结合的一种动物细胞大规模培养技术。( 1) 原理将对细胞无害的颗粒-微载体加入到培养容器的培养液中, 作为载体, 使细胞在微载体表面附着生长, 同时经过持续搅动使微载体始终保持悬浮状态。贴壁依赖性细胞在微载体表面上的增殖, 要经历黏附贴壁、 生长和扩展成单层三个阶段。细胞只有贴附在固体基质表面才能增殖, 故细胞在微载体表面的贴附是进一步铺展和生长的关键。黏附主要是靠静电引力和范德华力。细胞能否在微载体表面黏附, 主要取决于细胞与微载体的接触概率和亲和性。( 2) 细胞与微载体的相融性与微载体表面理化性质有关。一般细胞在进入生理pH值时, 表面带负电荷。若微载体带正电荷, 则利用静电引力可加快细胞贴壁速度。若微载体带负电荷, 因静电斥力使细胞难于黏附贴壁, 但培养液中溶有或微载体表面吸附着二价阳离子作为媒介时, 则带负电荷的细胞也能贴附。4、 杂交瘤细胞的筛选? ( 1) 一般采用HPRT( 次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶) 与TK( 胸腺嘧啶核苷激酶) 缺陷型的骨髓瘤细胞系与B淋巴细胞融合。( 2) 融合后的细胞类型: 融合的脾细胞和瘤细胞、 融合的脾细胞和脾细胞、 融合的瘤细胞和瘤细胞、 未融合的脾细胞、 未融合的瘤细胞以及细胞的多聚体等。( 3) 正常的脾细胞在培养基中存活仅57天, 无需特别筛选, 细胞的多聚体形式也容易死去。剩余: 脾细胞与瘤细胞的融合细胞+未融合的瘤细胞+融合的瘤细胞和瘤细胞, 其中后两种需进行特别的筛选去除。( 4) HAT培养基筛选法