行业标准出口动物源性食品中动物种类的定性检测TRFLP方法编制.doc

行业标准出口动物源性食品中动物种类的定性检测 T-RFLP方法编制说明一、 任务来源根据国家认证认可监督管理委员会2009年关于下达2009年度出入境检验检疫行业标准制（修）订计划的通知下达的编写任务通知（计划编号2009B134），由北京出入境检验检疫局负责出口动物源性食品中动物种类的定性检测 T-RFLP方法的起草工作。本标准是按照GB/T1.1-2009标准化工作导则 第1部分：标准的结构与编写规则的要求进行编写的。二、标准编制的目的和意义随着人们生活水平的提高和生活节奏的加快，人们对禽、肉、鱼等食品及其加工食品（如香肠、罐头等）的需求也在不断增加。对于一些凭肉眼难以辨认其来源的动物源性食品（尤其是经过加工的食品），某些商家在经济利益的驱使下，常常用比较廉价的动物品种替代比较昂贵的动物品种。现存比较常见的商业欺诈行为之一就是乱贴标签，标签上标明的原料成分与实际使用的原料成分不符。这种行为不仅损害了消费者的经济利益和健康，而且还有可能打乱正常的市场竞争秩序。 为了更好地保护消费者的身体健康，维护消费者的经济利益，也考虑到宗教信仰问题，世界各国都对食品标签的内容做了严格的规定。例如，在新加坡市场上，食品标签必须包括食品的品名（或对食品真实性的描述用语）和食品的成分，当食品由两种或多种成分构成时，对每一种成分应按它们的重量或所占比例给予恰当说明，其顺序应按照他们占有的重量百分比递减标示。我国的预包装食品标签通则（GB7718-2004）也对食品标签的具体内容作了明确规定。国家质检总局于早在2000年就颁布了中华人民共和国进出口食品标签管理办法。该办法第二章标签审核的第十一条明确规定“进出口食品标签审核的内容包括：标签的格式、版面以及标注的与质量有关的内容是否真实、准确”。对于乱贴标签现象，世界各国也在相关法规中作出明确规定。如瑞士食品条例(Food Ordinance)的第十九章中要求食品标签不允许欺骗消费者。我国的预包装食品标签通则（GB7718-2004）中也明确规定“食品标签的所有内容，不得以错误的、引起误解的或欺骗性的方式描述或介绍食品”。法规已经明确规定食品必须加贴标签，而且食品标签不允许欺骗消费者。贯彻执行这类法规的条件之一就是食品监管机构必须具有判断食品标签是否存在欺诈行为的能力。对于动物源性食品而言，一个重要的判断依据就是检测其标签上标明的动物种类是否与实际使用的动物种类相符，即进行动物种类鉴定。因此，开展动物源性食品中动物种类鉴定方法的研究对于更好地保障我国进出口食品的质量和安全、加强对国内动物源性食品市场和生产企业的监管，从而保护消费者的切身利益具有重要意义。目前，我国已颁布的与动物种类鉴定有关的国家标准和行业标准有：1） GB/T 20190-2006 饲料中牛羊源性成分的定性检测 定性聚合酶链式反应（PCR）法2） GB/T 21101-2007 动物源性饲料中猪源性成分定性检测方法 PCR方法3） GB/T 21102-2007 动物源性饲料中兔源性成分定性检测方法 实时荧光PCR法4） GB/T 21103-2007动物源性饲料中哺乳动物源性成分定性检测方法 实时荧光PCR法5） GB/T 21104-2007 动物源性饲料中反刍动物源性成分（牛、羊、鹿）定性检测方法 PCR方法6） GB/T 21105-2007 动物源性饲料中狗源性成分定性检测方法 PCR方法7） GB/T 21106-2007 动物源性饲料中鹿源性成分定性检测方法 PCR方法8） GB/T 21107-2007 动物源性饲料中马、驴源性成分定性检测方法 PCR方法9） GB/T 21110-2007 动物源性饲料中骆驼源性成分定性检测方法 PCR方法10） SN/T 1119-2002 进出口动物源性饲料中饲料中牛羊源成分检测方法 PCR法11） SN/T 2051-2008 食品、化妆品和饲料中牛羊猪源性成分检测方法 实时PCR法从已制定的标准可以看出，已建立的常用的动物种类鉴定方法主要是物种特异引物普通PCR法和实时荧光PCR法。如果是普通PCR法，PCR产物还需要经过测序或酶切进一步确定所含物种。物种特异引物PCR或实时荧光PCR方法的检测灵敏度和特异性都很好，已建立的标准适用于鉴定猪、牛、羊、兔、狗、鹿、马、驴和骆驼9种动物成分。对于其他的动物种类，由于还没有提供特异性的引物和探针，目前所建立的标准还没有提供方法进行鉴定。而且对于牛和羊，所建立的标准不能鉴定是水牛还是奶牛，是山羊还是绵羊。在没有特异引物和探针的情况下，根据文献资料的报道，国际上更多的是采用PCR-RFLP方法，这种方法使用通用引物而不是物种特异引物对提取的样品DNA进行扩增,扩增产物经适当的限制性内切酶酶切，通过产生的酶切图谱确定动物种类。当客户需要我们鉴定送检样品中有没有某种动物成分，而这种动物成分又不在已建立标准所能鉴定的动物种类的范围内时， PCR-RFLP也不失为一种很好的解决问题的方法。一般，只需要三种以上的限制性内切酶便可以确定动物种类。对于普通的PCR-RFLP方法，PCR扩增后产物经酶切后用琼脂糖凝胶分析酶切结果。普通琼脂糖凝胶的分辨率有限，片段小于100bp时条带不仅容易弥散，而且不容易准确判断片段大小，因此这种方法的结果判断受主观影响较大。例如，我国现行的国家标准“饲料中牛羊源性成分的定性检测 定性聚合酶链式反应（PCR）法”（GB/T 20190-2006）中写到“PCR扩增产物经Sau3A I限制性内切酶酶切后，牛源性成分酶切产物的长度是57bp和214bp，绵羊源性成分酶切产物的长度是91bp和204bp，山羊源性成分的酶切产物的长度是92bp和202bp”。实际用普通琼脂糖凝胶电泳判断这种短片段的酶切产物大小是很不准确的。北京出入境检验检疫局技术中心于2008年向质检总局申报并立项了食品中动物源性成分种类识别技术研究（课题编号2008IK155）。该课题首次尝试采用荧光标记和毛细管电泳技术解决PCR-RFLP技术中普通琼脂糖电泳分辨率较低的问题。该课题于2009年2月经过专家鉴定并获得专家的一致好评。研究结果也得到国际同行的认可，文章发表在Meat Science 85 (2010): 265-269。在此课题的基础上，课题组向国家认证认可监督管理委员会提出申请并立项了行业标准出口动物源性食品中动物种类的定性检测 T-RFLP方法（计划编号2009B134）。本标准所建立的方法拓宽了我国已建立的动物种类鉴定的实验思路，可以有效完善我国已建立的动物种类领域的标准体系，为我国在动物源性食品鉴定方面提供新的技术手段和方法。三、本标准的研究过程1. 实验材料北京出入境检验检疫局动检实验室为课题组提供了马、鹿、狗、猪、牛、绵羊、鸡等动物种类的血清样本。小鼠肌肉组织由北京师范大学生命科学学院提供。三文鱼、火鸡、水牛、绵羊和山羊样本从进口样本中采集。鲟鱼样本由水产科学研究院东海水产研究所提供。2. 实验方法的建立2.1 DNA提取方法的确认2.1.1 传统方法选择最常用的SDS方法提取动物组织。操作步骤详见标准。该方法能很好地提取出动物组织中的DNA。2.1.2 试剂盒法比较了三种常用的动物组织DNA提取试剂盒的效果。三种试剂盒分别为Promega公司生产的Wizard Genomic DNA Purification Kit(Wizard 基因组DNA纯化试剂盒)、Qiagen公司生产的DNeasy Blood & Tissue Kit（血液和组织DNA提取试剂盒）和天根公司生产的TIANamp Genomic DNA Kit（TIANamp基因组DNA提取试剂盒）。天根试剂盒和Promega试剂盒提取DNA的效果比较图见图1.1。天根试剂盒和Qiagen试剂盒提取DNA的效果比较图见图1.2。从电泳结果可以看出，对于未经加工的肉制品，三个试剂盒都可以提取出完整的DNA。对于加工过的食品，由于加工过程中DNA降解，只能看见弥散的核酸，并看不到明显的条带。三个试剂盒相比，Tiagen试剂盒的效果好于Promega试剂盒，与Qiagen试剂盒提取效果相当。但是Tiagen试剂盒比Qiagen试剂盒廉价很多。2.2 目的基因的选择2.2.1 引物合成通过查阅文献，分别合成了cytb1，cytb2，cytb3和12S rRNA的通用引物，引物序列见表1.1。表1.1 cytb和12S rRNA基因通用引物序列和扩增产物长度引物名称引物序列产物长度Cytb1-F5-cca tcc aac atc tca gca tga tga aa-3359bpCytb1-R5 gcc cct cag aat gat att tgt cct ca-3Cytb2-F5aaa aac cac cgt tgt tat tca act a462bpCytb1-R5 gcc cct cag aat gat att tgt cct ca-3Cytb3-F5-cga agc ttg ata tga aaa acc atc gtt g-3464bpCytb3-R5-aaa ctg cag ccc ctc aga atg ata ttt gtc ctc a-312S-F5-aaa ctg gga tta gat acc cca cta t-3450bp12S-R5-gag ggt gac ggg cgg tgt gt-32.2.2 cytb1、cytb2、cytb3和12S rRNA扩增不同种类动物样品的扩增效果比较：分别用cytb1、cytb2、cytb3和12S rRNA引物扩增提取出来的鸡、狗、马和牛的DNA。扩增产物电泳结果见图1.3。从电泳结果来看，12S rRNA能够从全部4种动物中扩增出目的条带。cytb1和cytb2扩增不出目的条带。Cytb3能从牛肉DNA中扩增出明显的目的条带。因此决定弃用cytb1和cytb2，将cytb3和12S rRNA引物用更多的物种做进一步的比较。比较结果见图1.4。从电泳结果来看，12S rRNA能够从全部18种动物中扩增出目的条带。而cytb3只能从8种动物中扩增出明显的目的条带。因此，选用12S rRNA基因作为扩增的靶基因。 2.3 标记荧光的选择常用的荧光标记为FAM、HEX和TAMRA。为了比较这几种荧光的检测效果，设计了如下实验：取同一份鲟鱼DNA，分别用三对使用不同荧光标记组合的引物进行扩增。引物对1为12S-F-FAM，12-R-HEX；引物对2为12S-F-FAM，12S-R-TAMRA；引物对3为12S-F-HEX，12S-R-TAMRA。扩增产物回收后分别用Tru9I酶切，酶切产物用毛细管电泳检测，电泳条件如前所述。检测结果如图1.5所示。从图1.5可以看出，FAM和HEX荧光标记的整体效果最好。因此用FAM、HEX荧光分别标记上游和下游引物。2.4 酶切反应时间的确定在确定合适的酶切时间时，选用了2小时和酶切过夜（16小时）两个时间参数。以山羊样品为例，同一份PCR回收产物（浓度约为50ng/L）用同样的酶进行酶切，酶切反应所加DNA的量为2L。酶切时间分别设置成2小时和16小时。酶切结果如图所示。2.4.1 AluI酶切结果：2.4.1.1 两小时酶切结果：2.4.1.2 十六小时酶切结果：2.4.2 Tru9 I酶切结果：2.4.2.1 两小时酶切结果：2.4.2.2 十六小时酶切结果：从实验结果来看，2小时酶切和16小时酶切没有什么区别。AluI在酶切2小时时已经将扩增的目的DNA片段完全酶切。Tru9I在酶切2小时后有大量325bp的片段没有酶切完全，但是延长酶切时间后酶切图谱并没有什么改变。从项目组前期的经验来看，如果酶切位点很接近，都出现了酶切不完全的情况。综上，认为2个小时的酶切时间对于100ng左右的DNA已经足够，因此将酶切反应时间设定为2小时。2.5 13种动物T-RFLP酶切图谱的建立经过前期的实验摸索，项目组已经确定了T-RFLP方法的各个具体环节的操作方法。项目组用得到的经过测序验证已知种属名称的13种动物的DNA按照已经确定的实验步骤进行操作，建立了这13种动物的双末端荧光标记T-RFLP图谱。2.5.1 理论结果：项目组设定用AluI和Tru9I鉴定所涉及13种动物。Tru9I和AluI在13种动物12S rRNA基因片段中的酶切位点如表1.2所示。鉴定的实验思路如图1.6所示。图1.6 AluI和Tru9I鉴定13种动物的鉴定流程图。2.5.2 实验结果2.5.2.1 实验步骤：2.5.2.1.1 样品DNA的提取：使用Tiagen试剂盒，详细操作步骤见说明书。2.5.2.1.2 12S rRNA靶基因的扩增：使用ABI9700 PCR仪。扩增条件体系和反应参数见表1.3和表1.4。表1.3 PCR反应体系名称储存液浓度终浓度加样量PCR 缓冲液（含Mg2+）1014 LdNTP2.5 mmol/L200 mol/L3.2 LMgCl250mmol/L1.75 mol/L1.2 L上游引物(12S-F-FAM )10 mol/L0.4 mol/L1.6 L下游引物(12S-R-HEX )10 mol/L 0.4 mol/L1.6 LTaq 酶5 U/L0.1 U/L0.8 LDNA 100ng无菌去离子水补足至40L表1.2 Tru9I和AluI在13种动物12S rRNA基因片段中的酶切位点水牛鸡山羊绵羊牛狗三文鱼鲟鱼马猪鹿鼠火鸡440443438439439435433434450439439436441AluI 52423962382398988387882108821047624022768990388240Tru9 I 5533499340231532434732534891903443743899090161332389404349148549223037539091389399水牛鸡山羊绵羊牛狗三文鱼鲟鱼马猪鹿鼠火鸡440443438439439435433434450439439436441AluI 344048201200200350483472233452243464838840316335048346201Tru9 I 391387413509111412391114348466191345343273344466111834840546612063443823884252350PCR反应循环参数见表1.4 ，不同仪器可根据仪器要求将反应参数作适当调整。表1.4 PCR反应参数变性扩增条件循环次数延伸94 4 min94，45 s3572, 7 min60, 45 s72, 45 s2.5.2.1.3 扩增产物的回收：使用1.5%的琼脂糖凝胶对扩增产物进行电泳检测。用切胶回收的方式回收450bp左右的目的条带。回收试剂盒使用天根公司生产的普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒（目录号：DP209）。操作步骤见试剂盒说明书。2.5.2.1.4 回收产物的酶切：2.5.2.1.4.1 AluI（Promega公司）酶切2.5.2.1.4.1.1 酶切反应体系（10L）：10Buffer B1LBSA0.1LAlu I(10U/L)0.25LDNA2.5LH2O6.15L2.5.2.1.4.1.2 反应条件：37孵育2小时，4保存。2.5.2.1.4.2 Tru9I（Promega公司）酶切2.5.2.1.4.2.1 酶切反应体系（10L）：10Buffer F1LBSA0.1LTru 9I (10U/L)0.25LDNA2.5LH2O6.15L2.5.2.1.4.2.2 反应条件：65孵育2小时，4保存。2.5.2.1.5 酶切产物的变性：在96孔板上配制变性反应体系。变性反应体系为10L，包括酶切产物0.5L，PRISM GeneScan-500 ROX 0.3L，去离子甲酰胺 9.2L。混匀后，95加热5min后立即置于冰上。2.5.2.1.6 毛细管电泳：将装有变性产物的96孔板放入测序仪的样品板上。按照操作说明书中片段分析功能部分进行操作。测序仪参数设置为：电泳电压为15000V，加样电压2000V，加样间隔时间22秒，温度为60，毛细管电泳长度为50厘米，毛细管电泳胶为POP6的胶。电泳时间为2.5小时。2.5.2.2 13种动物T-RFLP酶切图谱及理论/实际末端酶切片段大小2.5.2.2.1 鼠（Mus musculus）样本量为5。AluI酶切：理论3末端片段大小为48bp，实际末端片段大小为46.330.09bp。Tru9I酶切：理论5末端片段大小为48bp和54bp，实际末端片段大小为42.50.04bp和49.00.04bp。2.5.2.2.2 狗（Canis familiaris）样本量为4。AluI酶切：理论3末端片段大小为48bp，实际末端片段大小为46.60.02bp。 理论5末端片段大小为88bp，实际末端片段大小为82.80.02bp。Tru9I酶切：理论5末端片段大小为90bp，实际末端片段大小为84.30.07bp。2.5.2.2.3 鸡（Gallus gallus)样本量为5。AluI酶切：理论3末端片段大小为48bp，实际末端片段大小为46.90.10bp。 理论5末端片段大小为242bp，实际末端片段大小为240.60.54bp。Tru9I酶切：理论5末端片段大小为93bp，实际末端片段大小为87.70.02bp。2.5.2.2.4 马(Equus caballus)样本量为4。AluI酶切：理论3末端片段大小为48bp，实际末端片段大小为46.80.04bp。Tru9I酶切：理论5末端片段大小为332bp，实际末端片段大小为330.50.01bp。2.5.2.2.5 猪 （Sus scrofa）样本量为3。AluI酶切：理论3末端片段大小为163bp，实际末端片段大小为163.10.01bp。Tru9I酶切：理论5末端片段大小为439bp，实际末端片段大小为435.60.06bp。2.5.2.2.6 火鸡（Meleagris gallopavo）样本量为4。AluI酶切：理论3末端片段大小为201bp，实际末端片段大小为202.00.29bp。Tru9I酶切：理论5末端片段大小为91bp，实际末端片段大小为86.20.08bp。2.5.2.2.7 山羊(Capra hircus)样本量为5。AluI酶切：理论3末端片段大小为200bp，实际末端片段大小为200.70.06bp。Tru9I酶切：理论5末端片段大小为315bp和325bp，实际末端片段大小为312.70.03bp和322.10.04bp。2.5.2.2.8 绵羊(Ovis aries)样本量为4。AluI酶切：理论3末端片段大小为200bp，实际末端片段大小为200.60.02bp。Tru9I酶切：理论5末端片段大小为325bp，实际末端片段大小为323.40.02bp。2.5.2.2.9 鲟鱼（Acipenser oxyrhynchus）样本量为3。AluI酶切：理论3末端片段大小为224bp，实际末端片段大小为225.50.08bp。Tru9I酶切：理论5末端片段大小为90bp，实际末端片段大小为83.10.09bp。 理论3末端片段大小为273bp，实际末端片段大小为273.40.09bp。2.5.2.2.10 三文鱼（Salmo salar)样本量为5。AluI酶切：理论3末端片段大小为223bp，实际末端片段大小为224.20.02bp。Tru9I酶切：理论5末端片段大小为90bp，实际末端片段大小为83.00.04bp。 理论3末端片段大小为343bp，实际末端片段大小为342.70.03bp。2.5.2.2.11 鹿(Cervus nippon)样本量为3。AluI酶切：理论3末端片段大小为350bp，实际末端片段大小为351.70.04bp。Tru9I酶切：理论5末端片段大小为34bp，实际末端片段大小为26.00.03bp。2.5.2.2.12 牛（Bos taurus）样本量为5。AluI酶切：理论3末端片段大小为350bp，实际末端片段大小为351.00.03bp。Tru9I酶切：理论5末端片段大小为91bp，实际末端片段大小为85.20.07bp。2.5.2.2.13 水牛（BubAlus bubalis)样本量为4。AluI酶切：理论3末端片段大小为440bp，实际末端片段大小为440.30.38bp。Tru9I酶切：理论5末端片段大小为53bp，实际末端片段大小为47.90.03bp。2.5.2.3 结果分析：理论分析，研究所涉及的13个物种可以用AluI和Tru9I两个酶区分。如图1.6所示，经过AluI酶切后，通过AluI 3末端片段长度可以将13个物种分成6组，鸡-狗-鼠-马组的AluI 3末端片段长度为48bp，山羊-绵羊-火鸡组的AluI 3末端片段长度为200bp，三文鱼-鲟鱼组的AluI 3末端片段长度为224bp，牛-鹿组的AluI 3末端片段长度为350bp。猪和水牛经过酶切后可以与其他11种物种分开。猪的AluI 3末端片段为163bp。水牛因为没有酶切位点，AluI 3末端片段长度为全长（440bp）。经AluI 3末端片段长度分不开的四个组（山羊-绵羊-火鸡组、鸡-狗-鼠-马组、三文鱼-鲟鱼组、牛-鹿组）各组的物种可以通过Tru9I的5末端片段长度进一步区分。如山羊-绵羊-火鸡组中，山羊的Tru9I的5末端片段长度为315bp，绵羊的Tru9I的5末端片段长度为325bp，火鸡的Tru9I的5末端片段长度为90bp。虽然山羊和绵羊的Tru9I的5末端片段长度仅相差10个碱基，但是毛细管电泳技术足以区分10个碱基的差异。鸡-狗-鼠-马组，鼠的Tru9I的5末端片段长度为48bp，马的Tru9I的5末端片段长度为332bp。鸡和狗的Tru9I的5末端片段长度同为90bp。这两个物种可以进一步通过AluI 5末端片段长度加以区分（分别为88bp和242bp）。三文鱼和鲟鱼组中，三文鱼和鲟鱼的Tru9I的5末端片段长度同为90bp，这两个物种可以进一步通过Tru9I的3末端片段长度区分（鲟鱼为273bp，三文鱼为343bp）。牛-鹿组中，鹿的Tru9I的5末端片段长度为34bp，牛的Tru9I的5末端片段长度为90bp。至此，通过AluI和Tru9I两个酶的相关末端将13种动物分开。从实验结果来看，实验得到的末端片段图谱与理论预期结果一致。按照预期的实验思路分析实验所得T-RFLP图谱，可以很容易鉴定出这13个物种。虽然理论长度和实际长度存在差异（根据现有的文献资料分析，荧光标记可能是造成这种片段长度差异的原因之一），但是只要实验条件一定，同一物种的不同个体间酶切片段长度的差值很小，都在1bp以内，而且T-RFLP图谱具有很好的重复性。因此，与单末端荧光标记得到的结论相同，只要建立了标准图谱，理论长度和实际长度的差异并不会影响对实验结果的判断。另外，当酶切位点非常接近时，通常不能只得到最末端的片段（如鼠和山羊的Tru9I酶切结果）。但是相比PCR-RFLP，其结果分析还是相对简单。3. 实际样品检测在项目完成过程中，项目组用选定的DNA提取方法提取了64个样品的DNA。样品种类主要为奶制品（包括奶酪、鲜奶、奶粉等）、肉制品（香肠、熟肉制品）和罐头制品（各种鱼罐头）。样品DNA提取后进行PCR扩增，对扩增产物的电泳检测显示奶制品和肉制品中提取的DNA绝大部分都能扩增出450bp的目的条带，但是罐头制品中提取出的DNA只有个别能扩增出目的条带。这与已有文献的报导一致。因为罐头制品经过处理后，DNA降解非常严重，所提取出的DNA的长度基本都在200bp以下。由此得出项目组目前建立的方法（主要是靶基因的扩增产物太长）不适用于罐头制品的种类鉴定，但是适用于大部分奶制品和肉制品的种类鉴定。对能够扩增出目的条带的48个样品用T-RFLP方法进行了种类鉴定。鉴定结果如下表所示：检测样品数动物种类水牛奶酪65为水牛，1为奶牛山羊奶酪4山羊山羊奶粉2山羊马苏里拉奶酪4奶牛鸡肉制品10鸡羊肉制品10绵羊猪肉制品12猪共计48鉴定结果显示，48个样品中有一个样品存在标签与实际成分不同的现象（标签为格尔巴尼马苏里拉水牛奶酪，实际奶源并不是水牛奶而是奶牛奶）。将此样品扩增产物测序，序列比对结果表明确实是奶牛成分（结果未显示）。另外，项目组检测的结果还显示目前市场上销售的羊肉制品基本上都是绵羊肉制品。应该由水牛奶制成的马苏里拉奶酪如果没有特殊说明，多数是由奶牛奶制成。4. 混合样品的检测T-RFLP方法与普通PCR-RFLP方法相比，其优势在于该方法结果判断简单准确，这应该是攻克混合样品检测的一个很好的前提。因此，项目组对T-RFLP方法分析肉类混合物进行了简单地尝试。4.1 实验设计将猪和牛的DNA的浓度都调整到20g/mL。按照不同比例混合制成11个样品作为PCR的模板。按照已经建立好的实验方法进行检测。猪和牛的DNA的混合比例如下表。样品1猪:牛=15:1样品7猪:牛=1:3样品2猪:牛=9:1样品8猪:牛=1:5样品3猪:牛=7:1样品9猪:牛=1:7样品4猪:牛=5:1样品10猪:牛=1:9样品5猪:牛=3:1样品11猪:牛=1:15样品6猪:牛=1:14.2 实验结果理论上样品中如果含有猪肉和牛肉成分，经过AluI酶切应在3末端片段（HEX标记）分别检测到长度为163bp和350bp的峰。经过Tru9I酶切应在5末端片段（FAM标记）分别检测到长度为439bp和91bp的峰。从实验结果来看，经过AluI酶切，当猪肉和牛肉的DNA含量比为15:1、9:1、7:1、5:1、3:1、1:1和1:3时，可以检测到两个特征峰，而且随着DNA含量比的变化，两个峰的峰高也呈现有规律的变化。如当猪肉和牛肉的含量比为15:1时，猪的163bp的特征峰很强，牛的350bp的特征峰很弱。随着牛肉含量的增加，牛的350bp的特征峰逐渐增强。当猪肉和牛肉的含量比为1:3时，猪肉的163bp的特征峰很弱，基本上都是牛的350bp的特征峰了。当猪肉和牛肉的DNA含量比为1:5、1:7、1:9、1:15时，已检测不到猪肉的特征峰。经过Tru9I酶切，所有酶切结果中均显示439bp和91bp的两个特征峰。同样，两个峰的峰高随着DNA含量比的变化呈现有规律的变化。综合上述结果，不考虑DNA定量的误差，当猪牛肉混合物中猪肉的比例低至25%或牛肉比例低至5%时，T-RFLP方法能够鉴定出两个物种。不考虑DNA定量的误差，此次实验结果也清晰显示了通用引物扩增混合模板时PCR扩增效率不一致的现象，这种情况在先前的文献资料中也有报导。这一现象可能也是PCR-RFLP方法不适用于分析混合样品的重要原因之一。从项目组的实验结果看，现有引物对牛肉模板的扩增效果明显好于对猪肉模板的扩增效果。如何调整PCR扩增条件，使得反应过程中通用引物对不同模板的扩增效率相当，将是解决用T-RFLP方法或PCR-RFLP方法鉴定肉类混合物的根本。由于当前实验条件下还没有解决引物对不同模板扩增效率不一致的情况，因此，目前建立的实验方法还不适用于分析肉类混合物。四、验证实验情况本检测方法经珠海出入境检验检疫局、华东师范大学、北京师范大学、中国科学院、浙江出入境检验检疫局五家单位进行验证，结果均表明：本标准建立的方法技术路线清晰、简单、可靠。重复性和稳定性高、结果准确客观，易于判断。五、参考文献Chikuni, K., Tabata, T., Kosugiyama, M., & Monma, M. (1994). Polymerase chain reaction assay for detection of sheep and goat meats. Meat Science, 37, 337-345.Fajardo, V., Gonzalez, I., Lopez-Calleja, I., Martin, I., Hernandez, P. E., Garcia, T., & Martin, R. (2006). PCR-RFLP authentication of meats from red deer (Cervus elaphus), fallow deer (Dama dama), roe deer (Capreolus capreolus), cattle (Bos taurus), sheep (Ovis aries), and goat (Capra hircus). Journal of Agricultural and Food Chemistry, 54, 1144-1150.Fajardo, V., Gonzalez, I., Lopez-Calleja, I., Martin, I., Rojas, M., Hernandez, P. E., Garcia, T., & Martin, R. (2007). Identification of meats from red deer (Cervus elaphus), fallow deer (Dama dama), and roe deer (Capreolus capreolus) using polymerase chain reaction targeting specific sequences from the mitochondrial 12S rRNA gene. Meat Science, 76, 234-240.Girish, P. S., Anjaneyulu, A. S. R., Viswas, K. N., Shivakumar, B. M., Anand, M., Patel, M., & Sharma, B. (2005). 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