散装即食食品中3种食源性致...光定量PCR检测方法的建立_崔洁.pdf

312 食 品 科 技FOOD SCIENCE AND TECHNOLOGY食品安全与检测2023年 第48卷 第04期收稿日期：2022-11-17 *通信作者 基金项目：浙江省药品监管科技计划项目(2023010)；2021年度舟山市科技计划项目(2021C31003)；浙江省市场监督管理局青年科技项目(QN2023455)。作者简介：崔洁(1989)，女，浙江嘉兴人，硕士研究生，研究方向为食品微生物检测。崔 洁1,2，黄朱梁2，严卓彦2，孙 瑛2，林吉恒2，夏瑛瑛2，王萍亚2*，邓尚贵1(1.浙江海洋大学食品与药学学院，浙江 舟山 316000；2.舟山市食品药品检验检测研究院，浙江 舟山 316000)摘要：该研究旨在建立散装即食食品中沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和蜡样芽孢杆菌3种食源性致病菌的多重荧光定量PCR检测方法，根据沙门氏菌侵染上皮细胞表面蛋白的invA基因、金黄色葡萄球菌的耐热核酸酶(nuc)基因、蜡样芽孢杆菌的cerA基因分别设计3对特异性引物与探针，并对体系中引物探针的浓度以及退火温度等反应条件进行优化筛选，建立多重荧光定量PCR检测方法，同时评估其特异性、灵敏性及重复性，并应用该方法检测散装即食食品样本中致病菌，同时与国标法比对。结果表明，建立的多重荧光定量PCR检测方法能特异性地扩增沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和蜡样芽孢杆菌3种目标菌，其他菌株均不扩增，灵敏度分别为4102、3102、2102 cfu/mL，且批内和批间变异系数均小于2%，重复性和稳定性良好。同时用国标法和多重荧光定量PCR法对100份散装即食食品样本进行检测比对，多重荧光定量PCR法的阳性检出率略高于传统国标法，且检测时间大幅缩短。综上所述，建立的多重荧光定量PCR检测方法特异性强、灵敏度高、快速准确，在食源性致病菌快速筛查方面具有良好的应用前景。关键词：散装即食食品；多重荧光定量PCR；沙门氏菌；金黄色葡萄球菌；蜡样芽孢杆菌中图分类号：TS 207.4 文献标志码：A 文章编号：1005-9989(2023)04-0312-08Establishment of A Multiplex Fluorescence Quantitative PCRAssay for the Detection of Three Foodborne Pathogens in BulkReady-To-Eat FoodCUI Jie1,2,HUANG Zhuliang2,YAN Zhuoyan2,SUN Ying2,LIN Jiheng2,XIA Yingying2,WANG Pingya2*,DENG Shanggui1(1.College of Food and Pharmacy,Zhejiang Ocean University,Zhoushan 316000,China;2.Zhoushan Institute of Food&Drug Control,Zhoushan 316000,China)Abstract:The aim of this study was to establish a multiplex fluorescence quantitative PCR method for the detection of three food-borne pathogens,Salmonella,Staphylococcus aureus and Bacillus cereus,in bulk 散装即食食品中3种食源性致病菌多重荧光定量PCR检测方法的建立DOI:10.13684/ki.spkj.2023.04.038 313 食 品 科 技FOOD SCIENCE AND TECHNOLOGY食品安全与检测2023年 第48卷 第04期0 引言食源性疾病不仅是当今世界引起广泛关注的公共卫生问题之一，也是食品安全的首要重点。全世界每年因食用各种病原菌污染的食品和饮用水导致的食源性疾病的案例多不胜数。有数据显示1，我国平均每年发生的一万多例食物中毒事件中，由各种病原菌引起的食物中毒比例占三成以上。20032015年全国共报告1050起学校食源性疾病暴发事件2-4，累计发病37281人次，由沙门氏菌(16.01%)、金黄色葡萄球菌(20.93%)、蜡样芽孢杆菌(29.24%)所致的发病人数占比最大。沙门氏菌感染后轻则呕吐腹泻，重则引起急性肠胃炎、败血症等疾病，严重危害人体健康，在禽畜肉中较易检出5-6。极易污染肉、蛋、乳制品的金黄色葡萄球菌也是引发食源性疾病的罪魁祸首之一，其产生的肠毒素不易被高温破坏，通过食物入侵人体后易引起急性胃肠炎7-8。米饭及其制品中最易出现的蜡样芽孢杆菌也不可小觑，一般在夏秋季高发，其所分泌的毒素污染食物被人误食后，轻则呕吐腹泻，重则可导致死亡，例如寿司、饭团、炒饭等米饭制品为此类感染重灾区9-11。随着外卖、社区团购的兴起，人们的膳食习惯也在悄然改变。超市、菜场里随处可见的盒装预制菜、酱卤肉制品等散装即食食品都已经过烹煮、烫热，无需再对其进行额外加工处理即可食用，既省去了繁琐的包装，售卖随意，食用也更加便捷，备受生产者与消费者的推崇12。但是与预包装食品不同的是，这类散装即食食品并没有经过严格的出厂检验，卫生安全条件难以保证，在制作和销售过程中，加工人员与食品的接触、器具的混用等因素很容易导致微生物的二次污染，增加了食源性疾病的潜在风险13。为了强化生产经营全过程规范管理、加强对散装即食食品的市场监管，由国家卫健委和市场监管总局联合发布的GB 316072021食品安全国家标准 散装即食食品中致病菌限量于2022年3月7日正式实施14。该标准作为我国首部针对散装即食食品设置致病菌限量的食品安全国家标准，意义非凡。标准中对散装即食食品的3个大类分别需要检测的致病菌以及各致病菌的限量都提出了明确要求，比如热处理散装即食食品和部分或未经热处理散装即食食品都要求检测沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和蜡样芽孢杆菌这3种主要致病菌。但是传统的细菌分离鉴定需要前增菌、选择性培养和生化实验3个步骤，通常需要46 d，不仅操作繁琐、费时费力，对食物中毒的信息诊断滞后，而且在平板菌落的挑取过程中，容易出现肉眼判断误差，造成错判漏检，难以满足食源性疾病时效性与准确性的要求，特别是在大批量的食品样本的检测过程中，这种缺点体现ready-to-eat food.Three pairs of specific primers and probes were designed according to the invA gene of the infected epithelial cell surface protein of Salmonella,the nuc gene of Staphylococcus aureus,and the cerA gene of Bacillus cereus.The addition amount of primers and probes in the system and the annealing temperature were optimized and screened.To establish a multiplex fluorescence quantitative PCR assay,and evaluate its specificity,sensitivity and repeatability,and apply this assay to detect pathogenic bacteria in bulk ready-to-eat food samples and compare it with the national standard method.The results showed that the established multiplex fluorescence quantitative PCR assay could specifically amplify only Salmonella,Staphylococcus aureus and Bacillus cereus,with the sensitivity of 4102 cfu/mL,3102 cfu/mL and 2102 cfu/mL respectively.The intra-run and inter-run coefficients of variation were less than 2%,and the repeatability and stability were good.At the same time,100 bulk ready-to-eat food samples were detected and compared by national standard method and multiple fluorescence quantitative PCR method.The positive detection rate of multiple fluorescence quantitative PCR method was slightly higher than that of traditional national standard method,and the detection time was greatly shortened.In conclusion,the established multiplex fluorescence quantitative PCR method has strong specificity,high sensitivity,rapid and accurate,and has a good application prospect in the rapid screening of foodborne pathogens.Key words:bulk ready-to-eat food;multiple real-time PCR;Salmonella;Staphylococcus aureus;Bacillus cereus 314 食 品 科 技FOOD SCIENCE AND TECHNOLOGY食品安全与检测2023年 第48卷 第04期地更加明显15-16。近年来，以常规PCR为基础的各种新型PCR技术不断出现，及时弥补了这一缺陷。特别是实时荧光定量PCR(Quantitative Real-time，PCR)技术，为食品中致病菌的高通量快速检测开辟了新路径。其代表方法TaqMan探针法，只需在体系中添加合成好的引物与探针，当聚合酶延伸将前方探针水解，5端的发光基团与3端的猝灭基团分开而产生荧光信号，借助荧光信号的不断累积可对整个PCR反应进行实时监测，最终可根据Ct值和标准曲线对未知模板浓度进行定量分析17。引物与探针的双重保证不仅特异性更强，而且在对批量样本进行检测时，只需前增菌并提取核酸，便可在2 h内得知实验结果，因其灵敏、快速、特异、高通量等优势，使之成为食源性致病菌快速检测技术的重要研究方向18。因此，本研究拟通过TaqMan探针法，建立散装即食食品中沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和蜡样芽孢杆菌的多重实时荧光定量PCR方法，为散装即食食品中病原微生物的食品安全风险监测工作提供技术支持。1 材料与方法1.1 材料1.1.1 实验菌株 实验所用标准菌株：目标菌株3株，为沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、蜡样芽孢杆菌；非目标菌株7株。均购自标准菌株保藏中心，保藏于舟山市食品药品检验检测研究院内，详见表1。表1 实验菌株信息编号名称来源CMCC50041肠炎沙门氏菌中国药品生物制品检定所ATCC26112金黄色葡萄球菌中国药品生物制品检定所ATCC11778蜡样芽孢杆菌美国菌种保藏中心ATCC17802副溶血性弧菌中国药品生物制品检定所ATCC25922大肠埃希氏菌中国药品生物制品检定所ATCC9027铜绿假单胞菌中国药品生物制品检定所CMCC51592宋内氏志贺氏菌中国药品生物制品检定所ATCC51329阪崎肠杆菌中国药品生物制品检定所CMCC54002单核细胞增生李斯特氏菌中国药品生物制品检定所ATCC21059 乙型溶血性链球菌美国菌种保藏中心1.1.2 材料与试剂 缓冲蛋白胨水(BPW)、亚希酸盐胱氨酸增菌液(SC)、四硫磺酸钠煌绿增菌液(TTB)基础、亚硫酸铋琼脂(BS)、木糖赖氨酸脱氧胆盐(XLD)琼脂、Baird-Parker培养基基础、BHI肉汤、营养琼脂(NA)、胰蛋白胨大豆琼脂(TSA)、胰酪胨大豆多黏菌素肉汤基础、甘露醇卵黄多黏菌素琼脂基础等培养基：北京陆桥技术股份有限公司；细菌基因组DNA抽提试剂盒：生工生物工程(上海)股份有限公司；引物探针：宝生物工程(大连)有限公司合成。1.1.3 主要仪器 ABI7500实时荧光定量PCR仪：美国AB公司；NanoDrop one核酸蛋白分析仪和高速台式离心机：美国Thermo Fisher Scientific公司。1.2 方法1.2.1 设计引物与探针 本实验以沙门氏菌的侵染上皮细胞表面蛋白的invA基因、金黄色葡萄球菌的耐热核酸酶(nuc)基因、蜡样芽孢杆菌的cerA基因为特异基因设计3对引物与探针，均委托宝生物工程(大连)有限公司合成，引物与探针信息详见表2。表2 引物与探针菌株靶基因序列(5-3)沙门氏菌invAF：5-AACGTGTTTCCGTGCGTAAT-3R：5-TCCATCAAATTAGCGGAGGC-3P：VIC-5-TGGAAGCGCTCGCATTGTGG-3-TAMRA金黄色葡萄球菌nucF：5-AGTATATAGTGCAACTTCAACTAAA-3R：5-ATCAGCGTTGTCTTCGCTCCAAATA-3P：FAM-5-AGTTGACAAAGCTCAAAGAACTGATAAAT-3-BHQ1蜡样芽孢杆菌cerAF：5-GCTAAAAGGTGTACTTAGCTTAGG-3R：5-ATCAGCGTTGTCTTCGCTCCAAATA-3P：CY5-5-AGTTCCGCTATATAAAGCTCCTAAACCAA-3-BHQ21.2.2 标准菌株鉴定 按照GB 4789食品安全国家标准 食品微生物检验方法对沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和蜡样芽孢杆菌标准菌株进行分离鉴定。1.2.3 模板DNA的提取 分别将沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和蜡样芽孢杆菌接种于营养肉汤、BHI肉汤和胰酪胨大豆多黏菌素肉汤中复苏，36 315 食 品 科 技FOOD SCIENCE AND TECHNOLOGY食品安全与检测2023年 第48卷 第04期培养过夜后，分别取原液1 mL进行10倍递增稀释至108浓度，并倾注营养琼脂进行平板计数，同时每个稀释度各吸取1 mL至离心管进行模板DNA的提取。分别采用热煮沸法和细菌基因组DNA提取试剂盒法提取DNA，并对提取结果进行比较，最终选用提取效果更好的细菌基因组DNA提取试剂盒法，并将DNA模板冻存于20 冰箱备用。1.2.4 单重实时荧光PCR的扩增 分别以沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和蜡样芽孢杆菌梯度稀释的核酸为模板进行单重荧光PCR扩增，其中大肠埃希氏菌为阴性对照，无菌超纯水为空白对照。反应体系为25 L：2Probe qPCR Mix 12.5 L，上下游引物与探针(10 mol/L)各1 L，Rox reference Dye 0.25 L，DNA模板5 L，dH2O补足至25 L。反应条件为：95 预变性3 min；94 变性5 s，60 退火延伸30 s，40个循环。1.2.5 单重实时荧光PCR标准曲线的建立及灵敏度实验 将过夜培养好的沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、蜡样芽孢杆菌的纯菌液分别10倍梯度稀释至108浓度，取104、105、106、107、1085个浓度的菌液1 mL，分别倾注胰蛋白胨大豆琼脂(TSA)和营养琼脂(NA)平板，每组各2个平行，比较TSA与NA上的菌落生长状况，并选取平行较好的平板进行计数。同时各取1 mL稀释液按1.2.3中方法提取核酸后进行单重实时荧光PCR扩增，以菌液浓度为横坐标，Ct值为纵坐标绘制标准曲线，观察其检出限，以测试其灵敏度。1.2.6 多重实时荧光PCR体系的优化和建立 基于单重实时荧光PCR反应体系，先将3组目标菌株的引物与探针两两结合进行扩增，确定彼此之间不会互相干扰，再对3组多重体系中的引物探针的添加量以及退火温度等进行筛选和优化，确认最优反应条件。在确保方法特异和稳定的基础上，以期获得较低Ct值和较高的荧光增量Rn为目标，对各参数进行最佳配比，建立多重实时荧光PCR检测方法。1.2.7 多重实时荧光PCR的特异性实验 提取3株目标菌株和7株非目标菌株的DNA，并以此为模板，利用建立的多重荧光定量PCR反应体系，以沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和蜡样芽孢杆菌3株菌株为阳性对照，其他7株非目标菌株为阴性对照，dH2O为空白对照进行三重实时荧光PCR扩增实验，观察目标菌的特异性扩增以检测本方法的特异性，Ct值显示“Undet”或无明显S型扩增曲线均为阴性。1.2.8 多重实时荧光PCR的重复性实验 分别选取101103 3个稀释度的沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和蜡样芽孢杆菌的菌悬液提取核酸后进行实时荧光PCR扩增，每个稀释度平行重复3次以评估该方法的批内重复性，并分别在第1天、第7天和第14天对同一稀释度的DNA模板进行重复检测，来验证该方法的稳定性及批间重复性。1.2.9 食品样品的检测 在本地不同超市、门市店和农贸市场随机购买散装即食食品样本100份，每份样品均无菌采样500 g，2 h内带回实验室检测，其中酱卤肉30份、豆制品15份、米饭制品20份、凉拌菜20份、生鲜沙拉15份。分别无菌取样25 g并添加225 mL增菌液，充分均质混匀后，沙门氏菌和金黄色葡萄球菌放入36 培养箱增菌18 h，蜡样芽孢杆菌则于30 培养48 h。之后各取增菌液1 mL提取DNA并进行多重实时荧光PCR扩增。同时，分别按照GB 4789.42016食品微生物学检验 沙门氏菌检验、GB 4789.102016食品微生物学检验 金黄色葡萄球菌检验、GB 4789.142014食品微生物学检验 蜡样芽孢杆菌检验的方法对样品中沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、蜡样芽孢杆菌进行比对实验，以验证多重实时荧光PCR方法的可靠性。2 结果与分析2.1 单重实时荧光PCR标准曲线的建立及灵敏度实验分别对3组目标菌进行菌落计数并观察菌落生长情况，其中沙门氏菌与金黄色葡萄球菌在TSA和NA平板上长势接近，而蜡样芽孢杆菌则在NA平板上菌落更多。根据平板计数的结果，再乘以稀释倍数就可以算出沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和蜡样芽孢杆菌初始菌液浓度分别为4108、3108、2107 cfu/mL，分别选取5个稀释度进行实时荧光PCR扩增，以Ct值为纵坐标，菌液浓度为横坐标绘制标准曲线，结果如图1图3所示。当沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和蜡样芽孢杆菌菌液浓度分别处于41064102、31063102、21062102 cfu/mL时，菌液浓度与Ct值呈良好的线性关系，其中沙门氏菌标准曲线为y=3.476x+47.655，R2=0.997，Eff%=93.96；金黄色葡萄球菌标准曲线为 316 食 品 科 技FOOD SCIENCE AND TECHNOLOGY食品安全与检测2023年 第48卷 第04期图1 沙门氏菌灵敏度扩增曲线和标准曲线图2 金黄色葡萄球菌灵敏度扩增曲线和标准曲线图3 蜡样芽孢杆菌灵敏度扩增曲线和标准曲线图4 多重荧光定量PCR扩增曲线周期2610141822263034382.503.003.504.004.502.001.501.000.500.00Rn数量1000100001000001000000100000001000000Ct353433323130292827262524232221ABCDEFGH周期2 4 6 8 101214161820222426283032343638406.56.05.55.04.54.03.53.02.52.01.51.00.50.0Rn数量Ct103736353433323130292827262524231001000100001000001000000100000ABCDEFGH周期2 4 6 8 101214161820222426283032343638402.252.502.753.003.252.001.751.501.251.000.750.500.250.00RnCt35343332313029282726252423222120数量101001000100001000001000000100000金黄色葡萄球菌沙门氏菌蜡样芽孢杆菌周期2.252.001.751.501.251.000.750.500.250.002 4 6 8 10121416182022242628303234363840Rn孢杆菌标准曲线为y=3.38x+44.201，R2=0.999，Eff%=97.632。当Ct值35时可判定为阳性19，因此由图可知，沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、蜡样芽孢高杆菌3种目标菌的灵敏度分别为4102、3102、2102 cfu/mL，而当浓度低于该检出限时，仍有扩增，但重复性和准确性较差。2.2 多重实时荧光PCR体系的优化和建立反复优化各引物、探针的浓度及退火温度等反应条件和参数，确定最优反应体系为：总体积50 L，2Probe qPCR Mix 25 L，3种菌混合上下游引物(10 mol/L)各1 L，混合探针(10 mol/L)各1 L，Rox reference Dye 0.25 L，混合DNAy=3.37x+43.1，R2=0.998，Eff%=98.028；蜡样芽 317 食 品 科 技FOOD SCIENCE AND TECHNOLOGY食品安全与检测2023年 第48卷 第04期图5 多重实时荧光PCR的特异性实验周期金黄色葡萄球菌沙门氏菌蜡样芽孢杆菌其他7种非目标菌株Rn2.252.002.501.501.251.000.751.750.500.2504812 16 20 24 28 32 36 400.00表3 多重实时荧光PCR重复性实验稀释度目标菌3次重复Ct值批内CV/%不同实验时间批间CV/%Ct1Ct2Ct3第1天第7天第14天101沙门氏菌18.202 18.21018.2710.218.20218.51018.7821.6金黄色葡萄球菌 19.315 19.56219.5990.819.31519.53519.8041.3蜡样芽孢杆菌20.726 20.56920.5550.520.72621.05821.2701.3102沙门氏菌21.263 21.42921.5050.621.26321.68122.0341.8金黄色葡萄球菌 22.908 22.98922.7600.522.90823.31023.6911.7蜡样芽孢杆菌23.856 23.96223.9420.223.85624.18924.5461.4103沙门氏菌25.351 25.51125.6300.525.35125.64925.9611.2金黄色葡萄球菌 26.264 26.34426.2060.326.26426.59927.0061.4蜡样芽孢杆菌27.221 27.17727.1970.127.22127.53327.8311.1表4 多重实时荧光PCR法与国标法比对样品名称 数量沙门氏菌金黄色葡萄球菌蜡样芽孢杆菌GB法检出率/%qPCR法检出率/%GB法检出率/%qPCR法检出率/%GB法检出率/%qPCR法检出率/%酱卤肉301/30(3.33%)1/30(3.33%)3/30(10.00%)3/30(10.00%)0/30(0.00%)0/30(0.00%)豆制品150/15(0.00%)0/15(0.00%)1/15(6.67%)1/15(6.67%)0/15(0.00%)0/15(0.00%)寿司200/20(0.00%)0/20(0.00%)5/20(25.00%)5/20(25.00%)6/20(10.00%)6/20(10.00%)生鲜沙拉150/15(0.00%)1/15(6.67%)2/15(13.33%)2/15(13.33%)0/15(0.00%)0/15(0.00%)凉拌菜202/20(10.00%)2/20(10.00%)3/20(15.00%)3/20(15.00%)0/20(0.00%)0/20(0.00%)总计1003/100(3.00%)4/100(4.00%)14/100(14.00%)14/100(14.00%)6/100(6.00%)6/100(6.00%)模板3 L，dH2O补足至50 L。扩增条件为：95 预变性3 min；94 变性5 s，60 退火延伸30 s，40个循环。在每个循环退火延伸阶段收集荧光信号，有明显S型扩增曲线且Ct值35判定为阳性，扩增结果见图4。2.3 多重实时荧光PCR的特异性将3株目标菌株和7株非目标菌株的DNA作为混合模板，并利用建立的多重荧光定量PCR检测方法进行特异性扩增，结果如图5所示，3株目标菌均呈良好S型扩增曲线且Ct值35，而其他7株非目标菌及空白对照均无明显特异性扩增，表明本实验所采用的3组引物与探针对沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和蜡样芽孢杆菌都具有良好的特异性，且不会产生交叉反应。2.4 多重实时荧光PCR的重复性实验当批内变异系数小于5%10%、批间变异系数小于15%20%时，表明实验结果可重复性高，建立的方法重复性好。由实验结果(表3)可知，沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、蜡样芽孢杆菌的批内和批间变异系数CV均小于2%，表明本研究所建立的多重实时荧光PCR检测方法具有良好的重复性和稳定性。2.5 食品样本检测应用已建立的多重实时荧光PCR法对100份散装即食食品样本中沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和蜡样芽孢杆菌进行检测，同时采用GB 4789国标法进行传统的分离培养鉴定，结果比对见表4。五大类散装即食食品中均有致病菌不同程度地检出，其中在金黄色葡萄球菌和蜡样芽孢杆菌的检测中，不论是国标法还是多重实时荧光PCR法，阳性检出率均为14%和6%，然而对于沙门氏菌的检测，多重实时荧光PCR法的阳性检出率略高于传 318 食 品 科 技FOOD SCIENCE AND TECHNOLOGY食品安全与检测2023年 第48卷 第04期统国标法，并且检测时间大幅缩短。结果表明所建立的多重实时荧光PCR法可靠，可更加快速、特异地实现对散装即食食品中沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和蜡样芽孢杆菌的检测。3 讨论超市、菜场等随处可见的酱腌菜、酱卤肉等散装即食食品虽食用便捷，但是从生产到餐桌中间涉及多个环节，极易受到病原微生物的二次污染而引发食源性疾病，轻则呕吐腹泻，重则引起急性肠胃炎、败血症等疾病，严重危害人体健康。传统的国标法需要前增菌培养、选择性培养和生化实验3个步骤，是食源性致病菌检测的金标准，但是通常需要46 d，不仅操作繁琐、耗时耗力，且灵敏度低，易造成错判漏检20。有研究表明21，当微生物在自然环境中处于活的非可培养状态(Viable but non-culturable，VBNC)时不能在异养平板上生长，但仍具有新陈代谢、致病性和毒性，从而使国标法检测出现假阴性，成为影响食品安全的隐性污染源，而多重实时荧光定量PCR技术不区分死菌和活菌，只根据致病菌的特异性靶基因进行检测，阳性检出率较国标法更高，特别是TaqMan探针法，由于采用引物与探针的“双保险”，较SYBR-Green染料法具有更好的特异性，无需再借助熔解曲线分析鉴定PCR的单峰，且较少存在假阳性问题22。随着分子生物学的发展和应用，多重实时荧光定量PCR技术已然成为高通量筛查诊断食源性疾病的有力工具，特别是对批量食品样本进行检测时，只需前增菌并提取核酸，仅1 h便可得知结果，更加便捷、灵敏、快速、特异。本研究尝试建立同时检测散装即食食品中沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和蜡样芽孢杆菌的多重实时荧光PCR方法。不仅要避免多对引物探针之间的相互干扰和各目的片段之间的非特异性扩增，还要保证多对引物探针有相近的退火温度，保持相近的增效率23。笔者选取发射波长相差较大的FAM、CY5荧光基团，且非荧光物质的BHQ系列作为猝灭基团来建立多重荧光定量PCR方法，结果可使3株目标菌均呈良好S型扩增曲线，且7株非目标菌均无特异性扩增。此外，该方法还具有较高的灵敏度和重复性。为验证所建立的多重实时荧光PCR法在实际样品检测中的可行性，本研究应用已建立的方法对100份散装即食食品样本进行3种致病菌的检测，同时采用国标法进行对比验证。结果表明，多重荧光定量PCR法的阳性检出率略高于传统培养法，且检测时间大幅缩短，可更加快速、特异地实现对散装即食食品中沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和蜡样芽孢杆菌的检测。本研究通过TaqMan探针法建立的散装即食食品中沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和蜡样芽孢杆菌的多重实时荧光定量PCR方法，将进一步完善优化，具有较广阔的应用前景，为食品检验检测工作的高效有序展开奠定良好基础，也可极大地确保食品质量，为食品安全做好预警工作。参考文献：1付萍,王连森,陈江,等.2015年中国大陆食源性疾病暴发事件监测资料分析J.中国食品卫生志,2019,31(1):64-70.2柯振华.餐饮及相关食品中病原菌活菌多重实时荧光PCR检测方法的研究与开发J.生物技术进展,2020,10(6):717-727.3韩进兰.食源性疾病监测中病原微生物检验结果分析J.临床检验杂志(电子版),2020,9(1):122.4张晶,李薇薇,杨淑香,等.中国2010-2016年家庭食源性疾病暴发事件流行特征分析J.中国公共卫生,2019,35(10):1379-1382.5LIU J K,BAI L,LI W W,et al.Trends of foodborne diseases in China:lessons from laboratory-based surveillance since 2011J.Frontiers of Medicine,2018,12(1):48-57.6赵建梅,李月华,张青青,等.2008-2017年我国部分地区禽源沙门氏菌流行状况及耐药分析J.中国动物检疫,2019,36(8):27-35.7李兵兵,刘靓,李双殊,等.淮安市畜禽肉中金黄色葡萄球菌污染及其病原学特征分析J.中国食品卫生杂志,2019,31(3):217-221.8PROUDY I,BOUGL D,COTON E.Genotypic charac-terization of Enterobacter sakazakii isolates by PFGE,BOX-PCR and sequencing of the fliC geneJ.Journal of Applied Microbiology,2008,104(1):26-34.9MARTLBAUER E,GRANUM P E.Bacillus cereus ToxinsJ.Toxins,2021,13(5):295.10REN B B,LASAM G.A rare case of native mitral valve Bacillus cereus endocarditis culminating into a cerebrovascular infarctionJ.Cardiology Research,2018,9(3):173-175.11MAKINDE O M,ADETUNJI M C,EZEOKOLI O T,et al.Bacterial contaminants and their antibiotic susceptibility patterns in ready-to-eat foods vended in Ogun state,NigeriaJ.Letters in Applied Microbiology,2020,72(2):187-195.12阮雁春.散装食品中致病菌与卫生细菌指标检测技术研究J.现代食品,2018,19(32):103-107.319 食 品 科 技FOOD SCIENCE AND TECHNOLOGY食品安全与检测2023年 第48卷 第04期13郝鹏飞,任静朝,张光辉,等.新乡市2017-2018年即食食品微生物污染状况调查分析J.中国初级卫生保健,2020,34(10):99-102.14中华人民共和国国家卫生健康委员会,国家市场监督管理总局.食品安全国家标准 散装即食食品中致病菌限量:GB 316072021S.北京:中国标准出版社,2021.15陈秀琴,林甦,郑敏,等.生鲜肉中3种食源性致病菌Taqman多重荧光定量PCR检测方法的建立J.福建畜牧兽医,2021,43(3):22-27.16姚帮本,闫超,姚丽,等.食源性致病菌快速检测方法研究进展J.分析测试学报,2021,40(5):617-627.17CARLONI E,ROTUNDO L,BRANDI G,et al.Rapid and simultaneous detection of Salmonella spp,Escherichia coli O157,and Listeria monocytogenes by magnetic capture hybridization and multiplex real-time PCRJ.Folia Micro-biologica,2018,63(6):735-742.18ESPY M J,UHL J R,SLOAN L M,et al.Real-time PCR in clinical microbiology:Applications for routine laboratory testingJ.Clinical Microbiology Reviews,2006,19(1):165-256.19国家质量监督检验检疫总局.食品中致病菌检测方法实时PCR法:SN/T 18702007S.北京:中国标准出版社,2007.20赵冉,陈琼,孔繁德,等.四种肠道致病菌的多重荧光定量PCR快速检测方法的建立J.畜牧与兽医,2014,46(8):67-71.21张晓华,钟浩辉,陈吉祥.细菌活的非可培养状态研究进展J.中国海洋大学学报,2020,50(9):153-160.22范维,高晓月,李贺楠,等.3种致病菌多重real-time PCR检测方法的建立及其在散装即食肉制品中的应用J.食品科学,2022,43(2):332-338.23林碧莲,柯振华,陈筱婷,等.多重实时荧光定量PCR快速检测婴幼儿乳粉中沙门氏菌、克罗诺杆菌和金黄色葡萄球菌J.食品安全质量检测学报,2017,8(11):4375-4381.