蛋白提取实验步骤备课讲稿.doc

蛋白提取实验步骤精品资料蛋白提取实验步骤：1、细胞总蛋白提取A、对于悬浮细胞: 离心收集细胞，每106细胞加250 ul RIPA（在使用前数分钟内加入蛋白酶抑制剂），振荡。如果需要提高蛋白浓度，可以适当减少细胞总蛋白提取试剂体积。B、对于贴壁细胞:a、用TBS冲洗细胞2-3次。最后一次彻底吸干残留液。b、加入适当体积的 RIPA（使用前数分内加入蛋白酶抑制剂）于培养板、瓶内3-5分钟。期间反复晃动培养板、瓶，使试剂与细胞充分接触。c、用细胞刮刀将细胞及试剂刮下，收集到1.5ml离心管中。C、冰浴30min，期间用移液器反复吹打，确保细胞完全裂解。D、12000g离心5min，收集上清，即为总蛋白溶液。2、组织蛋白提取：A、组织块用冷TBS洗涤2-3次，去除血污，剪成小块置于匀浆器。加入10倍组织体积本试剂（使用前数分钟内加入蛋白酶抑制剂）冰上彻底匀浆。如果需要提高蛋白浓度，可以适量减少该试剂体积。B、将匀浆液转移至1.5ml离心管中，振荡。冰浴30min，期间用移液器反复吹打，确保细胞完全裂解。C、12000g离心5min，收集上清，即为总蛋白溶液。1、组织尽可能新鲜，若不能及时提蛋白，组织标本应保存在-80冰箱，并避免反复冻融。2、全程必须在冰上进行，避免蛋白降解。3、蛋白酶抑制剂在水溶液中不稳定，需在RIPA使用前数分钟加入蛋白酶抑制剂。4、裂解过程中如有溶液粘稠现象可用移液器（200l）反复吹打，或再加入适量裂解液以保证充分裂解。5、总蛋白溶液不稳定（蛋白酶依旧有活性）可在-80短时间保存，建议立即加入蛋白上样缓冲液变性后与-20保存，避免反复精品佳作，安心下载，放心使用冻融。遇到失意伤心事，多想有一个懂你的人来指点迷津，因他懂你，会以我心，换你心，站在你的位置上思虑，为你排优解难。一个人，来这世间，必须懂得一些人情事理，才能不断成长。就像躬耕于陇亩的农人，必须懂得土地与种子的情怀，才能有所收获。一个女子，一生所求，莫过于找到一个懂她的人，执手白头，相伴终老。即使芦花暖鞋，菊花枕头，也觉温暖；即使粗食布衣，陋室简静，也觉舒适，一句“懂你”,叫人无怨无悔，愿以自己的一生来交付。懂得是彼此的欣赏，是灵魂的轻唤，是惺惺相惜，是爱，是暖，是彼此的融化；是走一段很远的路，蓦然回首却发现，我依然在你的视线里；是回眸相视一笑的无言；是一条偏僻幽静的小路，不显山，不露水，路边长满你喜爱的花草，静默无语却馨香盈怀，而路的尽头，便是通达你心灵的小屋瑟瑟严冬，窗外雪飘，絮絮自语说了这多，你可懂我了吗？若你知晓，无需说话，只报一声心灵的轻叹，那，便是我的花开春暖。你相不相信，人生有一种念想，不求奢华不求结果，不求你在我身边，只愿有一种陪伴暖在心灵，那，便是懂得。有人懂得是一种幸福，懂得别人是一种襟怀，互为懂得是一种境界。懂得，真好！仅供学习与交流，如有侵权请联系网站删除 谢谢6