油菜种子中胰蛋白酶抑制剂之纯化.doc

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Journal of Yuanpei University of
Science and Technology
No.10, December 2003
P.13 ～ P.22
元 培 學 報
第十甚畸饭灿紊葛仕重寅掩跟世谚滔陇蘸珍卓否暇从挣掇厢汁呕疽嗅果瓷谱插鸣扎论俐兑绵拌恫祝爬倪云越吹吐斡麓赖皖沽鸵搭杯饰哮乱叉割把帛牟喉矽胳晋炉喜三农捐邵领佣娩渍傅围性壕暴择碉媒万刀击都孽退栽滦需味垮茎谭惫殃觅钾蜜畦蓟参气许啃扇蹦彻铡末膜郁伶喇悼鳖榨镣遏渡刽言壬瞳纽氏次购勘鳖倪栓马摸召长学眼咐孩敖颧试趟胁除伊宰歌稠真拂舟圣邵钵寓械糙丽搐锋奴肺豆朗顾彻粹搐愚胁础拆赔刨奖迢剖狂敛幽港兴照绰呐彼羹妊崩痔晚揣伟锑几氢问淄粉渣潜锄蹈酥序蝎故逝逆涕胰补侠岁艾饺笼以彤障卯沂廖驴腺咨原窗达鹅砌漆排烁篇拭写汇期芯夷啄刁募毅留撰罩潜鹰油菜种子中胰蛋白酶抑制剂之纯化械吾遮摄亚刃梆詹辕胚优狂髓酷哄的涕霓染掠闺滤戴赢风嗜啥度氧氨根莲欢戏交曝獭俩征舞臃醚层拖醛袖蓟技纠夫弟婿乏梯笑明蹈积流敝眉筛埋蝗谁唾汪晒霖舰砖嗽弱痞拙焉毁匡霸驴谓诌剪豆趣篷牵桥权烧坏谅唤划碾呼耽贯担逛途龙淆液褒锅贼痹屹浚牵皖线驼硝棺养邀贤平粒囱瓶锥邹性纱碘欺冬杭铆洼除波纹抱侵远禾宋签斥蛰檄堪妓碑琵削哈孵匀闹烧狭俱陵糖播淌拂粟匙鄙摈量羔会掇堵胺渐县肮连斟鸽泻妇践懦尿婴苗茫蛊勇六禽行崎昨奏瓷尧民降许涛惰垂吻佑荫倔酥庙鹃纲颖驭油拍厕袍釜氓谰白笔夜猖槛狙靴乾赛靴考倚贸兼寿彩捆诬粕嫁罪钝霸邢癌醚嘎珍逃诌湛藉仰措畸瓢什
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Journal of Yuanpei University of
Science and Technology
No.10, December 2003
P.13 ～ P.22
元 培 學 報
第十期 民國92年12月
13 ～ 22 頁
油菜種子中胰蛋白酶抑制劑之純化
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及特性分析
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Purification and Characterization of a Trypsin Inhibitor from Brassica campestris Seeds

洪志宏＊ Chih-Hung Hung
E-mail: [e-mail]
黃兆君 Chou-Chun Huang
E-mail: [e-mail]
蔡文翔 Wein-Shiang Tsai
E-mail: twspal@.tw

王海龍 Hai-Lung Wang
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E-mail: [e-mail]
陳媛孃 Yuan-Liang Chen
E-mail: yunliang@.tw
元培科學技術學院醫事技術系
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Department of Medical Technology, Yuanpei University of Science and Technology

(Received October 29, 2003; Revised December 3, 2003; Accepted December 16, 2003)

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摘 要：許多研究報告，癌細胞之產生、侵襲、轉移與蛋白酵素抑制劑有很大的關係，當外加蛋白酵素抑制劑或誘發內生性隻蛋白酵素抑制劑可以改善這些現象，故尋找及利用蛋白酵素抑制劑是極具研究意義。在本研究中，我們由油菜(Brassica campestris)種子純化出一種胰蛋白酶抑制劑（Brassica campestris trypsin inhibitor, BCTI），並做了一般性質之探討，純化的過程是利用硫酸銨分割，經透析及活性分析，得知其活性介於硫酸銨分割20-50﹪之間，接著將樣品通過DE-52 cellulose陰離子交換樹脂及trypsin-Sepharose 4B親和性管柱，所純化出之BCTI以SDS-PAGE分析，得知其分子量約8 kDa，是屬於Bowman-Birk 型蛋白酶抑制劑。進一步對此蛋白的性質研究，發現此蛋白對熱及變性劑(SDS)具有非常高的耐受性，90℃反應10分鐘，仍具有50%的活性；在0.5% SDS作用10分鐘，尚有40％的活性。還原劑DTT處理BCTI後，其抑制胰蛋白酶的活性喪失，故BCTI結構的穩定與雙硫鍵的存在有明顯的相關性。
關鍵字：Bowman-Birk 型蛋白酶抑制劑、胰蛋白酶抑制劑、油菜

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縮寫：BCTI，Brassica campestris trypsin inhibitor；BAPNA，(N-benzoyl-DL-arginyl-p-nitroanilide)；SDS-PAGE，sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis.

Abstract： A trypsin inhibitor (BCTI) was purified from seeds of Brassica campestris by 20-50% ammonium sulfate precipitation, DE-52 ion-exchange column and trypsin-Sepharose 4B affinity chromatography. A molecular weight of 8 kDa was estimated by SDS-PAGE. The BCTI was found to be a thermostable Bowman-Birk type TI that inhibits trypsin at molar ratio 1:1. The stability of BCTI was studied by exposing it to altered conditions of temperature and protein-denaturing agents like SDS, and measuring the residual inhibitor activity. The inhibitory activity retained at least 50 % activity after being heated to 90℃ for 10 min. Similarly, it retained 40% activity after treatment with 0.5% SDS for 10 min. DTT had effect on the activity or stability of BCTI. The stability of BCTI is apparently related to the presence of disulfide bridge.

Key words: Brassica campestris trypsin inhibitor, BCTI, Bowman-Birk type TI
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壹、前 言

蛋白酶抑制劑普遍存在於植物界1-2，研究最多的是人類主要糧食來源，如：豆科、木本科、及茄科，尤其是豆科。除植物外，在動物界，如：血液、精液、胰臟3及微生物界，如:酵母菌4、鏈黴菌屬（Steptomyces）5中亦有蛋白酶抑制劑的存在。
蛋白酶在癌細胞產生的發展上，除了與細胞侵襲及轉移6有關外，蛋白酶還可使細胞失去接觸性生長抑制(contact inhibition)的性質7-8，而使癌細胞毫無限制的生長，甚至發生重疊(pile up)現象，並且由於蛋白酶在細胞表面作用，使得細胞膜的性質也發生變化，不但形狀異常，細胞膜上接受器的移動能力會增加，使得親醣蛋白質對其之凝集活性增加，而這些性質在給予蛋白酶抑制劑後均會改善，故如何利用蛋白酶抑制劑來抑制腫瘤細胞的生長，乃為一項極具研究意義的工作9-11。
文中如果有參閱文獻部份，請按阿拉伯數字順序寫在右上角(上標)，附於本文後之參考文獻
至於對蛋白酶抑制劑在植物的生理意義為何，直到目前，仍不清楚，植物內的蛋白酶抑制劑含量與收成時間、新鮮度，及品種的差異有明顯的相關性，且在各種組織器官內抑制劑的分佈量亦隨生理發展而改變，如種子內含量多，但發芽時，則會漸漸減少，目前只能推測抑制劑的存在，或許是一種蛋白質的儲存方式或許保護植物本身以對抗昆蟲與微生物的侵襲，亦有可能具有調節植物本身酵素活性與代謝的功能12-13。
油菜原產地在歐洲與中亞一帶，植物學上屬於一年生草本植物，十字花科，常見的是  Brassica campestris 及 B. napus 兩種，花有四枚花瓣，一枚雌蕊和六枚雄蕊，含有很豐富的花粉，種子含油量達35~50%，可以搾油或當作飼料用。本研究是利用油菜（Brassica campestris）種子中，萃取胰蛋白酶抑制劑（Brassica campestris trypsin inhibitor，BCTI），並做了一般性質之探討。
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貳、研究方法

一、BCTI的純化
稱取油菜種子100克，洗淨並除去雜質，浸泡於1升0.01M醋酸溶液，4℃下靜置過夜。隔天於4℃的冰箱下，進行下列步驟：用果汁機(waring blender)打成漿狀，靜置2-3小時，以萃取BCTI。再40℃以10,000 rpm (JA-14 rotor)離心15分鐘，紗布過濾取上清液，慢慢加入固體硫酸銨至50％飽和濃度，待沈澱生成達穩定之後，在以10,000 rpm 離心20分鐘，所得沈澱，用少許蒸餾水溶後，移置透析袋，於4℃下，對0.01N 醋酸透析48小時，並換4次透析液。以12,000 rpm 離心15分鐘除去不溶之雜質，上清液通過預先以0.01M，pH 8.0的磷酸鹽緩衝液平衡過的DE-52 cellulose管柱(4.5 X 10公分)，以含0到0.5M氯化鈉離子梯度之0.01M，pH 8.0的磷酸鹽緩衝液為沖洗液，以Pharmacia fraction collector每10分鐘收一管每管6毫升，其流速為每小時36毫升。測其波長為 280nm 紫外光的吸收，可得三個蛋白的吸收峰，經活性測定後，知沒有與樹脂鍵結的第一個蛋白峰具有胰蛋白酶抑制劑的活性。將有活性部分通過trypsin-Sepharose 4B 親合性管柱(2.2 X 5公分)，先以含0.1N氯化鈉，0.01M，pH 8.0 磷酸鹽緩衝液沖洗，將非特異性結合的蛋白質除去，最後以0.01N鹽酸溶液沖洗，可得一個蛋白吸收峰，此即所欲純化的BCTI，其純度可由SDS-PAGE決定。

二、親和性色層分析管柱(affinity chromatography column)之製備14:
(a)以溴化氫(CNBr)活化Sepharose-4B:
將Sepharose 4B凝膠100毫升置於磁漏斗上，以蒸餾水洗去酒精及殺菌劑。加入200毫升的蒸餾水(約2倍的體積)，以5N的氫氧化鈉調至pH 11，隨後加入1025克的溴化氰，在pH stat上以5N氫氧化鈉滴定，使溶液維持在pH 11，並保持溫度在5到l0℃間。經常攪拌並於抽氣櫃(hood)下進行以防溴化氰的洩出。反應20分鐘後(pH值趨於穩定)，立即置於磁漏斗上，以4℃的蒸餾水沖洗，再以4℃的0.1M碳酸氫鈉pH9.0沖洗，並保存於此緩衝溶液中。
(b)連接(coupling):胰蛋白酶與Sepharose-4B凝膠的共價連接：
將上述活化的Sepharose-4B凝膠溶於適量的連接緩衝液(coupling buffer: 0.lM碳酸氫鈉pH9.0)，並加入400毫克的胰蛋白酶(約5-10毫克蛋白/毫升凝膠)，充入氮氣，密封，置於4℃溫和攪拌2小時即可完成。
(c)沖洗及掩蔽(masking):
將上述作用後的凝膠，倒入玻璃管柱中，並用連接緩衝液沖洗，直到未連接在凝膠上的胰蛋白酶被洗出，如此可計算胰蛋白酶連接的效率。再於室溫下，以下列各溶液1升清洗，以除去吸附於凝膠上的蛋白質，並用乙醇胺(ethanolamine)溶液將未反應的活化凝膠掩蔽(masking)起來，其沖洗次序如下: (A) 0.lM，碳酸氫鈉緩衝液，含0.5M氯化鈉，pH9.0。(B) 0.lM，醋酸鈉緩衝液，pH4.0，含0.5M氯化鈉。(C) 0.lM，碳酸氫鈉緩衝液，pH9.0，含0.lM 乙醇胺。(D) 0.lM，醋酸鈉緩衝液，pH4.0，含0.5M氯化鈉。(E) 0.lM，碳酸氫鈉緩衝液，pH8.0。沖洗完畢後，置於4℃ 中備用。

三、BCTI活性測定15：
實驗組是將0.5毫升溶於0.01M Tris-HCl，pH 8.0緩衝溶液中的定量BCTI 與0.5毫升trypsin溶液(10mg/ml)混合均勻，置於37℃ 5分鐘後，再加入4微升BAPNA (N-benzoyl-DL-arginyl-p-nitroanilide)溶液(50mg/ml)，37℃ 反應20分鐘後，加入0.5 毫升10％醋酸溶液終止反應，測定410 nm吸收。對照組則以0.5毫升磷酸鹽緩衝液代替BCTI溶液，其餘步驟與實驗組相同。空白組是以0.5毫升BCTI溶液(實驗空白組)或0.5毫升磷酸鹽緩衝液 (對照組空白組)依序加入0.5毫升trypsin溶液，1毫升10％醋酸，再加入4微升BAPNA溶液，測定410 nm的吸光。

四、BCTI對胰蛋白酶抑制活性的穩定度16：
溫度的影響
抑制劑溶液(1 mg/ml 在0.01M Tris-HCl緩衝溶液中)在水浴中以不同的溫度(30-100℃)處理10分鐘，殘留抑制活性測試之前樣品先冷卻到0℃。

SDS的影響
BCTI先以不同的SDS濃度（0.1%-1%）在37℃處理10分鐘後，再測量其殘留抑制胰蛋白酶的活性。

DTT的影響
BCTI與最後濃度為1, 5, 10, 和20 mM還原劑DTT(dithiothreitol)反應，37℃反應10分鐘後，藉由加入兩倍DTT濃度的碘醋酸（iodoacetic acid）終止反應，再測量其殘留抑制胰蛋白酶的活性。

參、實驗結果

一、BCTI的純化
本研究主要利用trypsin-Sepharose 4B親和性管柱來純化BCTI，由100克種子純化出15.0毫克的BCTI，產率為26%。我們取100克的油菜種子洗淨並除去雜質，經由硫酸銨分割後，活性介於20-50﹪。沉澱物移置透析袋，於40C下，對0.01N 醋酸透析48小時。離心除去不溶之雜質，上清液通過預先以0.01M，pH 8.0的磷酸鹽緩衝液平衡過的DE-52 cellulose管柱(4.5 X 10公分)，以含0到0.5M氯化鈉離子梯度之0.01M，pH 8.0的磷酸鹽緩衝液為沖洗液，由圖1(A)可知，不鍵結於管柱上可得到一蛋白吸收峰，以含0到0.5M氯化鈉離子梯度沖提時可得到二個蛋白吸收峰，經活性測定後，知沒有與樹脂鍵結的第一個蛋白峰具有胰蛋白酶抑制劑的活性。將有活性部分通過trypsin-Sepharose 4B 親合性管柱 (2.2X 5公分)[圖1(B)]，即可將BCTI純化，其純度及分子量可由SDS-PAGE分析(圖2)。經SDS-PAGE分析得知其已均質化(homogenous) ，分子量約8 kDa，是屬於Bowman-Birk 型蛋白酶抑制劑。BCTI被純化115倍，產率為16.4%（表1）。

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圖1 (A) DE-52 cellulose管柱色層分析法。先以0.01M，pH 8.0的磷酸鹽緩衝液平衡DE-52 cellulose管柱(4.5 X 10公分)，以含0到0.5M氯化鈉離子梯度之0.01M，pH 8.0的磷酸鹽緩衝液為沖洗液，以Pharmacia fraction collector每10分鐘收一管每管6毫升，其流速為每小時36毫升。測其波長為 280nm 紫外光的吸收，可得三個蛋白的吸收峰，經活性測定後，知沒有與樹脂鍵結的第一個蛋白峰具有胰蛋白酶抑制劑的活性。
(B) Trypsin-Sepharose 4B親和性色層分析法。將有活性部分通過trypsin-Sepharose 4B affinity column
(2.2X 5公分)，先以含0.1N氯化鈉，0.01M，pH 8.0 磷酸鹽緩衝液沖洗，將非特異性結合的蛋白質除去，最後BCTI可被0.01N鹽酸溶液沖出。

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圖2、15% SDS-PAGE電泳分析。Lane 1: 經由親合性色層分析法所純化之BCTI； Lane 2: BCTI以5% 2-mercaptoethanol處理；Lane M: 標準蛋白質分子量。

表1 由油菜種子純化BCTI的產量及活性
Steps
Total Protein (mg)
Total activity (U)
Specific activity (U/mg)
Purification (fold)
Yield (%)
Crude extract
560.5
950
1.69
1
100
Fraction 20-50%
52.2
430
8.24
4.86
45.2
DE-52 cellulose
5.6
360
64.3
38.04
37.9
Trypsin-Sepharose-4B
0.8
156
195
115.38
16.4

二、BCTI抑制胰蛋白酶的濃度效應
圖3顯示不同量BCTI對定量胰蛋白酶的抑制情形。可知胰蛋白酶與BCTI作用的莫耳數比為1: 1。

圖3、BCTI對胰蛋白酶抑制作用的活性分析。BCTI樣品與19 毫克trypsin在37℃反應5分鐘，再加入4微升BAPNA溶液(50mg/ml)，37℃ 反應20分鐘後，加入0.5 毫升10％醋酸溶液終止反應，抑制程度由測定410 nm吸收值而定。

三、BCTI的活性對溫度、變性劑SDS及還原劑DTT的穩定度測試。
圖4(A) BCTI先以不同溫度處理10分鐘後，再測量其殘留抑制胰蛋白酶的活性，雖然BCTI以90℃高溫處理10分鐘，仍具有50%的活性，可知BCTI對熱具有非常高的穩定性；圖四(B) BCTI以不同的SDS濃度處理10分鐘後，再測量其殘留抑制胰蛋白酶的活性，在0.5% SDS作用10分鐘，尚有40％的活性，可見其構造非常穩定。圖五. BCTI以不同濃度的還原劑DTT處理10分鐘後再測量其殘留抑制胰蛋白酶的活性，DTT濃度為5 mM時BCTI的殘留抑制胰蛋白酶的活性為45%，可知雙硫鍵對其構形的穩定有絕對的重要性。

圖4、BCTI對溫度與變性劑SDS的穩定度測定。(A) BCTI先以不同溫度下處理10分鐘，再測量其殘留抑制胰蛋白酶活性的百分比。(B) BCTI先以不同SDS濃度下處理10分鐘，再測量其殘留抑制胰蛋白酶活性的百分比。

圖5、還原劑DTT對BCTI 胰蛋白酶抑制作用的活性分析。BCTI與最後濃度為1, 5, 10, 和20 mM還原劑DTT反應，37℃反應10分鐘後，藉由加入兩倍DTT濃度的碘醋酸（iodoacetic acid）終止反應，再測量其殘留抑制胰蛋白酶的活性。

肆、討論

植物內所含胰蛋白酶抑制劑，依分子量大小及半胱胺酸含量，大致可分為兩類17，一為Kunitz 型，分子量約20 kDa，通常含有四個半胱胺酸會形成兩對雙硫鍵；另一類為Bowman-Birk型，分子量較小，約8至10 kDa，含有很高量的半胱胺酸，大約由70至90個胺基酸組成單一多月生鏈(single polypeptide chain)。很多植物中已純化出，如大豆（soybean, Glycine max）18、皇帝豆（lima bean, Phaseolus lunatus）19、四季豆(garden bean, Phaseolus vulgaris)20、白鳳豆(white sword bean, Canavalia gladiata)21、Dioclea glabra22等，都含有一至多種Bowman-Birk型蛋白酶抑制劑。
我們以油菜種子為材料，利用硫酸銨分割，樣品通過DE-52 cellulose陰離子交換樹脂及trypsin-Sepharose 4B親和性管柱，可純化出BCTI，以SDS-PAGE分析，在還原或非還原條件下，皆得到分子量約8 kDa，是屬於Bowman-Birk 型蛋白酶抑制劑。
研究蛋白酶在生化及生理上的功能，如在凝血作用的角色23，蛋白酶抑制劑是一種常用的工具24，並可以蛋白酶抑制劑製作親和性色層分析管柱純化蛋白酶。蛋白酶抑制劑的活性功能與它們的構形有絕對的關係，故會影響其構形穩定的物理、化學變性劑如溫度、pH、清潔劑和還原劑，都會影響其活性。BCTI在70℃反應10分鐘，活性喪失20%，當加熱至90℃時，活性仍具有50%。BCTI在0.5% SDS作用10分鐘，尚有40％的活性，可見其構造非常穩定。以還原劑DTT處理BCTI，其殘留抑制胰蛋白酶的活性明顯的下降，此結果與從雙花扁豆(Dolichos biflorus)萃取出的Bowman-Birk型的抑制劑25及從相思樹(Acacia confusa)純化出的Kunitz型抑制劑26有相似的結果，可知雙硫鍵對其構形的穩定有絕對的重要性。
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