剑麻均一化文库构建及PnRXLR5863靶蛋白筛选_杨子平.pdf

热带作物学报 2023,44(2):246-253 Chinese Journal of Tropical Crops 收稿日期 2022-05-10；修回日期 2022-06-24 基金项目 现代农业产业技术体系建设专项资金项目（No.CARS-16）；海南省自然科学基金面上项目（No.320MS088）；广东省自然科学基金面上项目（No.2022A1515011841）。作者简介 杨子平（1984），男，博士，助理研究员，研究方向：植物分子生物学。*通信作者（Corresponding author）：周文钊（ZHOU Wenzhao），E-mail：。剑麻均一化文库构建及 PnRXLR5863 靶蛋白筛选 杨子平，杨 倩，汪 询，柯 智，鹿志伟，张燕梅，谌惠邦，周文钊*中国热带农业科学院南亚热带作物研究所/湛江市热带作物遗传改良重点实验室，广东湛江 524091 摘 要：剑麻是硬质纤维的主要来源，由烟草疫霉（Phytophthora nicotianae）引起的斑马纹病是剑麻生产的重要病害。RXLR 效应蛋白是卵菌第一大类效应蛋白，能通过直接的蛋白质相互作用，靶向寄主防卫相关蛋白，干扰和抑制寄主防卫。利用转录组分析不同侵染阶段的烟草疫霉，发现 PnRXLR5863 表达量较高，并且其编码的蛋白含有信号肽、RXLR-EER 和 WY 结构域，瞬时表达发现 PnRXLR5863 能引起烟草细胞死亡，推测 PnRXLR5863 在烟草疫霉侵染剑麻过程发挥重要作用，但是它作用于剑麻的靶蛋白和致病机制还未知。为了筛选 PnRXLR5863 的剑麻靶蛋白，应用Switching Mechanism at 5 end of RNA Transcript（SMART）和 Duplex-Specific Nuclease（DSN）技术构建了剑麻均一化酵母 cDNA 表达文库，并筛选了与 PnRXLR5863 相互作用的蛋白。结果显示，构建的文库库容为 5.32107 CFU/mL，文库总克隆数为 1.064108 CFU，文库片段平均大小为 1000 bp，重组率为 100%；构建的 pGBKT7-PnRXLR5863 诱饵载体无自激活性；利用酵母双杂交系统，以 pGBKT7-PnRXLR5863 诱饵载体，从构建的文库中筛选获得 23 个与PnRXLR5863 相互作用的蛋白。获得的候选靶蛋白主要参与分子功能和生物过程，涉及泛素化过程、蛋白合成、蛋白翻译和蛋白修饰等生理事件，暗示 PnRXLR5863 效应蛋白可能作用于剑麻的蛋白代谢。剑麻均一化酵母表达文库的构建和 PnRXLR5863 靶蛋白的筛选，为进一步深入研究 PnRXLR5863 的致病机理奠定基础。关键词：RXLR 效应蛋白；剑麻；均一化文库；蛋白质相互作用；斑马纹病 中图分类号：S432.1 文献标识码：A Construction of Yeast Two-hybrid Normalized Library and Screening of Interaction Proteins of PnRXLR5863 in Agave hybrid No.11648 YANG Ziping,YANG Qian,WANG Xun,KE Zhi,LU Zhiwei,ZHANG Yanmei,SHEN Huibang,ZHOU Wenzhao*South Subtropical Crops Institute,Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences/Zhanjiang Key Laboratory of Tropical Crop Genetic Improvement,Zhanjiang,Guangdong 524091,China Abstract:Agave spp.is main resource of hard fiber.Zebra disease,caused by the pathogen Phytophthora nicotianae,is one of the most devastating sisal oomycete diseases.RXLR effector proteins are important cytoplasmic effectors of oomycete and more than 300 RXLR effector genes were identified in the genomes of P.nicotianae.RXLR effectors have the ability to manipulate or suppress host immunity by directly binding host proteins.A typical RXLR effector(named PnRXLR5863)that induced programmed cell death(PCD)was identified from P.nicotianae,but the targets in Agave were still unknown.This study aims to obtain the host plant proteins that are interacting with PnRXLR5863 in A.hybrid No.11648.A normalized cDNA library was constructed by combining Switching Mechanism at 5 end of RNA Transcript(SMART)and Duplex-Specific Nuclease(DSN)technology.The capacity of cDNA library was 5.32107 CFU/ml,the independent clones was 1.064108 CFU,and the lengths of inserts ranged from 0.5 kb to 3.0 kb,with the recombination rate of 100%.A total of 23 proteins interacting with PnRXLR5863 were obtained by sequencing and 第 2 期 杨子平等：剑麻均一化文库构建及 PnRXLR5863 靶蛋白筛选 247 homology analysis.Some of target proteins involve several physiological events,such as ubiquitination,protein synthe-sis,protein translation and protein translation,suggesting that PnRXLR5863 effector may act on protein metabolism of Agave spp.This research would lay a foundation for further study of the pathogenic mechanism of PnRXLR5863.Keywords:RXLR effector protein;Agave hybrid No.11648;normalized library;protein interaction;zebra disease DOI:10.3969/j.issn.1000-2561.2023.02.003 效应蛋白是病原微生物产生的一类有利于病原微生物侵染的蛋白质。卵菌中存在数量庞大的效应蛋白基因，其中 RXLR 类效应蛋白的数量最多。大豆疫霉约含有 396 个编码 RXLR 效应蛋白的基因，拟南芥霜霉菌有 134 个，橡树疫霉菌有 374 个，马铃薯疫霉菌有 563 个，葡萄霜霉菌有 100 个，烟草疫霉存在超过 300 个1-2。RXLR 效应蛋白的 N端含有约 20 个氨基酸的信号肽，在第 4090 位氨基酸处含有一个保 RXLR 基序，之后为序列多态性的效应分子功能区域，存在数量不等的 W、Y 或者L 基序3。RXLR 为胞内效应蛋白，可以抑制植物ROS 的产生、胼胝的沉淀和 SA 的含量等基础防卫反应。进一步研究发现，RXLR 效应蛋白能通过 C端功能域结合寄主内靶蛋白，调节寄主靶蛋白功能，抑制或者干扰寄主多个生理事件。例如Hyaloperonospora arabidopsidisd 的 HaRxLL470 与HY5 相互作用并抑制防御相关基因的转录4；大豆疫霉（Phytophthora sojae）的 PsAvr3c 与剪切体SKRP 蛋白互作，导致防卫相关蛋白的 Pre-mRNA剪切异常5；致病疫霉（Phytophthora infestans）的 PITG20303 靶向并稳定马铃薯免疫负调控因子丝裂原活化蛋白激酶 StMKK1，影响水杨酸信号通路6-7；大豆疫霉（P.sojae）的 PsAvh262 稳定内质网蛋白 BiPs，引起细胞坏死8-9。卵菌属烟草疫霉引起的斑马纹病，是剑麻生产中的主要病害。烟草疫霉通过游动孢子侵染剑麻的叶片，初期引起斑马纹的病症，之后逐步引起叶腐和茎腐10。目前关于剑麻斑马纹病的研究还处在病原物的分离鉴定、病原流行性方面，而对烟草疫霉侵染剑麻的致病机制缺乏深入研究。本课题组已对侵染剑麻不同时间的烟草疫霉进行了转录组测序，转录组检测到 214 个编码 RXLR的基因。其中 PnRXLR5863 表达水平高且表达水平变化显著，其编码的蛋白 N 端含有信号肽和RXLR-EER 结构域，C 端含有 W 和 Y 功能结构域。在烟草叶片中瞬时表达 PnRXLR5863，能引起细胞死亡，推测 PnRXLR5863 是侵染剑麻的关键 RXLR 效应蛋白，但是 PnRXLR5863 作用剑麻的靶蛋白和作用分子机制还不清楚。因此，本研究构建了剑麻酵母双杂交均一化 cDNA 表达文库，筛选了与 PnRXLR5863 相互作用的靶蛋白。结果为深入研究 PnRXLR5863 的致病机制奠定基础。1 材料与方法 1.1 材料 剑麻（Agave hybrid No.11648）采自中国热带农业科学院南亚热带作物研究所剑麻种质保存圃；Trizol 购自 Invitrogen 公司；Oligo(dT)、DNA clean beads 和 PCR mix 磁珠购自诺唯赞公司；均一化试剂盒购自 Evrogen 公司；反转录试剂盒、Hi-Fusion 试剂盒、EcoR I、双链 cDNA 纯化、酵母转化和文库构建试剂盒购自 Clontech 公司；用于 配 制 酵 母 培 养 基 的 试 剂 和 其 他 试 剂 购 自Sigma-Aldrich 公司。引物合成与 DNA 测序委托广州艾基生物技术有限公司。1.2 方法 1.2.1 总 RNA 的提取 采集 Agave hybrid No.11648植株叶片，液氮速冻。将样品研磨成粉，Trizol 法提取其总 RNA。采用 Oligo（dT）磁珠纯化 mRNA。1.2.2 RNA 的反转录 反应体系中加入 1.0 L CDS 和 1.0 L SMART 引物，1500 ng 的mRNA，DEPC H2O 补齐到 5 L，72 3 min，立即置于冰上。之后依次加入 1.0 L DTT，1.0 L dNTP，1.0 L MMLV Reverse Transcriptase，2.0 L 5First-Strand buffer，42 90 min，然后 70 15 min 终止，冷却至室温，加入 1 L RNase H，37 30 min，产物存放于80保存。CDS 引物和 SMART 引物序列见表 1。1.2.3 双链 cDNA 的合成 2.0 L 单链 cDNA，2.0 L 5 PCR 和 3 PCR 引物，25 L Advantage 2 Polymerase Mix 合成双链 cDNA，加水补齐到50 L。PCR 扩增条件为：95 3 min；95 15 s；60 15 s；72 6 min，72 10 min，30 个循环。5 PCR 引物和 3 PCR 引物序列见表 1。1.2.4 双链 cDNA 的纯化 将 1.2 倍样品体积的磁珠液与双链 cDNA 混匀，室温孵育 10 min，转248 热带作物学报 第 44 卷 移到磁力架上，待溶液澄清后（约 5 min），小心移除上清。200 L 新鲜配制的 80%乙醇漂洗磁珠（不要搅动磁珠），室温孵育 30 s，小心移除上清；室温下开盖干燥磁珠 510 min，加入 3050 L 无核酸酶 ddH2O，室温静置 2 min，小心吸取上清至一个新的无核酸酶 EP 管中。1.2.5 cDNA 均一化 按照以下体系进行杂交：1 g ds cDNA，8 L 2Hybridization buffer，水补齐到 16 L，将上述溶液平均分成 4 份，置于 0.2 mL PCR 管中；PCR 仪上 98放置 2 min，迅速转移到准备好的 68 PCR 仪中 5 h。按照以下体系进行 DSN 消化：4 L 杂交后的 cDNA，5 L 2DSN master buffer（68预热），1 L DSN solution（分别为 DSN，1/2 DSN，1/4 DSN，control），水补齐到 16 L，68反应 25 min。按照以下体系进行 PCR 放大：10 L 2DSN stop buffer，室温放置 5 min。5 L 10Advantage 2 PCR buffer，1 L 50dNTP Mix，1.5 L Primer M1，1 L 50 Advan-tage 2 Polymerase Mix，1 L 消化后产物（即 DSN，1/2 DSN，1/4 DSN，control），水补齐到 50 L。PCR 扩增条件为：95 1 min；95 15 s；66 20 s；72 3 min，11 个循环。1.2.6 cDNA 小片段去除 预先将 CHROMA SPINTM TE-400 纯化柱中胶体和缓冲液混合均匀，瞬时离心弃液体。将 93 L 双链 cDNA 加入纯化柱胶体，700 g 离心 5 min。向收集液中加入 2.5倍体积无水乙醇和 1/10 体积的 3 mol/L 乙酸钠（NaAc），置于20沉淀 DNA。用 20 L 无菌水溶解沉淀物，并测定双链 cDNA 浓度。1.2.7 双链 cDNA 与 pGADT7（lineared）同源重组 按照以下体系进行同源重组：2 L ds cDNA，50200 ng pGADT7，4 L 5CE II buffer，2 L Exnase II，水补齐到 20 L，在 37反应 30 min，置于冰上。按照以下体系进行产物纯化：20 L重组产物，2 L 核酸助沉剂，55 L 100%乙醇，混匀后于20放置 30 min，13 000 r/min 离心15 min，弃上清；加入 1 mL 75%乙醇洗涤沉淀，8000 r/min 离 心 2 min，弃 上 清；室 温 下 晾510 min，加入 10 L TE buffer 溶解沉淀。1.2.8 文库构建 将 10 L 重组产物电击转化至50 L 电转感受态中，取 10 L 菌液稀释 10 000倍后，从中取 100 L 涂布于含 Amp 抗生素的 LB平板，37倒置过夜培养。剩余菌液加入甘油至终浓度为 20%即为文库菌液。1.2.9 文库质量检测 文库库容（CFU/mL）=克隆数/涂布体积稀释倍数。总克隆数（CFU）=库容菌液总体积。PCR 克隆鉴定体系如下，10 L 2 PCR Mix，1 L T7-F，1 L 3AD，水补齐到20 L。PCR 扩增条件为：95 3min；95 15 s；55 15s；72 5 min，72 5 min，25 个循环。1.2.10 诱饵载体构建 设计携带 EcoR I 酶切位点的特异引物（表 1），扩增 PnRXLR5863 编码框。将 PnRXLR5863 编码框插入 pGBKT7 载体，构建诱饵载体。1.2.11 诱饵载体自激活检测 将 pGBKT7-PnRXLR5863 载体转化 AH109 酵母菌株，转化液涂布于不含色氨酸的培养基（SD/-Trp），30恒温培养 34 d。随机挑取 6 个点，用 pGBKT7 的载体引物进行 PCR 验证，随机取 3 个正确克隆点板至 SD/-Trp、SD/-Trp/-His、SD/-Trp/-His/-Ade、SD/-Trp/-His/-Ade+X-gal 板上，30培养 35 d。其中 pGBKT7 为阴性对照。表 1 本研究所用引物 Tab.1 Primers of this study 引物名称 Primer name 用途 Usage 引物序列（53）Primer sequence(53)酶切位点 Restriction site SMART III Oligo AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTGGCCATTATGGCCGGG CDS III primer For first-strand cDNA synthesis ATTCTAGAGGCCGAGGCGGCCGACATG-d(T)30VN 5PCR primer TTCCACCCAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTGG 3PCR primer For cDNA amplification GTATCGATGCCCACCCTCTAGAGGCCGAGGCGGCCGACA PGAD-5 CTATTCGATGATGAAGATACCCCACCAAACCC PGAD-3 For sequencing of pGADT7 GTGAACTTGCGGGGTTTTTCAGTATCTACGAT PGBK-5 GTAATACGACTCACTATAGGGCGAGCC PGBK-3 For sequencing of pGBKT7 TTCGTTTTAAAACCTAAGAGTCACTTTAAA BK-PnRXLR5863-F atggccatggaggccgaattcATGTCGACGAATGTCGAACAA EcoR I BK-PnRXLR5863-R For constructing of bait vector cgctgcaggtcgacggatcccGCTTTTGTTCTTCTTGTTGTTGTA EcoR I 第 2 期 杨子平等：剑麻均一化文库构建及 PnRXLR5863 靶蛋白筛选 249 1.2.12 互作蛋白筛选 制备 AH109 酵母感受态，将文库质粒和诱饵质粒 pGBKT7-PnRXLR5863共转化 AH109 酵母菌，转化液涂布于 SD/-Trp/-His/-Ade 筛选平板。2 结果与分析 2.1 总 RNA 的提取 为了鉴定所提取的 RNA 是否能用于下游建库，从中吸取 2 L 进行琼脂糖电泳检测和分光光度计测量。结果显示，能清晰地看到 28S 和 18S两条带，5S 条带很弱甚至无，表明所提 RNA 完整性好，无降解（图 1A）。OD260/OD280在 1.82.2之间，表明 RNA 纯度高；OD260/OD230大于 2，表明糖类、盐类、有机溶剂等去除干净。因此，所提取 RNA 可用于下游建库。2.2 cDNA 的合成 为了判断所获得的 ds cDNA 是否合成，PCR结束后取 5 L 进行琼脂糖电泳检测。结果显示ds cDNA 呈现弥散条带（图 1B），表示各种大小的条带都有，合成的 cDNA 质量较好。2.3 cDNA 的纯化 为了检测小片段是否去除，从纯化后的溶液里边吸取 5 L 进行琼脂糖电泳检测。结果显示ds cDNA 呈弥散条带，500 bp 以下几乎看不到条带，表明小片段去除干净（图 1C）。2.4 克隆计数 为了确定文库库容，对电转化液稀释 10 000倍。经培养，平板上克隆约为 532 个，根据公式计算得到库容为 5.32107 CFU/mL，总克隆数为1.064108 CFU（图 2）。1：剑麻总 RNA;2：未纯化的双链 cDNA：3：纯化的双链 cDNA；M：DL5000 DNA marker。1:Total RNA;2:Unpurified ds cDNA;3:Purified ds cDNA;M:DL5000 DNA marker.图 1 剑麻总 RNA（A）及双链 cDNA（B、C）Fig.1 Total RNA(A)and double-strand cDNA(ds cDNA)(B,C)图 2 文库菌落 Fig.2 Independent clones of library 2.5 文库质量鉴定 为了检测文库的条带分布，从平板上随机挑选 24 个克隆进行菌落 PCR。检测结果显示，文库条带在 1000 bp 上下出现，说明文库片段平均大小在 1000 bp（图 3）。2.6 自激活检测 为了检测诱饵载体是否有自激活，将含诱饵载 体 的 酵 母 菌 点 至 SD/-Trp、SD/-Trp/-His、SD/-Trp/-His/-Ade、SD/-Trp/-His/-Ade+X-gal 平板上。结果显示，阴性对照 pGBKT7 能在 SD/-Trp平板上生长，在 SD/-Trp/-His、SD/-Trp/-His/-Ade、SD/-Trp/-His/-Ade+X-gal 平板上均不能正常生长。实验组与对照组生长一致（图 4）。结果说明诱饵载体无自激活现象。250 热带作物学报 第 44 卷 M:DL5000 DNA marker.图 3 文库片段检测 Fig.3 Insert fragments detection of library by PCR 图 4 自激活检测结果 Fig.4 Autoactivation detection of bait vector 2.7 靶蛋白筛选 为了获得阳性克隆，从 SD/-Trp/-Leu/-His 筛库平板上挑取了 96 个克隆（图 5），转板培养一次，对这 96 个克隆进行 PCR 扩增并对 PCR 产物测序，测序结果与 GenBank 数据库中的序列进行BLAST 比对分析，去除重复获得 23 个阳性克隆（表 2）。蛋白功能注释结果显示，这些蛋白主要参与分子功能和生物过程，涉及泛素化过程、蛋白合成、蛋白翻译和蛋白修饰等生理事件。+：阳性对照（pGADT7-largeT+pGBKT7-p53）。+：Positive control(pGADT7-largeT+pGBKT7-p53).图 5 转板阳性克隆 Fig.5 Potential positives on SD/-Trp/-Leu/-His 2.8 阳性克隆回转验证 将阳性克隆与诱饵载体共转化 AH109 酵母菌，点板至 SD/-Trp/-Leu、SD/-Trp/-Leu/-His、SD/-Trp/-Leu/-His/Ade 和 SD/-Trp/-Leu/-His/Ade+X-gal 缺陷平板，进行阳性克隆的回转验证。结果显示（图 6），阳性对照能在 SD/-Trp/-Leu、SD/-Trp/-Leu/-His、SD/-Trp/-Leu/-His/Ade 和 SD/-Trp/-Leu/-His/Ade+X-gal 缺陷平板上生长，并能在SD/-Trp/-Leu/-His/Ade+X-gal 缺陷平板上显蓝色；阴性对照仅在 SD/-Trp/-Leu 平板上能生长，而在其他平板均不能生长。23 个阳性克隆能在 SD/-Trp/-Leu 和 SD/-Trp/-Leu/-His 缺陷型平板上生长，8 个阳性克隆能在SD/-Trp/-Leu/-His/Ade、SD/-Trp/-Leu/-His/Ade+X-gal 平板上生长，并能在 SD/-Trp/-Leu/-His/Ade+X-gal 缺陷平板上显蓝色。3 讨论 酵母双杂交是目前能够进行高通量筛选相互作用蛋白的技术之一，文库质量直接影响互作蛋白的筛选。通常通过文库基因的完整性和复杂性来评估 cDNA 文库的质量。cDNA 序列的完整性和丰度决定了文库的完整性，mRNA 序列的完整直接影响 cDNA 系列的完整性。采用 SMART 技术构建 cDNA 文库，要求实验材料少、操作简单、快速11，能够较真实地反映样品中转录本的表达水平，但是低丰度表达基因容易在文库构建过程中丢失，且不利于筛选获得低丰度表达基因，高丰度表达基因也会给筛选带来一定的困难12。而利用 DSN 酶处理 cDNA，能降低高表达基因的拷贝，增加低丰度基因的拷贝13，提高筛库获得低丰度表达基因的几率。文库的完整性可以通过库容来进行量化评估，高质量文库的库容至少为106 CFU，低于此指标，不利于获得阳性克隆11。文库片段正确表达可以增加文库的复杂性，通过 第 2 期 杨子平等：剑麻均一化文库构建及 PnRXLR5863 靶蛋白筛选 251 表 2 与 PnRXLR5863 相互作用的蛋白 Tab.2 List of proteins interacted with PnRXLR5863 编号 No.蛋白名称 Protein name cDNA 长度 cDNA length/bp 功能 Function 1 PREDICTED:uncharacterized protein 873 Unknown protein 2 PREDICTED:ferrochelatase-1 957 Molecular Function:ferrochelatase activity 3 PREDICTED:60S ribosomal protein L12-like 916 Molecular Function:structural constituent of ribosome 4 PREDICTED:peptidyl-prolyl cis-trans isomerase CYP20-11070 Biological Process:protein peptidyl-prolyl isomerization 5 PREDICTED:uncharacterized protein 932 Unknown protein 6 Hypothetical protein AMTR_s00007p00132320 1003 Molecular Function:structural constituent of ribosome 7 PREDICTED:uncharacterized protein 987 Unknown protein 8 PREDICTED:ubiquitin-conjugating enzyme E2 32-like 920 Biological Process:ubiquitin-dependent protein catabolic process 9 PREDICTED:LOW QUALITY PROTEIN:tricalbin-3-like1253 Unknown protein 10 PREDICTED:oxygen-evolving enhancer protein 3-2 1038 Molecular Function:calcium ion binding 11 Hypothetical protein 966 Molecular Function:electron transfer activity 12 PREDICTED:dnaJ protein homolog isoform X2 943 Molecular Function:ATP binding 13 Uncharacterized protein 1103 Unknown protein 14 PREDICTED:putative pleiotropic drug resistance protein 7766 Molecular Function:ATP binding 15 PREDICTED:protein NRT1/PTR FAMILY 3.1-like 800 Molecular Function:transporter activity 16 PREDICTED:60S ribosomal protein L18a-2 819 Molecular Function:structural constituent of ribosome 17 S-adenosyl-L-methionine synthetase 848 Molecular Function:methionine adenosyltransferase activity 18 S-adenosyl-L-methionine synthetase 1130 Molecular Function:methionine adenosyltransferase activity 19 PREDICTED:mannose-specific lectin-like 1042 Unknown protein 20 PREDICTED:beta-glucosidase 18-like 651 Molecular Function:hydrolase activity 21 Hypothetical protein 486 Unknown protein 22 PREDICTED:small nuclear ribonucleoprotein E 754 Biological Process:mRNA splicing,via spliceosome 23 PREDICTED:acyl carrier protein 1 913 Biological Process:fatty acid biosynthetic process +：阳性对照（pGADT7-largeT+pGBKT7-p53）；：阴性对照（pGADT7-largeT+pGBKT7-laminC）。+:Positive control(pGADT7-largeT+pGBKT7-p53);:Negative control(pGADT7-largeT+pGBKT7-laminC).图 6 阳性克隆回转验证 Fig.6 Confirm interaction in yeast 合成三框 cDNA 来实现文库复杂性，目的是保证文库片段都能表达出与样本体内相同的蛋白13。这样，一方面能增加获得互作蛋白的概率，另一方面也能减少假阳性。为了构建高质量的剑麻酵母 cDNA 表达文库，本研究从总 RNA 中纯化了mRNA，采用三框引物合成 cDNA，利用 DSN 对cDNA进行均一化，SMRT技术构建重组文库质粒，最后将质粒电击转化大肠杆菌，构建了一个文库片段平均大小在 1000 bp、库容为 5.32 107 CFU/mL、总克隆数为 1.064108 CFU 的均一化文库。在之前的研究中，为了筛选与剑麻AhKNOX2蛋白相互作用的蛋白，以健康剑麻叶片总 RNA 反转录获得的 cDNA 为材料，采用体内同源重组的方式，在酵母体内构建了一个酵母双杂交文库，252 热带作物学报 第 44 卷 其文库总容量为 3.9106 CFU，插入片段大小主要分布于 0.53.0 kb 之间，重组率为 92%14。与前一个文库构建不同的是，为了筛选与病原菌效应蛋白互作的剑麻靶蛋白，选用烟草疫霉侵染的剑麻叶片为材料，目的是激发剑麻抗病基因的表达。为排除文库编码核糖体蛋白的 cDNA 的插入，以及确保文库插入 cDNA 能正确表达，从总 RNA中纯化了 mRNA，并采用了三框引物对 mRNA 进行反转。为了降低高表达基因的丰度和提高低表达量基因的丰度，本研究对合成的双链 cDNA 进行了均一化。此外，为了提高转化效率，本次采用体外同源重组和电击转化，在大肠杆菌中构建表达文库。由文库质量评估可知，新文库的库容量达到 107，比前一个文库提升一个数量级。剑麻CDS 平均长度为 1087 bp（未公布的基因组数据），新老文库筛选获得的阳性克隆插入片段平均长度为 920 bp 和 1050 bp，排除由于诱饵蛋白功能导致的靶蛋白的差异，2 个文库的插入片段均有较好的完整性。RXLR 是卵菌中第一大类效应蛋白，能够通过与寄主防御蛋白结合，在表观修饰水平抑制抗病基因转录15-16；在转录水平抑制寄主防卫基因的转录4,17-18；在转录后水平干扰寄主防卫基因的翻译5,19；干扰寄主信号转导6-7,20-22；调控自噬23；调控细胞间运输24；介导内质网应激8-9；操纵活性氧信号25。本研究以 PnRXLR5863 为诱饵，通过酵母双杂交从剑麻文库中获得 23 个互作蛋白。已知功能的 16 个蛋白，涉及泛素化过程、蛋白合成、蛋白翻译和蛋白修饰等生理事件。推测烟草疫霉侵染剑麻过程，PnRXLR5863 效应蛋白可能作用于剑麻的蛋白代谢。参考文献 1 LIU H,MA X,YU H Q,FANG D H,LI Y P,XIAO W X,WANG W,YANG D Y,XIAO B G.Genomes and virulence difference between two physiological races of Phytophthora nicotianaeJ.Gigascience,2016,5(1):3.2 YIN L,AN Y H,QU J J,LI X L,ZHANG Y L,DRY I,WU H J,LU J.Genome sequence of Plasmopara viticola and in-sight into the pathogenic mechanismJ.Scientific Reports,2017,7:46553.3 POPPEL P M,JIANG R H,SLIWKA J,GOVER F.Recog-nition of Phytophthora infestans Avr4 by potato R4 is trig-gered by C-terminal domains comprising W motifsJ.Mo-lecular Plant Pathology,2009,10(5):611-620.4 CHEN S Y,MA T,SONG S R,LI X L,FU P N,WU W,LIU J Q,GAO Y,YE W X,DRY I B,LU J.Arabidopsis downy mildew effector HaRxLL470 suppresses plant immu-nity by attenuating the DNA-binding activity of bZIP tran-scription factor HY5J.New Phytologist,2021,230(4):1562-1577.5 HUANG J,GU L F,ZHANG Y,YAN T X,KONG G H,KONG L,GUO B D,QIU M,WANG Y,JING M F,XING W M,YE W W,WU 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