一株鸡源沙门氏菌的分离鉴定及药敏试验_熊菊萍.pdf

8xperimental study on onlineE实验研究一株鸡源沙门氏菌的分离鉴定及药敏试验熊菊萍1，肖滢宇1，王 稳1，韩青松2，高小龙1，李增魁1，文 英1，仝丽娜1（1.青海大学农牧学院 810000；2.温州科技职业学院 325006）摘要：为查明青海省湟源县周边某鸡场疑似细菌病感染的病原，制定合理的治疗方案。从发病鸡场无菌采集病死鸡的样品进行细菌分离纯化、革兰染色镜检、生化鉴定、16S rRNA基因扩增、致病性试验和药敏试验。结果显示，从该病鸡场分离菌为两端钝圆、短小的革兰阴性杆菌，其生化特性与沙门菌相符。通过 PCR 成功扩增出 1500 bp 大小的 16S rRNA 基因，测序比对后，显示与沙门菌同源性最高。雏鸡致病性试验结果显示，此株沙门菌对雏鸡的有致病性。药敏试验结果显示，该菌株对阿莫西林、头孢唑啉和丁胺卡那等敏感，对氨苄西林、庆大霉素和链霉素等药物有耐药性，提示该菌对头孢类、喹诺酮类等多种药物高度敏感，而对糖肽类、大环内酯类等多种药物产生了耐药性。上述结果为该地区鸡沙门氏菌病的防治提供了参考。关键词：鸡；沙门氏菌；分离鉴定；药敏试验沙门氏菌（Salmonella）为革兰氏阴性兼厌氧杆菌，属于肠杆菌科沙门氏菌属，不形成芽孢、多数无荚膜、多单个存在1。该菌通常寄生在动物的肠道中，对大部分动物均有致病性，能引起多种动物的沙门氏菌病，症状以腹泻和败血症等为主。同时，沙门氏菌是人类细菌性食物中毒的主要病原之一，在人医、兽医和公共卫生上具有重要意义2。该菌血清型众多，目前已鉴定出 2500 多种3。常见的鸡沙门氏菌病有鸡白痢、鸡伤寒以及鸡副伤寒，分别由鸡白痢沙门氏菌、鸡伤寒沙门氏菌和其他具有运动性的沙门氏菌（主要为肠炎沙门氏菌和鼠伤寒沙门氏菌）引起。沙门氏菌感染雏鸡后，可导致严重腹泻，死亡率较高，感染成鸡后，可引起腹膜炎、输卵管炎或造成隐性感染等4,5，造成生产性能和蛋品质降低，并且该菌可垂直传播，对养禽业危害巨大6。抗生素的应用，不仅有效降低和缓解了畜禽包括沙门氏菌病在内的多种细菌病毒防控的压力，也起到了促进动物生长的作用，然而随着养殖场抗生素类药物的广泛、持续、不合理、不规范使用甚至滥用，使沙门氏菌对抗生素类药物的耐药性越来越普遍，多重耐药菌株不断出现7,8。因此，调查了解沙门氏菌耐药性状况，对指导我省养鸡场合理用药具有重要意义。2020 年 10 月，青海湟源县某散养鸡场部分雏鸡发病，病鸡精神沉郁、剧烈腹泻，后期死亡。为确定病鸡死亡原因，本研究无菌采集病死鸡脏器病料，分离到一株疑似菌，经革兰氏染色镜检、生化鉴定、16SrRNA 基因扩增和测序后，鉴定为沙门氏菌，并对分离菌进行了致病性试验和药敏试验，旨在为本地区鸡沙门氏菌病的防治提供参考。1 材料与方法1.1 病料病料来自青海省湟源县某蛋鸡场病死鸡。1.2 主要试剂营养琼脂培养基、MH 琼脂培养基购自杭州微生物试剂有限公司；SS 琼脂、细菌微量生化鉴定管和抗菌药物药敏纸片购自青岛海博生物技术有限公司；革兰氏染色试剂盒购自北京索莱宝科技有限公司；胶回收试剂盒和 DL2000DNAMaker 购自天根生化科技有限公司；2EasyTaqPCRSuperMix 购自北京全式金生物技术有限公司；营养肉汤购自北京奥博星生物技术有限公司；麦氏比浊管购自温州市康泰生物科技有限公司。1.3 试验动物1 周龄 SPF 鸡购自宁波纯派农业科技有限公司。1.4 分离培养与镜检采用无菌操作，将采集的肝脏、脾脏样品进行沙门氏菌的分离纯化及鉴定。以平板划线法将样品接种于普通营养琼脂和SS 琼脂培养基，于恒温培养箱内 37培养约 24h。用接种环挑取平板上生长的菌落至 SS 琼脂培养基进行纯化培养。用无菌接种环挑取 12 环生理盐水于载玻片中央，再用灭菌后的接种环挑取纯化培养后的沙门氏菌疑似菌落的单个菌落，与载玻片中央的生理盐水混匀，将混合物涂布至直径 1cm左右的薄层，室温干燥后用酒精灯加热玻片固定菌。瑞氏染色法将制好的玻片染色，用电子显微镜观察菌体的形态特征。1.5 生化鉴定用无菌接种环或棉签将上述纯化培养后的菌落接种于色氨酸肉汤、赖氨酸脱羧酶、尿素酶、氰化钾、山梨醇、水杨苷、丙二酸盐、卫矛醇半固体、ONPG、甘露醇细菌生化鉴定管内，置于恒温培养箱内37培养1824h。参考 伯杰细菌鉴定手册判定生化鉴定结果。1.6 细菌 16S rRNA 基因扩增水煮法提取分离纯化后的沙门菌 DNA。设计 16SrRNA基因 引 物，16SrRNA-F：5-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3，16SrRNA-R:5-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA3，目的片段 1500bp。以提取的沙门氏菌DNA为模板，进行PCR扩增，反应体系为：2TaqMix25L、上下游引物各 1L、模板 2L，ddH2O 将体系补至 50L。反应条件为：94预变性 5min；94变性30s，55退火 30s，72延伸 1min，35 个循环；72延伸 10min。将 PCR 产物用 1%琼脂糖凝胶电泳检测，目的片段切下后用胶回收试剂盒进行胶回收，将胶回收产物送至上海生工生物有限公司测序，测序结果在 NCBI 进行 BLAST 比对。1.7 雏鸡致病性试验将 10 只 1 周龄 SPF 雏鸡分为两组，每组各 5 只，第一组为试验组，第二组为对照组。第一组试验组的雏鸡腹腔注射1mL 麦氏比浊度为 1 的分离菌菌液，第二组试验对照组腹腔注射 1mL 无菌的营养肉汤。每 12h 观察一次各组雏鸡的健康状况和死亡情况。将死亡的雏鸡进行尸体剖检，观察其内脏病变并采集脏器进行细菌的分离鉴定。今日畜牧兽医91.8 药敏试验采用 K-B 纸片扩散法进行药敏试验。将纯化的细菌接种到 SS 培养基上，37培养 24h，挑取单个菌落接种于 5mL 营养肉汤中，37、220r/min 摇床培养 14h。用灭菌 PBS 调节菌液浓度至 0.5 麦氏比浊度。用灭菌棉签将稀释好的菌液均匀涂布于 MH 琼脂平板上，放置 5min 后贴上药敏纸片。将培养皿倒置放入恒温培养箱，37培养 2448h。测量抑菌圈直径。2 结果2.1 细菌的形态特征和镜检结果从该鸡场病料中分离的细菌在 SS 琼脂培养基上呈现半透明、表面光滑、边缘整齐的圆形菌落（图 1A）；革兰染色镜检为红色、长短不一的短杆菌，判断为革兰阴性菌（图 1B）。图 1 分离菌株菌落形态和革兰氏染色镜检结果A：分离菌在 SS 培养基上生长形态；B：革兰染色菌体形态2.2 生化试验分离菌接种微量生化鉴定管后，生化鉴定结果如表 1 所示，赖氨酸脱羧酶、山梨醇、水杨苷和甘露醇试验呈阳性；色氨酸肉汤、尿素酶、氰化钾、丙二酸盐、卫矛醇半固体、ONPG 试验反应呈阴性，与伯杰细菌鉴定手册中沙门氏菌的生化特征相符合。表 1 生化鉴定结果项目结果项目结果色氨酸肉汤-水杨苷+赖氨酸脱羧酶+丙二酸盐-尿素酶-卫矛醇半固体-氰化钾-ONPG-山梨醇+甘露醇+注:+表示阳性，表示阴性。2.3 细菌 16S rRNA 和 invA 基因扩增以水煮法制备的分离菌 DNA 为模板，用 16SrRNA 引物进行 PCR 扩增，PCR 产物经 1%琼脂糖凝胶电泳检测，显示成功扩增出 1500bp 的 16SrRNA 基因条带（图 2）。切胶回收 1500bp 的 16SrRNA 条带，胶回收产物送至上海生工生物有限公司测序，测序结果在 GenBank 公布的序列进行 BLAST 比对，结果显示与沙门氏菌同源性最高，为 99.53%。由以上结果可判定该菌株为沙门氏菌。图 2 16S rRNA 基因 PCR 扩增结果M：2000DNAMarker；12：16SrRNA 基因；3：阴性对照2.4 雏鸡致病性试验试验组雏鸡在腹腔接种菌液后 12h 开始发病，36h 后出现死亡，48h 后全部死亡。将死亡雏鸡解剖后从脏器中成功分离出沙门氏菌；第二组对照组所有雏鸡均状况良好，无死亡状况。以上结果表明，该分离菌具有致病性。2.5 药敏试验根据药敏试验结果判定标准，药敏试验结果如表 2 所示，该菌株对阿莫西林、头孢唑啉、头孢噻肟、丁胺卡那、卡那霉素、四环素、多西环素、环丙沙星、氧氟沙星、蒽诺沙星、氯霉素、多粘菌素 B、氟苯尼考敏感，对万氨苄西林、庆大霉素、链霉素、万古霉素和利福平有耐药性。表 2 药敏试验结果抗生素药物含量/g抑菌圈直径/mm判断结果抗生素药物含量/g抑菌环直径/mm判定结果氨苄西林1011R多西环素3022S阿莫西林2031S环丙沙星538S头孢唑啉3032S氧氟沙星541S头孢噻肟3042S恩诺沙星37S丁胺卡那3022S氯霉素3033S庆大霉素1010R氟苯尼考3038S链霉素1011R多粘菌素 B30018S卡那霉素3022S万古霉素309R四环素3022S利福平511R 注:R 表示耐药，I 表示中度敏感，S 表示敏感。3 讨论鸡沙门菌病可通过多种途径进行传播，可水平传播，也可通过种蛋垂直传播，对养禽业危害较大9。为查明湟源县某蛋鸡场病鸡发病原因，本研究无菌采集病鸡脏器样品后，进行常规细菌分离培养。为达到快速、准确鉴定疑似菌目的，从脏器分离出疑似菌后，先进行了 16SrRNA 基因扩增和测序。测序结果与 GenBank 中公布的序列进行 Blast 比对分析后，发现分离菌与沙门氏菌同源性最高，为 99.34%。随后，对分离菌进行了革兰氏染色，并接种沙门氏菌微量生化鉴定管，革兰氏染色镜检和生化鉴定结果进一步确认分离菌为沙门氏菌。后期将对分离的此株沙门氏菌进行进一步血清学分型鉴定。为确定该分离菌为致病菌，接种 1 周龄 SPF 小鸡进行攻毒试验，攻毒后小鸡均发病死亡，并且从病死鸡脏器中分离出该菌，表明此菌为该鸡场此次疫情的病原。抗生素作为控制细菌病感染的一种有效手段，在临床上得到了广泛应用。但由于抗生素的不合理使用，导致了越来越多的细菌产生了耐药性，多重耐药的沙门氏菌也不断从鸡场分离出来10-12，一定程度上增加了细菌病防控难度。为指导合理用药，本研究评价了该株沙门氏菌的耐药性，选择 8 大类 18 种药物进行药敏试验，结果显示该菌株对阿莫西林、头孢唑啉、头孢噻肟、丁胺卡那、卡那霉素、四环素、多西环素、环丙沙星、氧氟沙星、蒽诺沙星、氯霉素、多（后转第 23 页）今日畜牧兽医23杂志,2021,33(4):444-450.16 秦 磊,王 建 红,高 静,等.2015 年 河 北 省 唐 山 市食品中金黄色葡萄球菌的检测结果分析 J.医学动物防制,2017,33(4):424-425,428.17Shen J,Wang Y,Schwarz S.Presence and dissemination of the multiresistance gene cfr in Gram-positive and Gram-negative bacteria J.Journal of Antimicrobial Chemotherapy,2013,68(8):1697-1706.18Hansen L H,Planellas M H,Long K S,et al.The order Bacillales hosts functional homologs of the worrisome cfr antibiotic resistance gene J.Antimicrobial Agents and Chemotherapy,2012,56(7):3563-3567.19Bozdogan B,Appelbaum P C.Oxazolidinones:activity,mode of action,and mechanism of resistance J.International Journal of Antimicrobial Agents,2004,23(2):113-119.20Bonilla H,Huband M D,Seidel J,et al.Multicity outbreak of 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