一株沙福芽胞杆菌ZG6的筛...对茶树轮斑病的生防潜力研究_刘姣姣.pdf

39(1)212-220 中国生物防治学报 Chinese Journal of Biological Control 2023 年 2 月 收稿日期：2022-07-22 基金项目：安徽省留学回国人员创新创业扶持计划项目（2020LCX004）作者简介：刘姣姣，硕士研究生，E-mail：；*通信作者，博士，教授，E-mail：。DOI:10.16409/ki.2095-039x.2023.02.008 一株沙福芽胞杆菌ZG6的筛选、鉴定及其对 茶树轮斑病的生防潜力研究 刘姣姣，严哲伟，张义菊，傅 敏，张立新（安徽农业大学植物保护学院/植物病虫害生物学与绿色防控安徽普通高校重点实验室，合肥 230036）摘要：轮斑病是茶树生产上的重要病害，造成茶叶产量和品质重大损失。为获得有效防治茶树轮斑病的生防菌株，从合肥茶园茶树根部组织中分离筛选到一株对茶树轮斑病菌具有较强拮抗活性的内生细菌 ZG6。对峙培养条件下，该菌株对茶树轮斑病菌的菌丝抑制率可达 65.38%。基于菌落形态、生理生化特征、16S rRNA 和 gyrB 基因的序列分析，将菌株 ZG6 鉴定为沙福芽胞杆菌 Bacillus safensis。菌株 ZG6 具有广谱抑菌能力，对油菜菌核病菌、玉米小斑病菌和苹果腐烂病菌表现出较强的抑制效果，抑制率分别为 78.82%、64.71%和 61.82%。酶学试验结果表明，菌株 ZG6 在代谢过程中可产生纤维素酶和蛋白酶。茶树离体枝条叶片防效试验结果表明，菌株 ZG6 的发酵液、无菌发酵滤液与菌液均对茶树轮斑病有预防和控制效果，在茶树离体枝条的叶片上的防效可达 69.9%以上。由此可见，沙福芽胞杆菌 ZG6 具有作为防治茶树轮斑病生防菌剂研发的潜力。关 键 词：茶树；内生细菌；轮斑病；生物防治 中图分类号：S476 文献标识码：A 文章编号：1005-9261(2023)01-0212-09 Screening and Identification of Bacillus safensis ZG6 and Its Biocontrol Potential against Gray Blight on Camellia sinensis LIU Jiaojiao,YAN Zhewei,ZHANG Yiju,FU Min,ZHANG Lixin(Key Laboratory of Biology and Sustainable Management of Plant Diseases and Pests of Anhui Higher Education Institutes/College of Plant Protection,Anhui Agricultural University,Hefei 230036,China)Abstract:Tea gray blight is a severe disease that occurred in tea plantings in China,causing significant losses to tea yield and quality.In order to obtain effective biocontrol strains against tea gray blight,an endophytic bacterium ZG6 with strong antagonistic activity against the pathogen Pseudopestalotiopsis sp.DSP-6 was isolated and screened from tea roots in Hefei.The strain ZG6 inhibited mycelial growth by dual culture assay,with an inhibition rate of 65.38%.Based on colony morphology,physiological and biochemical characteristics,partial nucleotide sequences of 16S rRNA and gyrB gene,strain ZG6 was identified as Bacillus safensis.The strain ZG6 had a broad-spectrum inhibition ability against Sclerotinia sclerotiorum,Bipolaris maydis,and Cytospora mandshurica,with inhibition rates of 78.82%,64.71%and 61.82%,respectively.The enzymatic test revealed that strain ZG6 produced cellulase and protease in the metabolic process.The fermentation broth,fermentation filtrate and suspension of strain ZG6 showed control efficacy over 69.9%against gray blight on the leaf of the tea detached branch.In summary,B.safensis ZG6 could be a potential biocontrol agent for the management of tea gray blight.Key words:tea plant;endophytic bacteria;gray blight;biological control 第 1 期 刘姣姣等：一株沙福芽胞杆菌 ZG6 的筛选、鉴定及其对茶树轮斑病的生防潜力研究 213 茶作为三大无酒精饮料之一，受到各国消费者的喜爱。由拟盘多毛孢引起的轮斑病是茶树生产上的一种重要叶部病害，在全世界茶叶种植区均有发生。该病害在我国茶区普遍发生，主要危害茶树的成叶和老叶，造成叶片脱落甚至使植株死亡，对茶叶产量和品质造成重大影响1,2。目前，茶树轮斑病的防治主要依靠化学药剂，但化学药剂的频繁使用造成了轮斑病菌抗药性的产生3。同时，化学药剂的过度使用还会造成农药残留，对食品安全和茶叶出口产生负面影响。生物防治因其对人畜无毒、对植物无副作用等优点受到了研究者们的关注。在茶树轮斑病生物防治研究方面，洪永聪等4发现一株枯草芽胞菌 TL2 能产生多种外分泌抗菌蛋白，它可抑制茶树轮斑病菌的菌丝生长及其分生孢子的形成和萌发。黄大野等5从茶树根际土壤分离得到一株贝莱斯芽胞杆菌 CY30，该菌株对茶拟盘多毛孢具有良好的抑菌活性。另外，从茶园土壤中分离得到的木霉菌、绿粘帚霉和荧光假单胞菌也被发现对茶树轮斑病具有显著田间防治效果6,7。当前，植物内生细菌已被广泛应用于农作物病害的防治8，从茶树茎、叶和根中分离出的内生细菌对茶炭疽病菌、梨黑斑病菌和西瓜枯萎病菌等植物病原菌均具有明显的抑制作用9-11。然而，近年来随着茶树种植面积的不断扩大，在高温高湿等气候的影响下，茶树轮斑病容易大面积发生12。为了保障茶树的绿色高效种植，迫切需要获得更多有应用前景的生防菌株。本研究从合肥两个茶园的主栽品种“舒茶早”中分离筛选到一株对茶树轮斑病菌有较强拮抗作用的内生细菌 ZG6。通过形态特征、生理生化测定和分子生物学鉴定，明确了菌株 ZG6 的分类地位；并对该菌株的拮抗谱、酶活特性以及其对茶树轮斑病的防效进行了研究，以期为茶树轮斑病的生物防治提供有效的生防菌株资源。1 材料与方法 1.1 试验材料 1.1.1 供试茶树样品 2021 年 38 月分别从安徽合肥茶园采集茶树（品种为“舒茶早”）健康组织样品，供茶树内生细菌分离。1.1.2 供试培养基 BPA 培养基13、NB 培养基14、PDA 培养基14、几丁质酶培养基15、脱脂牛奶琼脂培养基16和 CMC 培养基17。1.1.3 供试植物病原菌 茶树轮斑病菌 Pseudopestalotiopsis sp.DSP-6、甜瓜蔓枯病菌 Stagonosporopsis citrulli SC1-1、娃娃菜黑斑病菌 Alternaria brassicae、茶树炭疽病菌 Colletotrichum camelliae TYDY-2、玉米小斑病菌 Bipolaris maydis、油菜菌核病菌 Sclerotinia sclerotiorum、苹果腐烂病菌 Cytospora mandshurica、苹果轮纹病菌 Dothiorella gregaria、稻曲病菌 Ustilaginoidea virens 均由安徽农业大学植物病理系实验室保存。1.2 茶树内生细菌的分离和纯化 取茶树不同组织样品 1 g；经 70%（体积分数）酒精清洗后，采用 3%10%（质量分数）次氯酸钠浸泡处理 7 min，无菌水漂洗 4 次；晾干后放入研钵，加入 58 mL 的无菌水研磨，研磨成匀浆后静置 15 min作为母液，然后稀释 10、100、1000 倍；分别取 0.1 mL 稀释液涂抹于 BPA 平板上，每处理 3 次重复；28 黑暗培养 2436 h，观察统计每个培养皿菌落数。同时取 0.1 mL 无菌水冲洗液平板涂布，培养 2436 h（同上），观察有无菌落产生，以验证该消毒方法是否能杀死供试材料表面微生物11。根据分离平板上的菌落形态挑取单菌落，划线纯化后获得茶树内生细菌，保存备用。1.3 拮抗菌株的筛选 1.3.1 拮抗菌株的初筛 以茶树轮斑病菌为靶标菌进行拮抗内生细菌的筛选。将靶标菌菌饼（d=5 mm）接种于直径为 9 cm 的 PDA 平板中央，在菌饼四周 3 cm 处接种不同茶树内生细菌菌株，于 28 培养箱中倒置培养，培养 56 d 后，观察并记录抑菌效果。1.3.2 拮抗菌株复筛 以茶树轮斑病菌为靶标，对初筛得到的茶树内生细菌菌株进行复筛。将茶树轮斑病菌菌饼（d=5 mm）接种于直径为 9 cm 的 PDA 平板中央，在菌饼两边 3 cm 处接种相同菌株，以仅接种茶树轮斑病菌的平板为空白对照，观察抑菌效果并计算菌丝抑制率，选抑菌效果最佳的菌株作为候214 中 国 生 物 防 治 学 报 第 39 卷 选菌株进行后续试验。抑制率（%）（对照病原菌直径拮抗菌对峙的病原菌直径）/对照病原菌直径100 18。1.4 菌株 ZG6 的分类鉴定 1.4.1 菌株培养特征观察及生理生化测定 将菌株ZG6在BPA培养基上进行划线，置于28 培养12 d，观察其菌落颜色和形态，参照常见细菌系统鉴定手册中的方法对菌株 ZG6 进行革兰氏染色、运动性、柠檬酸盐利用、V-P 试验、淀粉水解、明胶液化、吲哚试验、碳源（果糖、麦芽糖、葡萄糖、乳糖、蔗糖和肌醇）的利用试验19。1.4.2 16S rRNA 和 gyrB 基因序列分析 采用 CTAB 法20提取菌株 ZG6 的基因组 DNA，以引物 27F（5-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3）和 1492R（5-GGTTACCTTGTTACGACTT-3）21扩增 16S rDNA片段；以引物 UP-1（5-GAAGTCATCATGACCGTTCTGCAYGCNGGNGGNAARTTYGA-3）和 UP-2r（5-A GCAGGGTACGGATGTGCGAGCCRTCNACRTCNGCRTCNGTCAT-3）22扩增 gyrB 基因，以测序引物UP-1s（5-GAAGTCATCATGACCGTTCTGCA-3）和 UP-2rs（5-AGCAGGGTACGGATGTGCGAGCC-3）对扩增的 gyrB 基因片段进行测序22。PCR 采用 25 L PCR 扩增体系：引物各 1.0 L、2Taq Master mix 12.5 L、DNA 模板 1.0 L、超纯水 9.5 L。PCR 扩增程序：94 预变性 5 min、94 变性 20 s、55 退火30 s、72 延伸 40 s，从变性到延伸 34 个循环，72 延伸 10 min，25 保温 5 min。PCR 产物经 1.0%琼脂糖电泳后，利用凝胶成像分析系统检测目的片段。1.4.3 扩增产物测序及序列分析 将16S rRNA和gyrB扩增产物委托南京擎科生物科技有限公司进行双向测序，待得到测序序列后，在 NCBI 进行 BLASTp（https:/blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=blastn&PAGE_TYPE=BlastSearch&LINK_LOC=blasthome）比对，进行同源性分析，同时下载参考菌株的gyrB 基因序列，采用 MEGA 7.0 软件以最大似然法构建系统发育树。1.5 菌株 ZG6 对其他植物病原菌拮抗谱的测定 分别以甜瓜蔓枯病菌、娃娃菜黑斑病菌、茶树炭疽病菌、玉米小斑病菌、油菜菌核病菌、苹果腐烂病菌、苹果轮纹病菌和稻曲病菌为靶标菌，按照 1.3.1 描述的方法与菌株 ZG6 进行对峙培养，观察并记录抑菌效果。1.6 菌株 ZG6 的酶活特性检测 1.6.1 蛋白酶检测 用无菌牙签在蛋白酶培养基平板中心位置接种菌株 ZG6，每个处理重复 3 次，28 培养 24 h 后观察有无消解圈。1.6.2 纤维素酶检测 用无菌牙签在纤维素酶培养基中心位置接种菌株 ZG6，每个处理重复 3 次，培养24 h 后，用 1%的刚果红染料染色 30 min，1 mol/L NaCl 溶液脱色 15 min，每个处理重复 3 次，观察有无消解圈。1.6.3 几丁质酶测定 用无菌牙签在几丁质酶培养基中心位置接种菌株 ZG6，每个处理重复 3 次，28 培养 3 d 后观察有无消解圈。1.7 菌株 ZG6 对茶树轮斑病防治效果 1.7.1 菌株 ZG6 发酵液、无菌发酵液和菌液的制备 于固体 BPA 平板上活化菌株 ZG6，用接种环挑取单菌落于 20 mL 液体 NB 培养基中，在 28、180 r/min 的摇床中振荡培养 24 h 获得种子液。按照 1%的接种量将种子液转接至装有 100 mL 液体 NB 培养基的三角瓶中，在 28、180 r/min 的摇床中振荡培养 72 h后获得菌株 ZG6 发酵液。将发酵液 10000 r/min 离心 20 min 后获取上清液，用 0.22 m 滤膜过滤，即获得无菌发酵液。将发酵液 10000 r/min 离心 20 min 后，弃上清液，用无菌水将沉淀重悬浮，即得菌株 ZG6菌液。1.7.2 评估茶树内生细菌ZG6对轮斑病的治疗效果 吸取20 L茶树轮斑病菌分生孢子悬浮液（107孢子/mL），滴加至茶树离体枝条的叶片伤口处（昆虫针针刺 3 针）。接种 24 h 后，将新鲜培养 24 h 的菌株 ZG6 的发酵液、菌液和无菌发酵液分别滴加在茶树叶片的伤口处，每处滴加 20 L；随后将茶树离体枝条置于盛有无菌水的三角瓶中，于人工气候箱 25 下光暗交替培养。对照分别使用无菌水、NB 培养基和37%苯醚甲环唑（河北中保绿农作物科技有限公司）4000 倍液进行处理。14 d 后统计各处理和对照的第 1 期 刘姣姣等：一株沙福芽胞杆菌 ZG6 的筛选、鉴定及其对茶树轮斑病的生防潜力研究 215 病斑直径，并计算防效。每个处理设 3 个重复。防效（%）=（对照病斑直径处理病斑直径）/对照病斑直径100 1。1.7.3 评估茶树内生细菌 ZG6 对轮斑病的预防效果 将新鲜培养 24 h 的菌株 ZG6 的发酵液、菌液和无菌发酵液分别滴加在茶树离体枝条叶片的伤口处，每处滴加 20 L；经过 24 h 处理后，吸取 20 L 茶树轮斑病菌分生孢子悬浮液，滴加在相应的茶树叶片伤口处；然后将茶树离体枝条置于人工气候箱 25 光暗交替培养。对照使用无菌水、NB 培养基和 37%苯醚甲环唑 4000 倍液处理。菌株防效的统计方法同1.7.2。2 结果与分析 2.1 拮抗内生细菌的筛选 从茶树“舒茶早”中共分离获得 180 株内生细菌。以茶树轮斑病菌菌株 DSP-6 为靶标菌，通过平板对峙法对分离获得的内生细菌进行初步筛选，确定有 6 株细菌对茶树轮斑病菌具有良好抑菌效果。复筛结果显示，菌株 ZG6 对茶树轮斑病菌的菌丝生长表现出显著的抑菌效果，抑制率达 65.38%（图 1）。a：PDA 平板上培养茶树轮斑病菌（培养第 6 d）PDA plates inoculated only with Pseudopestalotiopsis sp.DSP-6(6 days-old culture)；b：菌株 ZG6 和病原菌对峙培养（培养第 6 d）Dual culture of strain ZG6 and Pseudopestalotiopsis sp.DSP-6 on PDA plate(6 days-old culture)图 1 菌株 ZG6 对茶树轮斑病菌 DSP-6 的拮抗效果 Fig.1 Antagonistic activity of strain ZG6 against Pseudopestalotiopsis sp.DSP-6 2.2 菌株 ZG6 的分类鉴定 2.2.1 菌株形态及生理生化特征 菌株 ZG6 在 BPA 培养基上生长良好，单菌落呈圆形、淡黄色，边缘呈波浪状，表面粗糙，中央无凸起。菌株 ZG6 革兰氏染色阳性，具有运动性，能利用柠檬酸盐，V-P 试验呈阴性，具备水解明胶和淀粉的能力，吲哚试验显阴性，明胶液化还原呈阳性，能够利用果糖、麦芽糖、葡萄糖、乳糖、蔗糖、肌醇和甘露醇作为单一碳源（表 1）。表 1 菌株 ZG6 的生理生化特征试验 Table 1 Physiological and biochemical characteristics of strain ZG6 测定项目 Item tested 结果 Result 测定项目 Item tested 结果 Result 革兰氏染色 Gram staining 葡萄糖 Glucose 运动性 Motility 麦芽糖 Maltose 柠檬酸盐 Citrate solution 蔗糖 Sucrose V-P 试验 Acetyl methanol test 果糖 fructose 淀粉水解 Starch hydrolysis 乳糖 Lactose 吲哚试验 Indole 甘露醇 Mannitol 明胶液化还原 Gelatin liquefaction 肌醇 Inositol 注：“”表示该实验结果为阳性；“”表示该实验结果为阴性。Note:“”indicated that the result of the experiment was positive;“”indicated that the result of the experiment was negative.216 中 国 生 物 防 治 学 报 第 39 卷 2.2.2 菌株 ZG6 的 16S rRNA 和 gyrB 基因序列分析 以菌株 ZG6 的基因组为模板，对其 16S rRNA 和 gyrB基因片段进行扩增。通过测序确定该菌株 16S rRNA 序列长度为 1425 bp（GenBank 登录号：OM049200），gyrB 基因序列长度为 1164 bp（GenBank 登录号：OM066929）。通过在 NCBI BLAST 数据库中比对，发现菌株 ZG6 的 16S rRNA 与 gyrB 序列，与沙福芽胞杆菌 B.safensis 参考菌株序列同源性均达到 99%以上。进一步选取与其同源性较高的参考菌株序列进行聚类分析，发现菌株 ZG6 以 86%的自举支持率与沙福芽胞杆菌紧密的聚成一簇（图 2）。综合形态学、生理生化特征和分子生物学鉴定结果，最终将菌株 ZG6 鉴定为沙福芽胞杆菌。Bacillus aerophilus MCCC1A08371(JX680218)B.aerophilus MCCC1A08369(JX680214)B.altitudinis PG-5(MN893287)B.altitudinis MCCC1A01287(JX680195)B.pumilus HM-7(MF579611)B.pumilus ATCC7061(KF194263)B.safensis subsp.osmophilus BC09(MF140243)ZG6B.safensis Bs33 B.safensis FO-033(AY167868)B.safensis subsp.safensis FO-36b(ASJD01000009)B.australimaris MCCC1A05787(JX680175)B.australimaris NH7I 1(NZLGYN01000023)B.licheniformis BCRC15413(DQ309325)B.licheniformis BCRC11702(DQ309295)B.atrophaeus BCRC17530(DQ309302)B.atrophaeus BCRC17123(DQ309296)B.subtilis BAB-1(JQ916082)B.subtilis BCRC10058 B.velezensis BCRC17467B.velezensis LBUM288(MG491879)B.amyloliquefaciens BCRC17038(DQ309305)B.amyloliquefaciens BCRC11601(DQ309294)B.megaterium DSM319(CP001982)B.megaterium ACCC10245(EU711066)Pseudomonas fluorescens 2-79(FJ652714)1001001001009599987789598895669499989999989956860.10 图 2 基于 gyrB 基因序列构建的系统发育树 Fig.2 Phylogenetic tree of strain ZG6 based on gyrB sequences 2.3 菌株 ZG6 的拮抗谱 菌株 ZG6 除了对茶树轮斑病菌具有良好的拮抗活性外，对供试的 8 种植物病原真菌也有不同程度的拮抗活性。其中，对玉米小斑病菌、油菜菌核病菌和苹果轮纹病菌的拮抗活性较强，抑制率分别为 61.82%、78.82%和 64.71%（图 3）。2.4 菌株 ZG6 酶活特性检测 菌株 ZG6 在 CMC 培养基培养 2 d 后，经过染色、脱色，形成黄色透明圈；在蛋白酶培养基培养 2 d后即产生明显的透明圈；而在几丁质酶培养基中培养 6 d 未产生透明圈（图 4）。这说明菌株 ZG6 能产生纤维素酶和蛋白酶类生物大分子，但不能产生几丁质酶。2.5 菌株 ZG6 对茶树轮斑病防治效果 茶树叶片接种 14 d 后，只接种茶树轮斑病菌的叶片病斑明显，病斑连接成较大的坏死斑块，病斑直径为 0.55 cm；经预防和治疗处理后的离体枝条上的叶片病斑较小，且均未连接成大病斑，病斑直径为 0.1 第 1 期 刘姣姣等：一株沙福芽胞杆菌 ZG6 的筛选、鉴定及其对茶树轮斑病的生防潜力研究 217 12345678处理CK处理CK 1：茶树炭疽病菌Co.camelliae；2：甜瓜枯萎病菌St.citrulli；3：娃娃菜黑斑病菌 A.brassicae；4：玉米小斑病菌B.maydis；5：油菜菌核病菌S.sclerotiorum；6：苹果腐烂病菌 C.mandshurica；7：苹果轮纹病菌 D.gregaria；8：稻曲病菌 U.virens 图 3 菌株 ZG6 的拮抗谱 Fig.3 Antagonistic spectrum of strain ZG6 a：纤维素酶 Cellulase；b：蛋白酶 Protease；c：几丁质酶 Chitinase 图 4 菌株 ZG6 酶活性测定 Fig.4 Enzyme activity of strain ZG6 0.17 cm（表 2、图 5）。其中，菌株 ZG6 的发酵液和菌液的治疗效果分别为 81.8%和 80.0%，略高于 37%苯醚甲环唑的治疗效果（防效为 76.4%）；菌株 ZG6 的发酵液对茶树轮斑病的预防效果为 81.8%，与 37%苯醚甲环唑效果相当，其防效显著高于无菌发酵滤液和菌液的预防效果（表 2、图 5）。3 讨论 茶树内生菌长期与茶树共同生活、协同进化，可促进宿主植物生长、提高宿主植物抗逆能力23。本研 218 中 国 生 物 防 治 学 报 第 39 卷 表 2 菌株 ZG6 对茶树轮斑病的防治效果 Table 2 The control effect of strain ZG6 against tea gray blight 处理 Treatment 病斑直径 Lesion diameter(cm)防效 Control effect(%)对照 CK 0.550.09 发酵液Fermentation broth 0.100.00 81.80.00 a 预防 Preventive 无菌发酵滤液Fermentation filtrate 0.140.08 74.50.14 bc 菌液Bacterial suspension of strain ZG6 0.170.10 69.10.18 c 37%苯醚甲环唑37%Diphenyl 0.100.08 81.80.00 a 发酵液Fermentation broth 0.100.00 81.80.00 a 治疗Therapeutic 无菌发酵滤液Fermentation filtrate 0.120.03 78.20.05 ab 菌液Bacterial suspension of strain ZG6 0.110.04 80.00.07 ab 37%苯醚甲环唑37%Diphenyl 0.130.08 76.40.14 ab 注：数据以平均值标准差表示，同列数据后不同小写字母表示差异显著（P0.05）。Note:Data were presented as meanSE,data with the different lowercase letters in same column indicated significantly different(P0.05).cbadehgfi a：对照 CK；b：菌株 ZG6 发酵液对茶树轮斑病的预防效果 Preventive effect of fermentation broth of strain ZG6 against tea gray blight；c：菌株 ZG6 无菌发酵滤液对茶树轮斑病的预防效果 Preventive effect of fermentation filtrate of strain ZG6 against tea gray blight；d：菌株 ZG6 菌液对茶树轮斑病的预防效果 Preventive effect of bacterial suspension of strain ZG6 against tea gray blight；e：37%苯醚甲环唑对茶树轮斑病的预防效果 Preventive effect of 37%diphenyl against tea gray blight；f：菌株 ZG6 发酵液对茶树轮斑病的治疗效果 Therapeutic effect of fermentation broth of strain ZG6 against tea gray blight；g：菌株 ZG6 无菌发酵滤液对茶树轮斑病的治疗效果 Therapeutic effect of fermentation filtrate of strain ZG6 against tea gray blight；h：菌株 ZG6 菌液对茶树轮斑病的治疗效果 Therapeutic effect of bacterial suspension of strain ZG6 against tea gray blight；i：37%苯醚甲环唑对茶树轮斑病的治疗效果Therapeutic effect of 37%diphenyl against tea gray blight 图 5 菌株 ZG6 对茶树轮斑病的防治效果 Fig.5 The control effect of strain ZG6 against tea gray blight 第 1 期 刘姣姣等：一株沙福芽胞杆菌 ZG6 的筛选、鉴定及其对茶树轮斑病的生防潜力研究 219 究从安徽省合肥市茶园健康茶树根系中分离获得一株对茶树轮斑病菌具有良好拮抗作用的茶树内生细菌ZG6。通过形态学、生理生化特征及分子生物学将该菌株鉴定为沙福芽胞杆菌。近些年，沙福芽胞杆菌在防治多种植物病害方面受到广泛的关注。如从木樨内生菌中分离筛选到一株具有生防潜力的沙福芽胞杆菌菌株 B21，其产生的环脂肽家族抗菌物质通过改变菌丝膜的通透性显著抑制稻瘟病菌的菌丝生长24。此外，从烟草根际土壤中筛选到的沙福芽胞杆菌 YJC-4 对烟草黑胫病菌菌丝抑制率为 72.99%，对烟草黑胫病的田间平均防治效果达到 80.06%25；张知晓等26研究发现沙福芽胞杆菌对核桃多种病原菌均具有抑制作用，其中对间座壳属病原菌的抑制率最高，达到 82.9%。近年来，茶树轮斑病发生严重，值得我们关注的是，前人分别从茶树叶片和土壤中分离到的枯草芽胞菌 TL2 4和贝莱斯芽胞杆菌CY305对茶树轮斑病菌具有良好的抑制效果。本研究发现内生的沙福芽胞杆菌菌株 ZG6 对茶树轮斑病菌也表现出很好的抑制作用。此外，其在离体茶树枝条叶片上对茶树轮斑病的防治也表现出较好的生防效果（防效高达 81.8%），与贝莱斯芽胞杆菌 CY30 防治茶树轮斑病的效果相当，比枯草芽胞菌 TL2 防治茶树轮斑病的效果略好。由于沙福芽胞杆菌 ZG6 为来自茶树根内的内生细菌，可以在茶树体内定殖，能够与茶树和谐共生。同时研究发现该菌株对油菜菌核病菌也表现出较强的拮抗活性，抑制率高达 78.82%，推测该菌株在茶树轮斑病菌和核盘菌的防治中具有被开发利用的潜力。沙福芽胞杆菌的无菌发酵滤液具有热稳定性和 pH 稳定性，能够使病原真菌菌丝畸变并抑制病原真菌孢子的萌发24,26。有研究报道沙福芽胞杆菌可以通过分泌初级代谢产物和次级代谢产物来抑制植物病原真菌活性，包括蛋白酶27、几丁质酶28,29和细菌素等30,31。本研究发现菌株 ZG6 可以分泌纤维素酶和蛋白酶。另外，沙福芽胞杆菌不仅具有生防作用，在促进植物生长、生产工业酶、微生物降解与修复、益生菌的利用以及次生代谢物的生产方面都存在较好的应用价值32。本试验发现菌株 ZG6 在植物病害防治方面具有较大潜力，对于该菌株的其他生物学功能仍有待进一步研究探讨。本研究结果表明，茶树内生细菌沙福芽胞杆菌 ZG6 在防治拟盘多毛孢菌引起的茶树轮斑病的应用中具有广阔的前景。下一步研究将围绕菌株 ZG6 抑菌机理和发酵工艺进行深入研究，为后续揭示该菌株的生防机制和生防产品研发及应用提供理论依据。参 考 文 献 1 Tsai I,Maharachchikumbura S S N,Hyde K D,et al.Molecular phylogeny,morphology and pathogenicity of Pseudopestalotiopsis species on Ixora in TaiwanJ.Mycological Progress,2018,(1):1-12.2 黄大野,万中义,朱志刚,等.诺沃霉素 A 对茶轮斑病的防治效果J.植物保护,2019,45(2):243-246.3 黄大野,朱志刚,姚经武,等.茶轮斑病防治研究进展J.湖北农业科学,2018,57(S2):6-7,10.4 洪永聪,来玉宾,叶雯娜,等.枯草芽孢菌株 TL2 对茶轮斑病的防病机制J.茶叶科学,2006(4):259-264.5 黄大野,杨丹,姚经武,等.贝莱斯芽孢杆菌 CY30 防治茶轮斑病研究J.中国植保导刊,2020,40(11):14-19.6 卢声洁,赵兴丽,罗林丽,等.拮抗茶轮斑病菌生防木霉菌的筛选、鉴定与应用J.贵州农业科学,2021,49(3):44-49.7 Sanjay R,Ponmurugan P,Baby U I.Evaluation of fungicides and biocontrol agents against grey blight disease of tea in the fieldJ.Crop 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