己酮可可碱对叔丁基过氧化氢...静脉内皮细胞损伤的保护作用_刘萌萌.pdf

DOI:10.13276/j.issn.2097-1656.2023.03.004军事预防医学专题己酮可可碱对叔丁基过氧化氢诱导的人脐静脉内皮细胞损伤的保护作用刘萌萌1，2，赵晨茜2，郭鹏1，刘江正2，孔德钦2，任晓婷2，刘瑞2，海春旭2，张晓迪2(1武警后勤学院卫生勤务系，天津 300309;2空军军医大学军事预防医学系军事毒理学与防化医学教研室，陕西省自由基生物学与医学重点实验室，特殊作业环境危害评估与防治教育部重点实验室，陕西 西安 710032)基金项目:国家自然科学基金(32100996);军事医学创新工程专项(16CXZ021);武警后勤学院基础研究项目(WHJ202015)作者简介:刘萌萌，硕士，讲师，从事自由基毒理学研究，Tel:[phone]，E-mail:通信作者:张晓迪，Tel:[phone]，E-mail:zhangxiaodi 网络首发:https:/ 目的探讨己酮可可碱(PTX)对叔丁基过氧化氢(t-BHP)诱导的人脐静脉内皮细胞(HUVECs)氧化应激和线粒体功能的影响。方法利用 t-BHP 诱导建立 HUVECs 损伤模型，PTX 预处理筛选合适的干预剂量;Mito Tracker Green、Mito SOX 和 ho 123 探针分别检测线粒体质量、活性氧(OS)和膜电位的改变;设置对照组、t-BHP 组、PTX 预处理组和单纯 PTX 组，对照组细胞不做处理，t-BHP 组细胞用105 mol/L t-BHP 处理，单纯 PTX 组用 1 mg/L PTX 处理，PTX 预处理组用 105 mol/L t-BHP 和 1 mg/L PTX 共同处理。采用 MTT 法检测细胞的活力;试剂盒检测乳酸脱氢酶(LDH)、丙二醛(MDA)、氧化型谷胱甘肽(GSSG)、还原型谷胱甘肽(GSH)和三磷酸腺苷(ATP)的含量以及超氧化物歧化酶(SOD)的活力;Western blotting 法检测细胞中 SOD1、SOD2 和核转录因子相关因子 2(Nrf-2)蛋白表达水平;定磷法检测 HUVECs 细胞 Na+，K+-ATPase 和 Ca2+，Mg2+-ATPase 的活力。结果霍恩氏法计算并测得 HUVECs 在 t-BHP 暴露 6 h 的半数致死量为 105 mol/L;PTX预处理 12 h、浓度大于 1 mg/L 即可升高 HUVECs 细胞活力(P 0.05);与对照组相比，t-BHP 处理后，MitoTracker Green 和 ho 123 绿色荧光强度下降，Mito SOX 红色荧光强度升高;与 t-BHP 组相比，PTX 预处理组能提高 HUVECs 细胞活力，降低细胞培养上清中 LDH、MDA 和 GSSG 水平，细胞中 SOD 活力以及 Nrf-2 蛋白表达水平(P 0.05)，升高 HUVECs 培养上清中 GSH 水平和 GSH/GSSG 比值、细胞中 SOD1 蛋白表达水平、ATP 水平以及Na+，K+-ATPase和 Ca2+，Mg2+-ATPase 活力(P 0.05)。结论PTX 对 t-BHP 诱导的 HUVECs 氧化应激和线粒体损伤有保护作用。关键词 叔丁基过氧化氢;氧化应激;己酮可可碱;线粒体 中图分类号 285 文献标志码 AProtective effect of pentoxifylline on human umbilical vein endothelial cell injury induced bytert-butyl hydroperoxideLIU Mengmeng1，2，ZHAO Chenqian2，GUO Peng1，LIU Jiangzheng2，KONG Deqin2，EN Xiaoting2，LIU ui2，HAI Chunxu2，ZHANG Xiaodi21Department of Health Service，Logistics University of Peoples Armed Police Force，Tianjin 300309，China;2Department ofMilitary Toxicology and Chemical Defense Medicine，Shaanxi Provincial Key Laboratory of Free adical Biology andMedicine，Ministry of Education Key Laboratory of Hazard Assessment and Control in Special Operational Environment，School of Military Preventive Medicine，Air Force Medical University，Xian 710032，China Abstract ObjectiveTo investigate the protective effect of pentoxifylline(PTX)on oxidative stress and mitochondrialfunction in human umbilical vein endothelial cells(HUVECs)induced by tert-butyl hydroperoxide(t-BHP)Methodst-BHP was used to induce HUVECs injury model，and PTX was pretreated to screen suitable intervention dose.The changesof mitochondrial mass，mitochondrial reactive oxygen species(OS)，and mitochondrial membrane potential were detected012http:J Air Force Med UnivVol.44 No.32023by Mito Tracker Green，Mito SOX，and ho 123 probes，respectively.Then the cells were divided into control group，t-BHP group，PTX pretreatment group and simple PTX group.The control group did not receive any treatment，t-BHP groupwas treated with 105 mol/L t-BHP，simple PTX group with 1 mg/L PTX，and PTX pretreatment group with 105 mol/Lt-BHP and 1 mg/L PTX MTT assay was used to detect cell viability.The levels of lactic dehydrogenase(LDH)，malondialdehyde(MDA)，oxidized glutathione(GSSG)，reduced glutathione(GSH)，adenosine triphosphate(ATP)andthe activity of superoxide dismutase(SOD)were detected by test kits.Western blotting was used to detect the expressionlevels of SOD1，SOD2 and nuclear factor erythroid 2-related factor 2(Nrf-2)The activities of Na+，K+-ATPase andCa2+，Mg2+-ATPase were determined by phosphate method.esultsHorns method calculated and measured the medianlethal dose of HUVECs exposed to t-BHP for 6 h was 105 mol/L.When PTX was pretreated for 12 h and the concentrationwas more than 1 mg/L，the cell viability of HUVECs was increased(P 0.05)Compared with the control group，thegreen fluorescence intensity of Mito Tracker Green and ho 123 decreased，while the red fluorescence intensity of Mito SOXincreased after t-BHP treatment.Compared with t-BHP group，PTX pretreatment group increased cell viability，decreasedthe levels of LDH，MDA and GSSG in cell culture supernatant，SOD activity and Nrf-2 protein expression in HUVECs(P 0.05)，and increased levels of GSH，GSH/GSSG ratio，SOD1 protein expression，ATP，and the activities of Na+，K+-ATPase and Ca2+，Mg2+-ATPase(P 0.05)ConclusionPTX can protect HUVECs from t-BHP-induced oxidativestress and mitochondrial damage.Key words tert-butyl hydroperoxide;oxidative stress;pentoxifylline;mitochondria血管内皮细胞(vascular endothelial cells，VECs)是覆盖于血管内壁上高度活跃的单层扁平或多角形细胞，广泛地分布在体内，对维持机体正常的生理功能发挥重要作用。VECs 损伤或功能紊乱，可导致高血压、冠心病和糖尿病等多种疾病的发生1。活性氧(reactive oxygen species，OS)过度产生所诱导的血管内皮损伤可能是各类心血管疾病共同的病理基础2，过量生成的 OS 导致细胞内脂质过氧化物堆积、蛋白质损伤、氧化 DNA 和酶，最终导致细胞功能受损3。作为 OS 主要产生部位和攻击的主要细胞器，线粒体是维持细胞功能的重要细胞器，与细胞增殖、衰老、凋亡等基本生命活动密切相关4。己酮可可碱(pentoxifylline，PTX)是一种甲基黄嘌呤的衍生物，可改善血液循环，增加器官氧供。研究表明，PTX 具有降低新型冠状病毒肺炎患者血清乳酸脱氢酶(lactic dehydrogenase，LDH)活力和升高淋巴细胞数量的作用5。本实验通过叔丁基过氧化氢(tert-butylhydroperoxide，t-BHP)处理制备氧化应激损伤的人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVECs)模型，探讨 PTX 对 HUVECs 氧化损伤和线粒体的保护作用。1材料与方法1.1材料HUVECs 来自空军军医大学病理学与病理生理学教研室;t-BHP、-actin 鼠多克隆抗体和 PTX 购自美国Sigma 公司;超氧化物歧化酶1(superoxide dismutase 1，SOD1)兔多克隆抗体为美国 Abcam 公司产品;SOD2兔多克隆抗体购自武汉华美生物工程有限公司;核转录因 子 相 关因 子 2(nuclear factor erythroid 2-relatedfactor 2，Nrf-2)兔 多 克 隆抗体购自美国 ProteintechGroup 公司;二辛可宁酸(bicinchoninic acid，BCA)蛋白定量试剂盒购自美国 Pierce 公司;Mito SOX 和 MitoTracker Green 染料购自美国 Invitrogen 公司;线粒体膜电位检测试剂盒和三磷酸腺苷(adenosine triphosphate，ATP)检测试剂盒为碧云天生物技术研究所产品;LDH 试剂盒、超微量 ATPase、丙二醛(malondialdehyde，MDA)、还原型谷胱甘肽(reduced glutathione，GSH)、氧化型谷胱甘肽(oxidized glutathione，GSSG)和 SOD测定试剂盒均为南京建成科技有限公司产品;激光共聚焦显微镜为奥林巴斯公司产品。1.2方法1.2.1细胞培养将 HUVECs 接种于 100 mL/L 胎牛血清，PMI 1640 培养液中，在 37 、50 mL/L CO2以及饱和湿度培养箱中贴壁培养。1.2.2细胞活力测定对数生长期 HUVECs，以每孔5 103个细胞接种到96 孔板中，每组3 个副孔。培养12 h 后，用 0、50、100、150、200、400、800 mol/L的 t-BHP 处理 0、1、3、6、12、24 h 后，弃上清，每孔加入200 L MTT(0.5 g/L)，37 恒温箱孵育4 h，弃上清后每孔加入 200 L DMSO，震荡 10 min，用酶标仪检测 A490 nm值，用以确定 t-BHP 诱导 HUVECs 损伤的半数致死浓度。以上述实验结果作为实验条件，112空军军医大学学报2023 年 3 月第 44 卷第 3 期http:用 1、2、5、10 mg/L PTX 预处理 HUVECs 12 h，检测PTX 的保护作用。1.2.3细胞线粒体质量、膜电位以及 OS 的测定调整细胞密度为 5 104个/mL 后，接种于共聚焦培养皿中，待细胞贴壁后，分为对照组(不做任何处理)和 t-BHP 组(105 mol/L t-BHP 处理6 h)。弃药液分别加入500 nmol/L Mito Tracker Green、25 mol/L ho 和5 mol/L Mito SOX 染料，于 37 条件下孵育 30 min，弃上清，用磷酸盐缓冲液(phosphate buffer saline，PBS)小心清洗 3 次，共聚焦显微镜 600 倍下拍照。1.2.4LDH 活力、氧化应激指标、ATP 含量以及ATPase 活力测定将 HUVECs(1 105个细胞/孔)接种于 6 孔细胞培养板中，分为对照组(不做任何处理)、t-BHP 组(105 mol/L t-BHP 处理 6 h)、PTX 预处理组(1 mg/L PTX 预处理作用 12 h 后，用 105 mol/Lt-BHP处理 6 h)、单纯 PTX 组(1 mg/L PTX 预处理作用 12 h)，收集培养上清和细胞。严格按照试剂盒说明书分别检测各组 MDA、GSH 和 GSSG 含量以及LDH、SOD、Na+，K+-ATPase 和 Ca2+，Mg2+-ATPase的活力。1.2.5细胞中 SOD1、SOD2 和 Nrf-2 蛋白表达水平的检测分组后分别处理细胞，弃上清，预冷 PBS 洗3 次，每次5 min。加入100 L 预冷细胞裂解液，4 冰浴 30 min，20 000 g 4 离心 20 min，取上清，BCA法进行蛋白定量，其余加入 DTT 和等体积 2 上样缓冲液，煮沸 10 min，分装保存于 20 冰箱中。样品经过电泳、常规转模、封闭、孵育抗体、清洗、ECL化学发光后，使用 Quantity One 灰度分析软件对蛋白表达进行半定量分析。1.2.6统计学分析采用 SPSS 13.0 软件对实验结果进行统计学分析，实验结果用 x s 表示，组间比较使用单因素方差分析，组间两两比较采用 Tukey 检验。检验水准为 0.05。2结果2.1t-BHP 对 HUVECs 细胞活力的影响MTT 法检测 t-BHP 不同剂量(0、50、100、150、200、400、800 mol/L)和不同作用时间(0、1、3、6、12、24 h)处理对 HUVECs 细胞活力的影响(表 1)。结 果 发 现，与 0 mol/L t-BHP 相 比，50 mol/L t-BHP 处理不会影响细胞活力;t-BHP 处理时间为 6 h，浓度为 100 800 mol/L，随处理浓度增加，细胞活力成比例下降(P 0.05)，呈现出明显的剂量效应关系。霍恩氏法检测并计算 t-BHP 作用 6 h的半数致死浓度为 105 mol/L，并用此浓度进行后续实验。表 1t-BHP 对 HUVECs 细胞毒性作用的检测(n=3，x s)t-BHP 浓度/(molL1)作用时间/h136122401.00 0.041.00 0.021.02 0.051.00 0.021.00 0.04501.21 0.110.95 0.050.99 0.120.98 0.011.02 0.061001.10 0.050.96 0.040.61 0.12a0.30 0.10a0.29 0.07a1501.11 0.101.02 0.070.27 0.06a0.23 0.02a0.24 0.01a2001.13 0.170.98 0.030.25 0.06a0.24 0.01a0.24 0.04a4001.22 0.170.79 0.11a0.24 0.06a0.24 0.01a0.26 0.04a8001.07 0.140.49 0.05a0.25 0.06a0.25 0.02a0.24 0.03aaP 0.05 vs 0 molL1t-BHP。2.2PTX 对 t-BHP 损伤的 HUVECs 保护作用MTT 法检测不同浓度 PTX 预处理 12 h 对 HUVECs的保护作用(图 1A)。研究结果显示，与 t-BHP 组相比，不同浓度的 PTX 均可提高细胞活力，差异有统计学意义(P 0.05)。随后选取 1 mg/L PTX 进行干预(图 1B)，检测 HUVECs 细胞培养上清中 LDH 的活力，发现 PTX 可降低因 t-BHP 处理引起的 LDH 活力升高(P 0.05)。2.3t-BHP 致 HUVECs 线粒体变化Mito Tracker Green 可不依赖于线粒体膜电位定位于活细胞线粒体上，荧光强度反映了线粒体质量;Mito SOX 具有线粒体膜结合基团，可定位于线粒体212http:J Air Force Med UnivVol.44 No.32023上，反映线粒体内 OS 的生成;ho 123 可穿透细胞膜，是线粒体跨膜电位的指示剂，荧光强度反映了线粒体 膜 电 位的变化。与对照组相 比，Mito TrackerGreen 和 ho 123 绿色荧光强度显著下降，同时发现Mito SOX 红色荧光强度显著上升(图 2)。说明 t-BHP处理后引起线粒体膜电位和线粒体质量下降以及线粒体 OS 上升。A:细胞活力的变化;B:细胞培养上清中 LDH 活力的变化。aP 0.05。图1PTX 抑制 t-BHP 引起的细胞活力的降低和 LDH 的释放图 2t-BHP 引起 HUVECs 细胞线粒体变化(600)2.4PTX 对 HUVECs 培养上清和细胞内氧化应激指标的干预作用PTX 对 HUVECs 氧化损伤的干预作用结果显示，与对照组相比，t-BHP 可显著升高细胞培养上清中MDA、GSSG 含量以及细胞中 SOD 活力，降低细胞培养上清中 GSH 含量和 GSH/GSSG 比值(P 0.05，图 3)，PTX 干预可有效逆转这一趋势。图 3PTX 对 t-BHP 诱导 HUVECs 细胞氧化损伤的干预作用(aP 0.05)2.5PTX 对 HUVECs 氧化应激相关蛋白的干预作用Western blotting 法检测 HUVECs 氧化应激相关蛋白(图 4)。与对照组相比，t-BHP 处理 6 h 可显著降低 SOD1 蛋白表达水平，升高 Nrf-2 蛋白表达水平。与t-BHP 处理组相比，PTX 可升高 SOD1、降低 Nrf-2 蛋白表达水平(P 0.05)。A:HUVECs 中 SOD1、SOD2 以及 Nrf-2 蛋白表达;B:SOD1、SOD2 以及 Nrf-2 蛋白相对表达水平的柱形图。aP 0.05。图 4PTX 对 HUVECs 中 SOD1、SOD2 和 Nrf-2 蛋白表达的影响312空军军医大学学报2023 年 3 月第 44 卷第 3 期http:2.6PTX 对 HUVECs 细胞 ATP 以及 ATPase 活力的干预作用ATP 是重要能量分子，Na+，K+-ATPase 和 Ca2+，Mg2+-ATPase 是 ATP 依赖的 ATPase，主要存在于细胞膜上，ATP 和 ATPase 在细胞生理和病理过程中起着重要作用6 7。结果表明，t-BHP 暴露 6 h 后，细胞 ATP含量、Na+，K+-ATPase 和 Ca2+，Mg2+-ATPase 活力降低(P 0.05)，PTX 干预可显著升高的 ATP 含量和ATPase 活性(P 0.05，图 5)。A:HUVECs 中 ATP 含量;B:HUVECs 中 Na+，K+-ATPase 活力;C:HUVECs 中Ca2+，Mg2+-ATPase 活力。aP 0.05。图 5PTX 对 HUVECs ATP 和 ATPase 活力的干预作用3讨论VECs 锚定在基底层、覆盖于整个血管系统的内表面，是一种选择性通透的保护膜，新陈代谢活跃，参与多种与血管有关的生理和病理过程，对维持血管内稳态起重要的调节作用。氧化应激由机体内自由基的生成与降解失调、氧化物与抗氧化物动态平衡紊乱产生。过度产生的 OS 可以氧化 DNA、蛋白质、脂质等生物大分子，产生一系列级联反应，影响细胞功能。氧化应激除了与高血压、动脉粥样硬化、冠心病等心血管疾病的发生、发展有密切关系8，还是沙林、梭曼、塔崩、VX、光气及氯气等化学毒剂损伤的发病机制之一9 11。t-BHP 是一种有机过氧化物，性质比过氧化氢稳定，可用于制备不同类型细胞的氧化损伤模型12。研究表明，这种有机过氧化物已被认为是内皮细胞中促进细胞坏死的氧化介质。不同浓度和不同作用时间的 t-BHP 被广泛应用于细胞毒性研究中13 15。本研究结果显示，t-BHP 在 50 200 mol/L浓度范围内处理6 h，HUVECs 细胞活力在0.27 0.99之间，且具有一定的剂量依赖性，半数致死浓度为105 mol/L，造模条件稳定，因此确定此条件进行后续实验研究。PTX 具有抗炎、抗纤维化、改善血液流动和外周组织氧合等多种药理学作用，多用于改善微循环和治疗血管性疾病。以往实验多聚焦于 PTX 的抗炎功能16 17，本课题组先前研究表明，PTX 可降低氯气损伤后大鼠肺组织氧化应激水平，提示 PTX 在动物体内具有较好的抗氧化作用10。本研究进一步在体外建立氧化应激模型，明确 PTX 的抗氧化作用。通过浓度筛选，我们发现浓度在 1 10 mg/L 范围内 PTX 预处理12 h 后，细胞活力升高，因此选取最低浓度 1 mg/LPTX 预处理 12 h 作为后续实验干预浓度。检测 LDH活力，发现 1 mg/L PTX 预处理可降低 LDH 活力，提示 1 mg/L PTX 对 t-BHP 诱导的 HUVECs 氧化损伤具有良好的保护作用。MDA 是细胞内 OS 代谢过程中生成的中间产物，含量可反映机体的氧化应激水平18。SOD 被认为是机体的第一道抗氧化防线，按照金属辅基的不同，可分为 Cu/Zn-SOD(SOD1)、Mn-SOD(SOD2)、Fe-SOD三种类型19。SOD1 主要存在于细胞质中，SOD2 主要分布在线粒体中，可通过催化超氧阴离子产生歧化反应，生成过氧化氢。GSH 是体内重要的抗氧化物，可将过氧化氢还原成水，降低超氧阴离子对机体的危害，而 GSH 本身被氧化生成 GSSG。Nrf-2 是一种应激诱导转录因子，是氧化应激的核心分子。在生理条件下，Nrf-2 存在于细胞质中。当氧化应激发生时，位于细胞质中的 Nrf-2 移位进入细胞核，启动抗氧化程序，促进 SOD 等抗氧化酶的表达。CUI 等20 研究发现，在赭曲霉毒素 A 引起的心脏氧化应激模型中，Nrf-2 表达和 SOD 活力下降。本研究发现 t-BHP 作用后，Nrf-2蛋白表达升高，SOD1 蛋白表达下降，SOD 活力升高，原因可能是外源性 OS 刺激引发 Nrf-2 蛋白和 SOD 活412http:J Air Force Med UnivVol.44 No.32023力应激性升高;随着 OS 作用时间的延长，细胞质中SOD1 被消耗，引起 SOD1 蛋白表达下降，此过程会大量产生过氧化氢;这些过氧化氢又与 GSH 反应，生成GSSG;PTX 预处理可逆转这一趋势。已知90%的 OS源自于线粒体氧化磷酸化过程21。在生理条件下，线粒体内电子通过复合物、和，将 ADP 磷酸化，耦合形成 ATP，在此过程中仅有少量电子逸出，与 O2作用生成 OS。应激状态下，大量电子从呼吸链逸出，生成内源性 OS。大量 OS 在细胞内堆积，一方面直接攻击线粒体 DNA;另一方面损伤线粒体膜系统，使线粒体外膜发生破裂、膜通透性转运孔持续开放，导致膜通透性增加，引起膜电位下降，最终引起线粒体结构和功能紊乱22。线粒体的功能障碍又会加剧电子漏产生，造成恶性循环。ATP 依赖的 Na+，K+-ATPase 和 Ca2+，Mg2+-ATPase 是细胞膜上重要的酶蛋白，能分别将 Na+、Ca2+运送至细胞外，同时将K+、Mg2+移入膜内，形成离子浓度差，维持内环境相对稳定23 24。细胞发生氧化损伤后，线粒体 ATP 生成减少，导致 Na+，K+-ATPase 和 Ca2+，Mg2+-ATPase的活性下降，细胞膜去极化，Ca2+相关通道开放，Ca2+进入细胞内，引起 Ca2+超载，同时，线粒体膜的通透性增加，使渗透压进一步升高，从而引起基质水肿，降低线粒体膜电位25。本研究发现，外源性 OS引起线粒体 OS 升高，造成内源性 OS 堆积，引发线粒体质量、膜电位、ATP 含量以及 ATPase 活力下降，提示外源性 OS 引起线粒体功能障碍。PTX 可通过升高 ATP 的含量和 ATPase 活力，保护线粒体功能。综上所述，PTX 能够通过发挥抗氧化作用和提高线粒体功能，保护 t-BHP 诱导的 HUVECs 细胞损伤，其进一步的分子机制还有待于深入研究。【参考文献】1GODO S，SHIMOKAWA H.Endothelial functions J ArteriosclerThromb Vasc Biol，2017，37(9):e108e114.2PI X C，XIE L，PATTESON C.Emerging roles of vascular endotheliumin metabolic homeostasis J Circ es，2018，123(4):477494.3INCALZA M A，DOIA，NATALICCHIO A，et al.Oxidativestress and reactive oxygen species in endothelial dysfunctionassociated with cardiovascular and metabolic diseasesJ VasculPharmacol，2018，100:119.4THELEN M P，WITH B，KYE M J.Mitochondrial defects in therespiratory complex I contribute to impaired translational initiationvia OS and energy homeostasis in SMA motor neuronsJ ActaNeuropathol Commun，2020，8(1):223.5MALDONADO V，HENANDEZ-AMEZ C，OLIVA-PEZ E A，et al.Pentoxifylline decreases 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