两种软珊瑚EST-SSR通用性引物的研发_王沛政.pdf

第 30 卷第 2 期2023 年 4 月海南热带海洋学院学报Journal of Hainan Tropical Ocean UniversityVol 30 No 2Apr 2023收稿日期:2022 06 29基金项目:国家级大学生创新创业训练计划项目(201911100014;202011100028)第一作者:王沛政，男，陕西西安人，教授，博士，研究方向为海洋生物遗传多样性。两种软珊瑚 EST-SSR 通用性引物的研发王沛政a，b，盖如新a，b，夏利栋a，b，董娴娴a，b，郁强a，b(海南热带海洋学院 a 海南省近岸海洋生态环境过程与碳汇重点实验室;b 崖州湾创新研究院，海南 三亚，572022)摘要:基于短指软珊瑚(Sinularia ceramensis)和花环肉质软珊瑚(Sarcophyton ehrenbergi)转录组数据，比较了上述两种软珊瑚转录组 SSR 序列的差异。利用合成的 100 条 EST-SSR 引物和 4 属 11 种 30 株软珊瑚样本进行通用性筛选。研究表明，在短指软珊瑚和花环肉质软珊瑚转录组数据中分别检测到 2 914 个和2 335 个微卫星，两种软珊瑚最多的重复类型均为三核苷酸序列重复，优势重复基元均为 TA/AT。筛选出 8 对扩增稳定的EST-SSR引物，Sinularia 属和 Sarcophyton 属的扩增率分别为87 50%和96 43%，Aldersladum 属的扩增率为56 25%，Lobophytum 属的扩增率为 37 50%。这 8 对种属间通用性较好的 EST-SSR 标签序列能为今后软珊瑚多样性研究提供借鉴。关键词:短指软珊瑚;花环肉质软珊瑚;转录组测序;EST-SSR;通用性中图分类号:Q953+1;Q178 53文献标识码:A文章编号:2096 3122(2023)02 0017 08DOI:10 13307/j issn 2096 3122 2023 02 030引言珊瑚礁生态系统是海洋中重要、多样性高和非常具有代表性的生态系统之一1 3，在海岸线、沿岸水文动力学以及活性物质研究4 6 等领域有着重要意义。受全球范围内的气候变化、海水酸化、人为活动造成的污染以及过度开发等影响，珊瑚礁生态系统的结构和功能明显衰退7 11。软珊瑚在整个印度 西太平洋地区(包括南海、海南岛沿岸海域)都拥有较高的丰度和多样性，为大量的海洋生物提供生存、栖息和繁殖的场所12 14。微卫星(Microsatellite)，也称简单序列重复(Simple sequence repeat，SSR)，包括二至六核苷酸的串联重复，以随机的方式广泛地存在于基因组中，与其他如扩展片段长度多态性(AFLP)、随机扩增多态性 DNA(RAPD)的显性标记，以及限制性片段长度多态性(RFLP)的共显性标记相比，表现出更高水平的多态性和更高的预期杂合度15 ，16 579。其自身的高保守性、共显性、位点特异性和基于 PCR 的扩增技术使 SSR 分子标记成为研究生物遗传多样性、遗传绘图和基因变化等经典而有效的分子标记17 19。SSR 序列基本上有两种类型:基因组-SSR(G-SSR)和表达序列标记-SSR(EST-SSR)。G-SSR 主要分布在整个基因组中，而EST-SSR 是基因组转录的部分，分布在 mRNA 中。EST-SSR 的高度保守性使其在预测遗传差异方面比 G-SSR 更加有效，且具有更高的近似种间通用性16 579，17。下一代测序技术(NGS)显著降低了获取大量序列数据的成本，推动了全基因组测序和转录组测序(RNA-seq)的快速发展，且已被广泛应用于无参考基因组信息的非模式生物相关研究中20 22。目前，有关造礁珊瑚的相关转录组测序数据及其分析已较为丰富21 23，但关于短指软珊瑚(Sinularia ceramensis)和花环肉质软珊瑚(Sarcophyton ehrenbergi)转录组测序及其相关研究却未见报道。本研究旨在基于转录组测序的结果进行短指软珊瑚和花环肉质软珊瑚微卫星标记挖掘及其生物信息学特征的分析;开发短指软珊瑚和花环肉质软珊瑚微卫星标记，筛选并开发 EST-SSR 分子标记;筛选并检验两种软珊瑚微卫星分子标记在同科跨属间的通用性，为软珊瑚在遗传结构研究和种类鉴定等方面提供71第 30 卷第 2 期海南热带海洋学院学报借鉴。1 材料与方法1 1 材料短指软珊瑚和肉质软珊瑚样品采自三亚市西瑁洲岛(181572N，1092235E)珊瑚礁区。珊瑚物种鉴定基于形态学、MSH 和 COI 分子标记测序。利用软珊瑚科(Alcyoniidae)样本 4 属 11 种 30 株用于 EST-SSR 引物通用性研究分析(表 1)。表 1软珊瑚样本信息属种个体数SinulariaSinularia wanannensis5Sinularia slieringsi2Sinularia maxima1Sinularia flexibilis5Sinularia acuta3AldersladumAldersladum jengi4LobphytumLobophytum crassum1SarcophytonSarcophyton tumulosum1Sarcophyton trocheliophorum2Sarcophyton sp2Sarcophyton glaucum21 2 方法1 2 1 转录组文库的构建和 EST-SSR 检测方法参照 HASSAN 等人的方法用 Oligod T 磁珠富集法构建文库24。利用 Agilent 2100 Bioanalyzer 生物分析仪对构建好的文库做质量检测，合格后使用 Illumina Hi SeqTM2000 进行测序。使用 Trinity 软件25 过滤已污染或低质量的序列，进行组装，在此基础上进行 EST-SSR 的筛选检测及 EST-SSR 数据库构建。1 2 2 EST-SSR 通用性筛选采用 Primer Premier 5 程序在基因的保守区设计引物。以重复基元序列长度为2 6 个核苷酸重复，引物退火温度为 50 60、预计产物的长度以超过 85 bp 为标准，选择符合条件的 EST-SSR 引物，并在短指软珊瑚和花环肉质软珊瑚间进行扩增筛选。PCR 扩增程序参考陆昊等26 的方法:95 预变性 5 min，95 变性 1 min，退火温度参考引物的退火温度，72 延伸 1 min，循环 15 次，最后 72 延伸 10 min。2 结果与分析2 1 EST-SSR 的数量和分布密度短指软珊瑚转录组序列的 N50 为 1 416 bp，164 825 个 unigene 中检测到 2 914 个微卫星;肉质软珊瑚转录组序列的 N50 为1 323 bp，154 826 个 unigene 中检测到2 335 个微卫星。短指软珊瑚和花环肉质软珊瑚转录组序列分别平均每66 3 和56 7 个 unigene 中含有1 个微卫星，其微卫星的平均跨度分别为52 9 kb和 56 1 kb。短指软珊瑚微卫星密度大、跨度小，具有一定的物种间差异性(图 1)。短指软珊瑚微卫星中最多的重复类型为三核苷酸重复(67 2%)，其余依次为二核苷酸重复(19 9%)、六核苷酸重复(5 2%)、四核苷酸重复(4 2%)，分布最少的为五核苷酸重复(3 5%)。花环肉质软珊瑚微卫星中最多的重复类型81王沛政等:两种软珊瑚 EST-SSR 通用性引物的研发2023 年第 2 期为三核苷酸重复(77 0%)，其余依次为二核苷酸重复(18 6%)、六核苷酸重复(6 4%)、五核苷酸重复(3%)，分布最少的为四核苷酸重复(1 3%)。基元长度2肉质软珊瑚短指软珊瑚34560200400600800100012001400160018002000出现次数/次图 1短指软珊瑚和肉质软珊瑚不同长度的重复基元的数目特征2 2 EST-SSR 不同重复类型的数量与频率微卫星标记重复单元的数量与频率分析见表 2。短指软珊瑚共拥有139 种重复单元，花环肉质软珊瑚共拥有 122 种重复单元。短指软珊瑚重复单元类型最多的为 54 种三核苷酸重复，其余为 21 种六核苷酸重复单元、20 种四核苷酸重复单元、16 种五核苷酸重复单元和 12 种二核苷酸重复单元。花环肉质软珊瑚重复类型最多的为 54 种三核苷酸重复单元，28 种六核苷酸重复单元、25 种四核苷酸重复单元、20 种五核苷酸重复单元和 12 种二核苷酸重复单元。短指软珊瑚中二核苷酸微卫星共有 579 个，TA/AT 重复单元占比最高为 10 71%。短指软珊瑚三核苷酸微卫星共有 1 958 个，GCA/GAT 有 164 个，四核苷酸微卫星共有121 个，五核苷酸微卫星共有 102 个，六核苷酸微卫星共有 152 个。花环肉质软珊瑚中二核苷酸微卫星共有 405 个，TA/AT 重复单元最高占比为 8 33%。花环肉质软珊瑚三核苷酸微卫星共有 1 650 个，GAT/GAG 有 151 个(6 45%)，四核苷酸微卫星共有 31 个，五核苷酸微卫星共有 106 个，六核苷酸微卫星共有145 个(表 2)。表 2短指软珊瑚和肉质软珊瑚微卫星重复类型数量分布重复类型短指软珊瑚重复单元重复数目比例/%发生频率/%肉质软珊瑚重复单元重复数目比例/%发生频率/%二碱基重复TA/AT3120 107 11 337 7TA/AT1950 083 30 821 7TG/GA840 028 80 360 2TC/GT750 032 10 316 1TC/CT660 022 70 283 0AC/CT550 023 50 231 8AG/AC520 017 90 223 0800 034 20 337 1其他650 022 30 278 7三碱基重复GCA/GAT1640 056 30 703 2GAT/GAG1510 064 50 636 3TGA/ATC1510 051 90 647 4GCA/AAG1430 061 10 602 6GAG/CCA1350 046 40 578 8TCA/CAG1330 056 80 560 5AAG/GCT1230 042 20 527 4AGC/GCT1130 048 30 476 2ATG/TGG1200 041 20 514 5TGC/ACC960 041 00 404 691第 30 卷第 2 期海南热带海洋学院学报表 2(续)重复类型短指软珊瑚重复单元重复数目比例/%发生频率/%肉质软珊瑚重复单元重复数目比例/%发生频率/%三碱基重复CAG/CTT1180 040 50 505 9CAC/CCT910 038 90 383 5TAT/AGC1080 037 10 463 1GGA/CCA890 038 00 375 1GTG/TCA1030 035 40 441 6CTT/ATC840 035 90 354 0TGT/GGA1000 034 30 428 8CGC/CTC800 034 20 337 1GGT/CAA960 033 00 411 6TGA/CTG790 033 80 332 9TGC/ACC770 026 40 330 1其他5910 252 62 490 5CGC/CTC700 024 00 300 1其他5930 203 62 542 5四碱基重复1210 041 60 518 8310 013 20 130 6五碱基重复1020 035 00 437 31060 045 30 446 7六碱基重复1520 052 20 651 71480 063 20 623 7总计2 9122 340注:所占比例是指某种碱基重复单元的数量/核苷酸重复单元总数的比值 100%;发生度是指实际中出现的次数/某种核苷酸重复中一种基元发生期望值 100%。2 3 EST-SSR 重复基元长度分析短指软珊瑚和花环肉质软珊瑚转录组数据库中微卫星重复基元长度区间在 12 68 bp 之间，12 15bp 的短微卫星数量最多(58 79%)，其次为 16 20 bp 的微卫星(21 7%)、21 30 bp 的微卫星(15 14%)和大于等于 31 bp 的微卫星(129 个，4 36%)。花环肉质软珊瑚微卫星最长重复基元为三碱基重复单元(TGG)的 21 次重复(63 bp)。花环肉质软珊瑚 12 15 bp 的短微卫星数量最多(65 14%)，其次为 16 20bp 的微卫星(19 74%)和 21 30 bp 的微卫星(323 个，13 83%)，最少的为大于 30 bp 的微卫星(129%)。根据 Temnykh 等27 按照碱基长度决定的多态性差异把微卫星分成 2 类:当微卫星长度大于等于20 bp 时具有高度多态性(型);微卫星长度在 12 20 bp 时具有中等多态性(型)。本研究检测出短指软珊瑚有 568 个微卫星(19 51%)为型微卫星，2 344 个微卫星(80 49%)为型微卫星。肉质软珊瑚有 353 个微卫星(15 12%)为型微卫星，1 982 个微卫星(84 88%)为型微卫星。2 4 EST-SSR 筛选和通用性分析从文库中随机选取 100 对引物(50 对短指软珊瑚引物和 50 对花环肉质软珊瑚引物)，在两种软珊瑚中进行通用性筛选。结果表明:花环肉质软珊瑚引物中 66%可以在花环肉质软珊瑚中得到扩增，32%可以在短指软珊瑚中得到扩增;50 对短指软珊瑚引物中 42%可以在短指软珊瑚中得到扩增，24%可以在花环肉质软珊瑚中得到扩增。其中 28 对引物可以同时在两种软珊瑚中扩增。利用这 28 对引物在软珊瑚科的30 株珊瑚进行扩增，编号15、69、68、75 和94 的5 种引物可以在67%的样品中扩增出多态的条带;编号15、24、38、64 和75 的5 种引物可以在83%的样品中扩增出多态条带，其中编号15 引物的部分扩增条带如图 2 所示。图 2编号 15 引物的部分扩增条带02王沛政等:两种软珊瑚 EST-SSR 通用性引物的研发2023 年第 2 期上述 28 对引物(表 3)在短指软珊瑚属的有效扩增率为 66 88%;在肉质软珊瑚属有效扩增率为 77 14%;在 Aldersladum 属和豆荚软珊瑚有效扩增率分别为 22 50%和 25 56%。其中 8 对引物(75、15、69、68、94、64、24、38，见表 4)在短指软珊瑚属的有效扩增率为 87 50%，在肉质软珊瑚属的有效扩增率为 96 43%，在Aldersladum 属的有效扩增率为 56 25%，在豆荚软珊瑚的有效扩增率为 37 50%。这 8 对引物除编号 94的为二碱基重复基元，其他重复基元均为三碱基重复，重复基元长度从 12 bp 至 21 bp 不等。表 328 种和 8 种引物的属水平上通用性分析属名称种数目28 个引物的平均扩增率/%8 个引物的平均扩增/%Sinularia1666 8887 50Aldersladum422 5056 25Lobophytum325 5637 50Sarcophyton777 1496 43表 48 对 EST-SSR 引物序列信息引物编号重复基元引物序列(5 3)退火温度/产物预期大小/bp15(TTC)7F:CTGAGGAGAGTACTCCTTGACGA60 0697R:CTCCCGTCATTGATCTGACTTTA24(GAT)6F:GTTGGTGCTAATGCAGATGGTAG60 91152R:TGATCTTCCTTGCCATCACTACT38(AAC)5F:GTAACATCCGAGAAACAATCGAG60 014116R:AAGCTTTGACCAGCAAAAACATA64(CAG)5F:TGGAAGACACAGCTCTCTTAACC59 936131R:CAGAGATGTTCTACTTTGGTGGC68(ATA)5F:CTCAATAAGATCGAGCGATGAAC60 238155R:CCACTGTTTTGGCAATTCTAAGT69(CAG)5F:GATCTCCTCTAATTTCTCCGTGG60 441142R:GCTGATGAACTTCTGGGGC75(GGA)5F:GCAGGCATCACCAAGGAT59 591147R:CACTTCTTCCTCTACGTTCACCA94(AT)6F:TAGCAGCTACCAGAAATGAAGGA60 389145R:AAGCTGATACAAATTCAACAGCC12第 30 卷第 2 期海南热带海洋学院学报3 讨论我国珊瑚资源非常丰富，为了更好地对珊瑚资源的丰富度和多样性开展调查评估，分子标记的设计研究非常重要。珊瑚礁资源调研活动曾在 20 世纪末大规模开展28 29，Zhao 等30 31 在 2017 年采用(基于)形态学方法对南海部分海区珊瑚多样性进行鉴别。张颖指出蔷薇珊瑚属(Montipora)的线粒体序列更适应属以上的分类鉴别，且能对种间细微的差别做出更好的区分32。Huang 等33 用 ITS 和-tubulin(-tub)两种核基因序列作为分子标记得到了不错的种间区分效果。周洋等34 用线粒体序列 MSH1 和 COI 对海南岛近岸的肉质软珊瑚做了系统发生分析，但两种标记物展示出的遗传关系略有不同。本研究筛选出的EST-SSR 引物与上述研究所用分子标签均不相同。EST-SSR 作为一种有潜力的分子标记，在遗传多样性分析、比较基因组学、种群遗传分析、分子育种 QTL 分析和连锁作图等研究中广泛应用35 37。本研究在短指软珊瑚转录组中检测到 2 914 个 EST-SSR，平均每 66 3 个 unigene 中含有 1 个，平均跨度为52 9 kb;在花环肉质软珊瑚转录组中检测到 2 335 个 EST-SSR，平均每 56 7 个 unigene 中含有 1 个，平均跨度为 56 1kb。花环肉质软珊瑚引物中 66%可以在花环肉质软珊瑚中得到扩增，32%可以在短指软珊瑚中得到扩增;50 对短指软珊瑚引物中 42%可以在短指软珊瑚中得到扩增，24%可以在花环肉质软珊瑚中得到扩增。这表明本研究在软珊瑚转录组中检测到的 EST-SSR 表现出较好的扩增特性，可以用作今后 EST-SSR 标记开发研究。在本研究中，短指软珊瑚最多的重复类型为三核苷酸重复(67 2%)，花环肉质软珊瑚最多的重复类型为三核苷酸重复(77%)，但两种软珊瑚的重复单元占比最高的均为二核苷酸重复。其中短指软珊瑚的优势重复基元为 TA/AT(10 71%)，其发生度(1 34)大于1，表现出对这两种碱基的选择偏好;花环肉质软珊瑚的优势重复基元亦为 TA/AT(8 33%)，但不表现出选择偏好(发生度小于 1)。两种软珊瑚的优势基元不同于石珊瑚(Acropora millepora)的 AG(8 9%)38 329，显示出软珊瑚与造礁石珊瑚在微卫星优势基元上的差异。SAMADI 等39 指出，较长的重复基元会受到更大的选择压力，从而减少其微卫星发生频率。本研究中短指软珊瑚和肉质软珊瑚各类型微卫星的发生频率随其重复拷贝次数的增加而减少，这与 Spodopterafrugiperda40 和 Curcuma alismatifolia41 的报道结论相同。本研究在100 对 EST-SSR 引物扩增中筛选出通用性较好的28 对引物。Wang 等38 330报道在多孔鹿角珊瑚(Acropora millepora)中的 EST-SSR 引物在同属的风信子鹿角珊瑚(Acropora hyacinthus)中的有效扩增率为 78 9%。尖边扁脑珊瑚(Platygyra acuta)的 EST-SSR 引物能在精巧扁脑珊瑚(Platygyra daedalea)(6111%)、块状多弯角蜂巢珊瑚(Favites flexuosa)(50 00%)和澄黄滨珊瑚(Porites lutea)(38 89%)中扩增出条带21。本研究有 8 对引物在短指软珊瑚属中的有效扩增率为 87 50%;在肉质软珊瑚属中的有效扩增率为 96 43%;在 Aldersladum 和豆荚软珊瑚属中的有效扩增率分别为 56 25%和37 50%。今后进一步通过筛选和验证更多效果好的标记，为软珊瑚在遗传结构研究、种类鉴定等方面提供借鉴。参考文献 1蔡榕硕，郭海峡，ABD-ELGAWAD A，等 全球变化背景下暖水珊瑚礁生态系统的适应性与修复研究 J 应用海洋学学报，2021(1):12 2代血娇，张俊，陈作志 珊瑚礁鱼类多样性及保护研究进展 J 生态学杂志，2021(9):2996 3侯敏驰，王旭涛，殷克东，等 珊瑚礁生长的影响因素及其生态修复 J 环境保护，2021(19):21 4柳叶 珊瑚礁地形上波浪传播及直立堤越浪研究 D 天津:天津大学，2019 5曾子溶，张梦梦，王鸿，等 中国南海矮小短指软珊瑚(Sinularia nanolobata)的化学成分研究 J 有机化学，2022(3):891 6李金凤，姚励功，曾艳波，等 西沙乳白肉芝软珊瑚中的化学成分及其抗炎活性研究 J 药学学报，2022(3):2021 7HUGHES T P，BARNES M L，BELLWOOD D R，et al Coral reefs in the Anthropocene J 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Characterization of EST-SSR Markers forSinularia ceramensis and Sarcophyton ehrenbergiWANG Peizhenga，b，GAI Ruxina，b，XIA Lidonga，b，DONG Xianxiana，b，YU Qianga，b(a Key Laboratory for Coastal Marine Eco-environment Process and Carbon Sink of Hainan Province;b Yazhou Bay Innovation Institute，Hainan Tropical Ocean University，Sanya Hainan 572022，China)Abstract:Based on the transcriptomic data，the differences were analyzed in microsatellite sequences of the transcriptomic se-quences of Sinularia Ceramensis and Sarcophyton Ehrenbergi 100 EST-SSR primers and 30 soft corals of 11 species，4 genera wereused in this research 2，914 and 2，335 microsatellites were detected in the transcriptome data of S Ceramensis and S Ehrenbergi，re-spectively，of which the most common repeat type was trinucleotide sequence repetition，and the common dominant repeat element wasTA/AT In addition，eight EST-SSR primers with bright versatility and amplification were screened，and the amplification rates inSinularia and Sarcophyton genera were 87 50%and 96 43%Among corals of the same family and different genera，56 25%of Al-dersladum and 37 5