两种单色鲤皮肤转录组特征分析_史东杰.pdf

第 38 卷第 1 期大 连 海 洋 大 学 学 报大 连 海 洋 大 学 学 报Vol.38 No.12 0 2 3 年 2 月JOURNAL OF DALIAN OCEAN UNIVERSITYFeb.2 0 2 3DOI:10.16535/ki.dlhyxb.2022-110文章编号:2095-1388(2023)01-0022-10两种单色鲤皮肤转录组特征分析史东杰1,2,张强3,伍仕弘4,高坚5,魏东6,张欣1,2,王赛赛1,2,孙砚胜1,2,姜巨峰7,李文通1,2,杨昊坤1,4(1.北京市农林科学院水产科学研究所,北京 100068;2.农业农村部华北都市农业重点实验室,北京 100097;3.北京市通州区动物疫病预防控制中心,北京 101101;4.北京博兴养殖技术有限公司,北京 102615;5.华中农业大学 水产学院,湖北 武汉 430070;6.天津农学院 水产学院,天津 300380;7.天津市水产研究所暨天津市观赏鱼技术工程中心,天津 300221)摘要:为了探究全红鲤(Cyprinus carpio)和全黄鲤的基因资源,采用 Illumina Hi-seq 测序技术对两种单色鲤的皮肤进行转录组测序,并对差异表达基因进行注释和富集分析。结果表明:对体长为(33.420.24)cm 的全红鲤和体长为(38.750.43)cm 的全黄鲤皮肤测序,分别获得干净数据(clean reads)为129 222 850 和 130 869 572 个;与 Nr、Nt、COG、GO、KEGG、Pfam 和 Uniprot 数据库中已知基因进行比对,分别有 58 782、61 490、11 468、31 206、31 581、61 385 和 51 805 个基因获得注释,7 个数据库中均有注释的基因数为 8 378 个;在全红鲤和全黄鲤皮肤中存在 4 822 个差异表达基因,其中,显著上调1 929 个,显著下调 2 893 个;取其中 9 个差异表达基因进行 qRT-PCR 验证,证实了转录组数据结果的可靠性;在差异表达基因中,筛选获得了部分参与体色调控的基因,包括 mitfa、ednrA、wnt7、agouti 和 mif 等;KEGG 分析发现,差异表达基因极显著富集在甘露糖与果糖代谢、糖酵解/糖原异生途径、碳代谢、磷酸戊糖途径和酪氨酸代谢等 43 条通路;对酪氨酸代谢和黑色素合成通路分析发现,与红色素和黄色素合成相关的基因 mif、mif4g、agouti、ednrA 和 ednrB 等显著上调,与黑色素合成相关的基因 tyr、tyrp1、mitfa 和wnt7 等显著下调;差异基因变异分析发现,全红鲤和全黄鲤中均存在的单核苷酸多态性标记(SNP)共388 673 个。研究表明,两种单色鲤皮肤组织中差异表达基因主要富集在能量代谢、生长和免疫等通路中,获得的转录组信息可为今后锦鲤分子标记的开发及功能基因的克隆、编辑和功能分析等提供基础数据。关键词:鲤;皮肤;转录组;差异表达基因;代谢通路中图分类号:S 917.4 文献标志码:A 鱼类的品种繁多,体色丰富多彩。观赏鱼类的体色主要由遗传基因和环境调控因子共同作用决定1。观赏鱼类的皮肤、鳞片大多呈现出独特的表型,不同群体、不同个体、不同性别或不同发育时期,鱼类体色均表现出显著差异2。随着经济社会的长期向好和人民生活水平的提高,人们对观赏鱼类的养殖需求日渐旺盛,且对高品质观赏性状的需求越来越高。通常人们肉眼看到的鱼类体色是由体表鳞片和皮肤组织含有的不同色素细胞及不同数量分布形成的。鱼类色素细胞广泛存在着基因组复制的现象,且数量远多于哺乳类和鸟类。目前,已获得成熟研究的鱼类色素细胞有 6 种,包含黑色素细 胞(melanophores)、红 色 素 细 胞(erythro-phores)、虹 彩 细 胞(iridophores)、黄 色 素 细 胞(xanthophores)、蓝色素细胞(cyanophores)和白色素细胞(leucophores)3。自 20 世纪中后期开始,国内外学者对鱼类体色的变异开展了大量遗传学基础和分子机制研究4-7。如 Wang 等4研究了尼罗罗非鱼(Oreo-chromis niloticus)体色模型,鉴定出其鳞片中包含4 种色素细胞,并发现了参与黑素合成、蝶啶代谢、类胡萝卜素吸收和裂解途径的 25 个突变基因,收稿日期:2022-04-11 基金项目:北京市农业农村局、北京市财政局、北京市园林绿化局北京市观赏鱼种质创制及品种选育联合攻关项目(G20220628009);北京市财政局北京淡水鱼种质资源保存;北京市财政局、北京市农业农村局“观赏鱼产业技术体系北京市创新团队-育种与繁殖岗位专家”专项资金(BAIC03);天津市财政局、天津市农业农村委天津市海水养殖产业技术体系海水观赏水族岗位项目(ITTMRS2021004);天津市水产研究所观赏鱼创新团队项目(SCYJI201902)作者简介:史东杰(1985),女,副研究员。E-mail:sdj19850104 通信作者:姜巨峰(1981),男,高级工程师。E-mail:jufengjiang 李文通(1967),男,高级工程师。E-mail:liwentong 其中 13 个突变基因在 F0代和 F2代均有表型,但在 F1代杂合体均无表型。史东杰等5-6对红白锦鲤(Cyprinus carpio)和三色锦鲤皮肤组织样本基因表达谱与差异表达基因功能进行了深入研究。徐伟等7对黄色、蓝色和红色鲤的遗传特性研究发现,黄色鲤为杂合体,但红色鲤和蓝色鲤为纯合体。鱼类品种繁多,体色多样,为更好地掌握鱼类肤色变异的遗传机制,需在鱼类中进行广泛探索。鲤广泛分布于淡水水域,对环境耐受能力强,大、小水体均适宜养殖,且具有营养价值和观赏价值,尤其是鲤的一个突变种 锦鲤,具有红、白、黄、黑、紫、蓝等多种色彩或混合色彩,是研究鱼类体色的理想模型。目前,锦鲤产业处于快速上升期,对渔业经济效益提升具有重要贡献,但因其种质高度杂合,定向培育进程缓慢,研究工作处在传统选育和养殖技术阶段,对其体色变异分子机制的研究尚少。遗传信息缺乏是导致符合分级标准的子代商品率较低的“卡脖子”问题。RNA-Seq技术基于高通量测序平台,可快速获取试验特定状态或特定时期下待测样本的基因表达谱,目前已成功应用于多种鱼类组织样品相关基因的转录本预测、分子标记的筛选及调控机制的研究8。本研究中,对红色鲤和黄色鲤皮肤转录组进行了测序,分析表达谱特征,对差异表达基因进行功能注释,以期为鱼类体色基因资源的开发提供重要参考。1 材料与方法1.1 材料试验鱼取自北京博兴养殖技术有限公司工厂化温室循环池。实验室暂养 2 个月后,于 2021 年 4月 29 日,随机捞取健康状况良好的全红鲤 3 尾(体长为 33.42 cm0.24 cm)和全黄鲤 3 尾(体长为 38.75 cm0.43 cm)进行正式试验。1.2 方法1.2.1皮肤总 RNA 提取将试验鱼用 25 g/L MS222 麻醉后在冰盘上解剖取样,每尾鱼皮肤组织为一个样本,全红鲤皮肤组织样本为 R1、R2、R3,全黄鲤皮肤组织样本为 Y1、Y2、Y3,每个样本设置 3 个生物学重复。-80 下保存,用于皮肤总 RNA 的提取。使用 Trizol 试剂盒(TaKaRa,北京)对皮肤组织总 RNA 进行提取,用 Nano Pho-tometer 分光光度计检测 RNA 纯度,使用安捷伦2100 RNA Nano 6000 Assay 试剂盒(Agilent Tech-nologies,CA,USA)检测 RNA 的完整性和浓度。1.2.2文库构建及测序全红鲤和全黄鲤皮肤组织 cDNA 文库构建及转录组测序由安诺优达基因科技(北京)有限公司完成,测序平台为 Illumina PE150。总 RNA 样品使用磁珠富集法进行纯化、筛选和回收,利用随机引物进行逆转录获得 cDNA第一条链,通过 2nd Strand/End Repair Enzyme mix和 2nd Strand Marking Buffer(均购自北京兆仪世纪科技有限公司)合成 cDNA 第二条链。1.2.3数据组装和基因功能注释对测序 raw reads 进行过滤,通过去除低质量 reads、接头污染碱基数5 bp 的 reads 及含 N5%的 reads 等过程,得到干净的高质量序列(clean reads)。使用鲤参考基因组(http:/www.fishbrowser.org/database/commoncarp_ genome/index.php/home/index/down/oads)进行序列比对,获得单色鲤样本特异序列信息。计算 Q30 值及饱和度分析,后续分析均使用高质量数据的序列。使用 7 大数据库对拼接所得的Unigene 序列进行功能注释,包括 Nt 在线数据库(NCBI Nucleotide Sequences)、Nr 数据库(http:/www.ncbi.nlm.nih.gov)、COG 数据库(Clusters of Orthologous Groups of Proteins)、Pfam 数据库(Pro-tein Family)、GO 数据库(Gene Ontology)、KEGG数据库(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)和 Uniprot 数据库(Universal Protein)。1.2.4基因表达与差异分析基因表达量通过其转录的 mRNA 值进行衡量,转录本丰度越高,说明基因表达水平越高。获得的 clean reads 序列比对组装好后,参考基因组注释信息,以转录本在样品中的 FPKM(Fragments per Kilobaseper Million Map per Fragments)9值作为转录本的表达量。通过对不同试验组间进行显著性差异基因的筛选,可获得差异表达的基因,并区分上调基因和下调基因。使用 DEseq10软 件 进 行 差 异 表 达 分 析,以log2(fold change)1 和 q 0.005 作为筛选阈值。使用 Goseq 和 KOBAS 软件分别对差异基因进行富集分析(corrected P value0.05)。差异表达基因通过 GO 数据库进行聚类分析,通过 KEGG 数据库进行通路富集分析。采用 Samtools 软件对全红鲤、全黄鲤皮肤转录组拼接获得的所有基因进行单核苷酸多态性标记(single nucleotide polymorphism,SNP)检测。1.2.5 qRT-PCR 验证 从转录组数据分析结果中随机选取差异表达基因 9 个,进行 qRT-PCR 检测(表 1)。选择转录组相同批次的 RNA 经过反转录32第 1 期史东杰,等:两种单色鲤皮肤转录组特征分析获得 cDNA,每个样本设置 3 个重复试验。使用鲤-actin11在荧光定量 PCR 仪(ABI,Stepone)进行 qRT-PCR 验证。反应体系(15 L):2SYBR Premix Ex Taq 7.5 L,上、下游引物各 0.6 L,LcDNA 1.5 L,ddH2O 4.8 L。反应程序:95 下预变性 150 s;95 下变性 5 s,58 下退火35 s,72 下延伸 30 s,共进行 40 个循环。采用 2-Ct法计算基因相对表达量。表 1 qRT-PCR 引物序列信息Tab.1 Primer sequence information required for qRT-PCR基因 ID gene ID引物序列(5-3)primer sequence(5-3)长度/bplength109064884F:TATTACGCGTAGACCAGTTACGR:GCTGAGAAGCCGTGCTGACT227109061688F:CGATTGACGGATCAGCATACGTCR:ATTACT ACGGTAGCTAGCGGCG166109061981F:GTTCTGTATCACTCAGACTCGACTR:ACCATGGCGATACACGGAGTTGT183109061823F:AGCGCGATCTATCGGTATATGCR:CTAAGCAAATGCTGTGCGCG213109061699F:GTGAACCAACTCTTGTCTTCGAR:CGGACCATCTACTAGGGACAC195109098764F:TATATATGTCTACCAATGCGCAR:AGTCTGCATAGCGAACGCAT216109062040F:GTGTCTAGTCGCCGAGTACTR:CTGAATGTGAACTGCATGGTT180109099018F:TCTATGTCGACTGAGCGTGGR:GCGTGCGCTATGATAGCGAGG143109113471F:TAGTTCGGATGGCTCTGTATGCR:CGAGGAGTGTGGTGAGTCACCG179-actinF:GAGCCTGCCGTTATGGAAGAAR:TACCGCAAAGACATGGTTCC1971.3 数据处理采用 SPSS 17.0 软件进行差异分析,差异显著性水平设为 0.05。2 结果与分析2.1 转录组测序质控和组装通过提取全红鲤和全黄鲤皮肤组织样本的总RNA,分别构建了全红和全黄皮肤 cDNA 文库。Illumina 平台测序结果显示:3 个全红鲤和全黄鲤样品中,分别有 133 227 070 个和 134 924 280 个raw reads,129 222 850 个和 130 869 572 个 clean reads;所有净数据比率均大于 96%,Q30 值均大于 93%(表 2),说明组装与测序质量较好,可用于后续分析。表 2 样品测序数据质量Tab.2 Sample sequencing data quality样品 sample原始数据 raw reads干净数据 clean reads净数据比率/%clean reads rateQ30 值/%Q30 contentR144 312 47042 847 11896.6993.81R244 130 83242 819 71697.0393.56R344 783 76843 556 01697.2693.84Y145 198 99443 875 39497.0793.78Y244 241 12842 977 97097.1493.75Y345 484 15844 016 20896.7793.642.2 功能注释和分类在 Nt、Nr、Pfam、Uniprot、COG、GO 和 KEGG这 7 大公共数据库中对获得的 61 491 个 genes 进行搜索和功能注释。其中,通过 Nt 数据库和 Pfam 数据库比对的单基因数最高,分别为 61 490 个和61 385 个,占比分别为 99.99%和 99.83%;其次是 58 782 个单基因匹配至 Nr 数据库,占比为95.59%;通过 COG 数据库比对成功的单基因数最少,为 11 468 个,占比最低(18.65%);在 Nr 数据库中比对发现,有 56.48%(34 729 个)的单基因与鲤高度同源,有 28.29%(17 394 个)的单基因与斑马鱼高度同源,但也发现有 15.23%的单基因未能与鲤或斑马鱼比对成功;所有 genes 均至少注释到一个数据库,但全部数据库都获得注释的基因数为 8 378 个,占总基因数的 13.62%(表 3)。表 3 基因功能注释统计Tab.3 New gene function annotation数据库database基因数目number of gene占比/%proportionNr58 78295.59Nt61 49099.99COG11 46818.65GO31 20650.75KEGG31 58151.36Pfam61 38599.83Uniprot51 80584.25至少一个数据库中注释annotated in at least one database61 491100.00所有数据库中注释annotated in all databases8 37813.62总基因 total unigene61 491100.0042大连海洋大学学报 第 38 卷2.3 差异表达基因的 GO 富集分析共获得全红鲤和全黄鲤皮肤组织差异表达基因4 822 个,其中有 1 929 个显著上调,2 893 个显著下调(图 1)。多个与鱼类黑色素合成、红色素合成、黄色素合成、酪氨酸代谢及喋啶合成相关的基因(mitfa、ednrA、wnt7、agouti 和 mif 等)被鉴定(表 4)。表 4 部分体色相关差异表达基因分析Tab.4 Analysis of some differentially expressed genes基因gene基因 IDgene IDFPKM 值 FPKM value全红鲤red common carp全黄鲤yellow common carp注释annotation校验值P valueednrA63488440581.57163.52Endothelin receptor type A210-126ednrB96665825421.339.70Endothelin receptor type B510-159mitfa9467201071.460.14Microphthalmia-associated transcription factor a110-149tyr9666501471.650.31Pkinase_tyr510-126wnt78312774160.030.06Hypothetical proteinCyprinus carpio210-128tfeb9666718714.982.20Transcription factor 510-97sox1047878638748.1424.35Sox10 protein Cyprinus carpio“color”410-120tyrp15704390070.010.03Tyrp1 protein Cyprinus carpio“color”0asip5150199627.0419.61Agouti signaling protein110-52atg4a6677307411.8525.56Cysteine protease0hsp7096665066218.2542.57Hsp70 proteinCyprinus carpio410-135agouti966655199398.45138.49Agouti-related proteinCyprinus carpio“color”410-75kitlgb9666679900.311.78Kit ligand bDanio rerio 110-142mif6850421410.1633.33Macrophage migration inhibitory factor310-64mif4g96666058111.8637.22 Eukaryotic translation initiation factor 4,mRNADanio rerio0trpm49666616640.030.01Transient receptor potential cation channel subfamily M mem-ber 4410-49mhc39731081720.4375.76Mhc class I antigen Cyprinus carpio“color”210-53cathepsin K96665327348.24259.47cathepsin K mRNACyprinus carpio“color”310-147图 1 全红鲤和全黄鲤皮肤组织差异表达基因火山图Fig.1 Volcano map of different transcriptome genes in skin of red common carp and yellow common carp对差异表达基因 GO 进行功能注释分析,在细胞组分方面,大部分富集在细胞部分、细胞器、细胞器部分、膜和膜部分等;在生物学过程中,主要注释在生物调节、细胞进程、代谢过程和发育过程等;在分子功能方面,集中富集在结合、催化活性、分子功能活性、分子传感调控和信号转导活性等(表 5)。2.4 差异表达基因的 KEGG 通路富集分析对所有差异表达基因进行 KEGG 通路富集分析,全红鲤和全黄鲤皮肤差异表达基因主要在323 个 KEGG 通路中富集,其中显著富集到 67 个通路;最显著富集的有甘露糖与果糖代谢、糖酵解/糖原异生途径、碳代谢、戊糖磷酸途径、PPAR信号通路、脯氨酸与精氨酸代谢、氨基酸的生物合成、肥厚型心肌病、扩张性心肌病、脂肪酸降解、细胞外基质受体相互作用、色氨酸代谢、脂肪酸代谢和酪氨酸代谢等43 条代谢通路,部分极显著富集52第 1 期史东杰,等:两种单色鲤皮肤转录组特征分析表 5 差异表达基因的 GO 数据库功能注释Tab.5 GO assignment of assembled different transcriptome genes1 级条目entry hierarchy 12 级条目entry hierarchy 2 基因数目gene number 登录号accession ID校验值P value细胞组分cellular component胞外区 extracellular region349GO:00055765.6910-7细胞 cell21GO:00056238.4910-30膜 membrane1 445GO:00160202.3910-11细胞连接 cell junction289GO:00343303.2110-10膜关闭内腔 membrane-enclosed lumen114GO:00319741.7410-8复杂大分子 macromolecular complex890GO:00329913.3210-7细胞器 organelle1 963GO:00069963.1610-10其他有机物部分 other organism part7GO:00442172.2110-9胞外区组分 extracellular region part485GO:00444211.1010-5细胞器部分 organelle part1 590GO:00444221.4510-12膜部分 membrane part1 397GO:00444259.2210-7突触部分 synapse part183GO:00444568.1310-7细胞部分 cell part3 419GO:00444641.0510-3神经突触 synapse77GO:00452021.8510-3超分子复合物 supramolecular complex191GO:00990802.1910-5生物学过程biological process细胞杀伤 cell killing27GO:00019063.2310-15免疫系统进程 immune system process452GO:00023768.7810-12行为 behavior104GO:00076100.2710-3代谢过程 metabolic process1 598GO:00081528.3410-5细胞增殖 cell proliferation91GO:00082837.4610-12细胞进程 cellular process2 757GO:00099877.6210-5生殖过程 reproductive process166GO:00224148.1310-7生物附着 biological adhesion250GO:00226106.5810-9信号 signaling109GO:00230523.4110-5多细胞有机体进程 multicellular organismal process665GO:00325014.8610-7发育过程 developmental process1 085GO:00325026.4710-12生长 growth77GO:00400073.4810-7细胞活动 locomotion205GO:00400117.1410-8色素沉着 pigmentation11GO:00434738.5910-21节律调节 rhythmic process56GO:00485116.5410-12定位 localization767GO:00081394.9010-9多细胞进程 multi-organism process267GO:00517041.1410-10生物调节 biological regulation2 135GO:00650073.2310-12细胞组织部分或生物合成 cellular component organization or biogenesis921GO:00718401.4510-8参与化学突触传递的突触前过程 presynaptic process involved in chemical synaptic transmission19GO:00995311.7410-5分子功能molecular function催化活性 catalytic activity1 386GO:00038244.5110-8信号转导活性 signal transducer activity302GO:00048712.4410-10结构分子活性 structural molecule activity177GO:00051982.3910-15转运活性 transporter activity294GO:00052151.8910-11结合 binding2 793GO:00054881.0110-12抗氧化活性 antioxidant activity8GO:00162092.4710-5翻译调节因子活性 translation regulator activity273GO:00451821.8910-11分子传感调控 molecular transducer activity304GO:00600891.9510-9毒素活性 toxin activity24GO:00907292.5810-9分子功能活性 molecular function regulator336GO:00987721.6710-16劫持分子函数 hijacked molecular function22GO:01040051.8910-1562大连海洋大学学报 第 38 卷通路见表 6。另外,通过对 KEGG 富集获得的酪氨酸代谢和黑色素合成通路分析发现,mif、mif4g、agouti、ednrA 和 ednrB 等与红色素和黄色素合成相关的基因显著上调,而 tyr、tyrp1、mitfa 和 wnt7 等与黑色素合成相关的基因显著下调。表 6 全红鲤和全黄鲤皮肤组织差异表达基因 KEGG 极显著富集前 23 条通路Tab.6 Analysis of top 23 KEGG enrichment pathways of different transcriptome genes in skin of red common carp and yellow common carp通路 pathwaymap基因数目 gene number检验后的 P 值 corrected P valueRIG-I 受体信号通路 RIG-I-like receptor signaling pathwaymap04622456.8810-11甘露糖与果糖代谢 mannose and fructose metabolismmap00051261.9510-9糖酵解/糖原异生途径 glycolysis/gluconeogenesismap00010316.4810-9碳代谢 carbon metabolismmap01200407.8110-8戊糖磷酸途径 pentose phosphate pathwaymap00030197.0010-8PPAR 信号通路 PPAR signaling pathwaymap03320332.9210-7脯氨酸与精氨酸代谢 proline and arginine metabolismmap00330248.2210-7氨基酸的生物合成 biosynthesis of amino acidsmap01230271.7110-6细胞因子及受体相互作用通路 cytokine-cytokine receptor interactionmap04060618.0310-6肥厚性心肌病 hypertrophic cardiomyopathy(HCM)map05410421.3710-5扩张性心肌病 dilated cardiomyopathy(DCM)map05414451.6710-5花生四烯酸代谢 arachidonic acid metabolismmap00590253.3410-5蛋白激酶信号通路 AMPK signaling pathwaymap04152511.2710-4半乳糖代谢 galactose metabolismmap00052152.6310-4卵巢类固醇生成 ovarian steroidogenesismap04913262.7610-4酪氨酸代谢 tyrosine metabolismmap00350115.8810-4抗原加工和呈递 antigen processing and presentationmap04612199.5910-4蔗糖与淀粉代谢 sucrose and starch metabolismmap00500151.2210-3胰岛素信号通路 insulin signaling pathwaymap04910491.5810-3近端小管碳酸氢盐回收 proximal tubule bicarbonate reclamationmap04964131.8210-3胰高血糖素信号通路 glucagon signaling pathwaymap04922382.2410-3心肌收缩 cardiac muscle contractionmap04260312.6710-3烟酰胺与烟酸代谢 nicotinamide and nicotinate metabolismmap00760132.5910-32.5 qRT-PCR 验证用 qRT-PCR 检测转录组数据中 9 个差异表达基因,其结果与转录组测得数据的结果一致,说明转录组结果真实可靠(图 2)。2.6 SNP 检测从表 7 可见:全红鲤和全黄鲤中均存在 SNP变异位点,共预测到 388 673 个,发生频率为1/(426 bp),表示平均每 426 bp 核酸片段有 1 个变异 位 点;在 SNP 位 点 中,碱 基 转 换 位 点 为256 325 个,碱基颠换位点为 132 348 个,转换颠换比为 1.94;6 个 SNP 变异类型中,C/T 的发生频率最高,占 SNP 位点总数的 34.14%,其次是 A/G,占 SNP 位点总数的 31.81%,其他 A/T、A/C、T/G和 C/G 4 种类型分别占比为9.97%、8.97%、6.83%和 8.28%。FC差异倍数;RQ相关定量。FCfold change;RQrelative quantification.图 2 qRT-PCR 检测结果Fig.2 Validation of data using qRT-PCR72第 1 期史东杰,等:两种单色鲤皮肤转录组特征分析表 7 碱基替换情况Tab.7 Summary of the base substitutionSNP 类型SNP typeSNP 数量number of SNP占 SNP 总数比例/%percent of the SNPC/T132 68334.14A/G123 64231.81A/T38 7639.97A/C34 8518.97T/G26 5476.83C/G32 1878.28总计 total388 673100.003 讨论体色是动物伪装逃避敌害、信号交流及求偶繁衍的重要性状,其主要由体表皮肤所含色素细胞的颗粒种类、形态、结构、数量及分布所决定的,色素细胞形成过程又受多种酶、生理刺激物和基因等共同调控。尽管人们对昆虫、斑马鱼(Danio rerio)等体色形成机制已基本了解,但不同生物体在体色形成上有较大不同,而对于动物体色形成机理和代谢规律的认识还较缺乏。鲤具有丰富多彩的颜色,是研究鱼类体色的良好试验材料。然而,有关鲤体色分子形成机制的科学问题目前还所知甚少。3.1 单色鲤转录组组装与注释本研究中通过转录组测序分析发现,全红鲤和全黄鲤皮肤组织中至少含有 4 822 个显著差异表达基因。通过 qRT-PCR 对 9 个基因进行检测,证实了转录组数据结果的可靠性。在 Nr 数据库中比对和注释的结果显示,全红鲤和全黄鲤转录组数据可比对到 58 782 条,占总基因数的 95.59%,说明全部基因基本可以与已知基因比对成功。在 Nr 数据库中比对,有56.48%(34 729 个)的单基因与鲤基因高度一致,有28.29%(17 394 个)的单基因与斑马鱼高度一致,分析原因可能是全红鲤、全黄鲤、斑马鱼和鲤同属于鲤形目(Cypriniformes)鲤科(Cyprini-dae)。但也发现有 15.23%的单基因未能与鲤或斑马鱼比对成功,这可能是因为全红鲤和全黄鲤属于观赏鱼类,是经自然条件和人工选育获得的鲤的变种,基因高度杂合,而 Nr 数据库中鲤基因组数据全部来自食用鲤,这部分未能成功比对上的基因可能是鲤基因间的序列,或者是 lncRNA,或者是重复序列的表达产物。3.2 单色鲤体色相关基因及通路鱼类具有黑色素细胞、红色素细胞、虹彩细胞、黄色素细胞、蓝色素细胞和白色素细胞等 6 种色素细胞,每种色素细胞含有不同的色素颗粒,色素颗粒的颜色、含量、迁移过程及反光作用,均可使鱼体呈现出多种颜色。田雪等12研究表明,mitfa 和tyr 基因在红色锦鲤体色发生不同阶段的表达水平呈现降低趋势,具有一定量的表达,这与本研究中全红鲤和全黄鲤检测出 mitfa 和 tyr 基因表达量的结果一致。Liu 等13在黄金锦鲤中检测到 mitfa 基因表达量;Parichy 等14在瓯江彩鲤(Cyprinus carpio var.)、纯色及黑色板块锦鲤皮肤中检测到 tyr 表达量。上述研究说明,mitfa 和 tyr 基因不仅在黑色细胞中起作用,也在其他色素细胞中发挥部分功能,但具体作用途径有待进一步研究。田雪等12通过观察 148 日龄红色锦鲤体色发生过程,发现 1 日龄红色锦鲤鱼体表现为无色透明,随后鱼体颜色逐渐增黑,48 日龄鱼体呈现红色,可见锦鲤红色皮肤与黑色皮肤退去有密切关系。动物体色形成机制以哺乳动物和鸟类的研究较多,主要集中在色素调控通路、色素细胞迁移及相互作用等方面,其中,以黑色素合成与运输的分子调控网络的研究最为成熟。研究发现,哺乳动物黑色素合成通路极为复杂且十分保守15。黑色素主要在黑色素小体中的膜结构细胞器合成,并沉着在动物的皮毛和眼睛,使其呈现出颜色。黑色素存在褐黑素和真黑素两种类型,只有真黑素影响黑色和褐色的表型,而褐黑素则控制形成红色、黄色和棕色。动物皮毛和眼睛呈现的颜色主要取决于以上两种色素的分布数量与比例16。Rees17研究发现,黑素皮质素受体 1(mc1r)基因由扩展位点(extension locus,E)编码,为 G 蛋白耦合受体-黑素皮质素受体(mcrs)家族成员中最小的一个。Lu 等18在信号蛋白 ASP 纯化过程中发现,小鼠(Mus m