毛竹ABCG基因鉴定及其表达模式研究_李紫阳.pdf

核 农 学 报 2023，37（5）：09170926Journal of Nuclear Agricultural Sciences毛竹ABCG基因鉴定及其表达模式研究李紫阳 杨克彬 朱成磊 刘燕 郭栋 肖晓燕 高志民*（国际竹藤中心竹藤资源基因科学与基因产业化研究所，国家林业和草原局/北京市共建竹藤科学与技术重点实验室，北京 100102）摘 要：ATP结合盒转运蛋白G亚家族（ABCG）在植物体内的物质运输过程中发挥着重要作用。为探究毛竹（Phyllostachys edulis）中ABCGs的分子特征、表达模式及转录因子对PeABCG15的调控关系，本研究利用生物信息学方法鉴定毛竹ABCG基因家族成员，对其基因结构、编码蛋白的理化性质和系统进化等进行系统分析，通过实时荧光定量PCR（qRT-PCR）技术对毛竹ABCG基因表达模式进行研究，借助酵母单杂交验证转录因子与ABCG基因的调控关系。结果表明，在毛竹基因组中共鉴定到77个ABCG基因（PeABCG1PeABCG77），其启动子中含有多种激素和非生物胁迫响应元件，其中脱落酸响应元件ABRE最多，出现在74个基因的启动子中。系统进化分析发现，PeABCGs分为白棕色复合体（WBC）和多效性耐药复合体（PDR）两个亚组，与水稻的亲缘关系较近。qRT-PCR结果显示，在脱落酸（ABA）处理后，7个与ABA运输相关的PeABCGs中有6个呈上调表达趋势，而未检测到PeABCG34表达；在低温处理条件下，7个PeABCGs均受到诱导表达；在干旱处理条件下，有2个PeABCGs的表达受到抑制，其余基因的表达均受到不同程度的诱导。另外，随着竹笋木质化程度增加，PeABCG15呈持续上调表达趋势，并与木质素合成调控转录因子基因PeKNAT3和PeMYB42的表达趋势一致。酵母单杂交试验证实，PeKNAT3和PeMYB42均能与PeABCG15的启动子结合。由此表明，PeABCGs参与毛竹抗逆可能存在ABA介导和非介导两种方式，其中PeABCG15受ABA诱导，且可能通过促进木质素合成参与毛竹抗逆。本研究结果为揭示毛竹中ABCG的功能提供了参考。关键词：毛竹；ABCG；分子特征；表达模式DOI：10.11869/j.issn.1000-8551.2023.05.0917ATP 结 合 盒 转 运 蛋 白（ATP-binding cassette transporters，ABC）是生物体中最大的转运蛋白家族1，该类蛋白利用 ATP 水解产生的能量驱动物质运输。ABC转运蛋白家族包括8个亚家族，其中ABCG是最大的亚家族2，该亚家族又分为白棕色复合体（white-brown complex，WBC）和多效性耐药复合体（pleiotropic drug resistance，PDR）。WBC 是半分子 ABCG 转运蛋白，具有一个核心单位；PDR 是全分子 ABCG 转运蛋白，具有两个核心单位3。每个核心单位由两个基本结构组成，即 ABC 转运蛋白特异性核苷酸结合域（nucleotide-binding domain，NBD）和疏水跨膜结构域（transmembrane domain，TMD）。NBD是由大约200个氨基酸残基组成的保守区段，包含 Walker A、Walker B、ABC signature基序以及Q环和H环4，TMD通常由46个疏水的-螺旋组成5。ABCG在植物中已有广泛研究，在植物激素运输、表皮角质层形成、次生代谢产物分泌、抵抗生物和非生物胁迫等方面起重要作用6。研究表明，植物通过表面形成角质层来保护自身免受外界侵害，而ABCG参与植物表面物质形成的运输，其中拟南芥（Arabidopsis thaliana）中的AtABCG1和AtABCG16 参与花器官相关表皮的角质组分运输7。ABCG介导植株体内重金属离子的外排，减少其对植物的毒害作用，如AtABCG36和AtABCG40可分别参与Cd2+和Pd2+的细胞外排8-9。ABCG还可参与木质素单体的转运，如AtABCG29是H型木质素单体香豆醇的转运蛋白10。另外，ABCG在植物体内广泛参与多种激素的运输，拟南芥中的ABCG25、ABCG30、ABCG31和ABCG40是脱落酸（abscisic acid，ABA）的转运体，分别在植物不同组织部位起输入或输出 ABA 的作用11。文章编号：1000-8551（2023）05-0917-10收稿日期：2022-07-05 接受日期：2022-10-18基金项目：国家重点研发计划项目（2021YFD2200502）作者简介：李紫阳，女，主要从事毛竹分子育种研究。E-mail：*通讯作者：高志民，男，研究员，主要从事竹藤生长发育的分子基础研究。E-mail：917核农学报37 卷 拟南芥ABCG36和ABCG37是两个在根部高表达的蛋白，参与生长素前体吲哚丁酸（indole-3-butyric acid，IBA）的运输，调控细胞内生长素动态平衡12-13。植物激素作为协调植物细胞活动的一类小分子化学信号物质，可通过多种方式调节植物的生长发育，尤其是可以参与抵御逆境胁迫过程，其中 ABA 发挥着重要作用14-15。另外，ABA可以调节木质素合成调控网络中的遗传调控因子，促进次生壁形成，从而提高抗逆性16。毛竹（Phyllostachys edulis）属于禾本科竹亚科刚竹属，具有生长快、适应能力强的特点，在我国栽培面积大，占全国竹林总面积的 72.96%17，且产量高，物理性能佳，是木材的良好替代品。低温和干旱等胁迫因素是制约毛竹竹材和竹笋产量和质量的主要非生物因素，目前在毛竹中已鉴定到多个基因参与到抗逆过程中，如Phehdz118、PeEXs19、NAC20、WRKY21等转录因子基因均受到低温或干旱胁迫的诱导。然而，激素作为植物响应非生物胁迫的重要信号分子，目前在竹子中关于运输的研究甚少，而ABCG作为重要的激素转运蛋白在竹子中的研究仍几乎处于空白。因此，本研究以毛竹为对象，在全基因组水平筛选并鉴定ABCG基因成员，综合分析其基因结构、蛋白保守结构域、进化关系以及其启动子中的作用元件，利用实时荧光定量PCR（quantitative real-time PCR，qRT-PCR）技术分析不同激素和非生物胁迫处理后ABA运输相关ABCG基因的表达模式，以期为深入研究ABCG基因家族在毛竹激素运输以及抗逆过程中的功能提供参考依据。1材料与方法1.1试验材料在人工气候室条件下（温度25，相对湿度80%，光16 h/暗8 h）培养毛竹实生苗，2个月时选择长势一致的幼苗，将其随机分为三组。第一组用100 molL-1的ABA溶液对叶片进行喷施处理；第二组将实生苗放入 4 培养箱中进行低温处理；第三组用 20%PEG-6000溶液浇灌至饱和，模拟干旱处理22。每个处理至少有20株幼苗，且均包含3次重复。分别在处理后0、3、6 h后收集各组毛竹自上而下第2片嫩叶，液氮速冻后存于-80 冰箱备用。以江西省南昌市野生毛竹林（11546 E，2845 N）中的毛竹笋为研究材料，选择长势良好的毛竹笋，采集代表竹笋生长趋势的5个不同高度（1.0、2.0、4.0、6.0和 8.0 m）的笋，选取地上第 15 节间（毛竹成竹胸高处），取该节间的上部作为试验材料。样品经液氮处理后，存于-80 冰箱，用于研究关键ABCG基因在不同高度笋中的表达模式。1.2试验方法1.2.1毛竹 ABCG 基因家族成员的鉴定分别从Rice Genome Annotation Project（http：/rice.plantbiology.msu.edu/）和TAIR（https：/www.arabidopsis.org/index.jsp）数据库下载水稻和拟南芥ABC家族成员的氨基酸序列作为诱饵，在毛竹新版本基因组数据库BambooGDB（http：/bamboo.bamboogdb.org/）中进行 BLASTP 比对分析，利用HMMER（https：/www.ebi.ac.uk/Tools/hmmer/）和SMART数据库（http：/smart.embl-heidelberg.de）对获得的候选序列逐条进行蛋白保守结构域的鉴定分析，删除没有典型结构域ABC transporter（PF00005）以及该结构域不完整的序列，得到毛竹 ABC 家族成员。利用MEGA 7.0软件中的邻接（neighbor-joining，NJ）法构建系统进化树，重复次数为1 000，其他参数使用系统默认值23。并以水稻ABC基因家族分类为依据24，对毛竹ABC基因家族进行分类，最终得到毛竹ABCG亚家族成员。利用ProtParam（http：/web.expasy.org/protparam/）网站对毛竹ABCG蛋白长度、分子量及等电点等理化性质进行分析，并使用 Plant-mPLoc 在线网站（http：/ Server v 2.0（http：/www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）预测跨膜结构域。利用TBtools分析毛竹ABCG亚家族成员的基因结构，利用 Plant CARE（http：/bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）数据库对基因上游 2.0 kb 序列进行顺式作用元件和应答元件分析，通过在线软件MEME（https：/meme-suite.org/tools/meme）对毛竹ABCG蛋白的保守基序进行分析。1.2.2毛竹ABCG亚家族成员系统进化分析利用MEGA 7.0内置的 ClustalW 软件对水稻的 ABCG氨基酸序列进行多序列比对分析，并构建NJ系统进化树，重复次数为1 000，其他参数使用系统默认值23。通过TBtools内置的BLASTP程序对毛竹和水稻ABCG的氨基酸序列进行多向比对，参考文献 25 设置参数，鉴定毛竹中以及毛竹与水稻中具有共线性关系的基因，使用TBtools内置的MCScanX程序进行可视化。同时，利用TBtools对毛竹ABCG同源基因对之间的同义（Ks）和非同义（Ka）核苷酸替换率进行计算。1.2.3毛竹关键 ABCG 基因的表达模式分析使用总RNA提取试剂盒（简石，中国）提取不同处理毛竹叶片、不同高度笋第 15 节上部的总 RNA，并反转录为9185 期毛竹ABCG基因鉴定及其表达模式研究cDNA，存于-20 冰箱。利用Primer Premier 5软件设计毛竹ABCG基因序列特异的定量引物（表1），由北京睿博兴科生物科技有限公司合成。使用qTOWER荧光定量PCR仪（耶拿，德国），以PeNTB为内参基因26，反应体系共10 L：2SYBR Green I Master 5.0 L、正向和反向引物各0.2 L、cDNA模板0.8 L、ddH2O 3.8 L。PCR扩增程序：95 预变性5 min；95 变性10 s，62 退火10 s，44个循环。采用2CT法分析基因的相对表达量27，并使用 OriginPro 软件绘制表达量图。1.2.4共表达网络构建与酵母单杂交根据毛竹木质化调控网络28，利用现有毛竹不同高度笋的转录组数据，基于加权基因共表达网络分析（weighted correlation network analysis，WGCNA）构建以PeABCG15为核心的共表达网络，筛选与之共表达的转录因子。根 据 PeABCG15 启 动 子 序 列 以 及 转 录 因 子 基 因PeKNAT3（PH02Gene30737）和 PeMYB42（PH02Gene08106）序列，利用Primer Premier 5软件设计引物，用于目的序列扩增，并分别构建到pHIS2和pGADT7-Rec2表达 载 体 中，命 名 为 pHIS2-PeABCG15pro、pGADT7-Rec2-PeKNAT3和pGADT7-Rec2-PeMYB42，将pGADT7-Rec2-PeKNAT3 和 pGADT7-Rec2-PeMYB42 分 别 与pHIS2-PeABCG15pro共转化到Y187感受态中，同时设置阳性对照（pGADT7-Rec2-53+p53His2）与阴性对照（pGADT7-Rec2-PeKNAT3+p53His2、pGADT7-Rec2-PeMYB42+p53His2），在 筛 选 培 养 基 DDO（SD/-Leu/-Trp）上培养后，将其菌液点于含有3-AT的 TDO（SD/-Leu/-Trp/-His）上，倒置培养35 d，拍照记录29。2结果与分析2.1毛竹ABCG亚家族成员鉴定与亚细胞定位预测通过筛选鉴定得到毛竹ABC基因190个，其中包含ABCG亚家族成员77个，根据BambooGDB数据库中基因组装名称的顺序依次命名为PeABCG1PeABCG77。PeABCGs 的编码序列（coding sequence，CDS）长度为8914 866 bp，编码蛋白氨基酸序列长度为2961 621 aa，其对应分子量为 32.93180.64 kDa，理论等电点介于5.589.77之间，平均亲水系数为-0.3370.414。跨膜结构域预测显示，有74个PeABCGs编码蛋白具有跨膜结构，跨膜结构域数量为314个不等，属于跨膜蛋白。亚细胞定位预测显示，有73个PeABCGs均定位到细胞膜上，同时有 6 个（PeABCG1、PeABCG20、PeABCG33、PeABCG33、PeABCG34和PeABCG58）定位到叶绿体，3个（PeABCG30、PeABCG31和PeABCG69）定位到细胞质，1 个（PeABCG54）定位到细胞核。另外 4 个 PeABCGs（PeABCG3、PeABCG18，PeABCG23和PeABCG24）定位到叶绿体、细胞质或细胞核中。2.2PeABCGs基因结构及其编码蛋白的motif分析基因结构分析结果表明，不同PeABCGs差异明显。外显子数量最多的是 PeABCG42（25 个），有 3 个基因（PeABCG9、PeABCG62和PeABCG73）不含内含子，且各个成员之间的差异在于内含子和外显子数量及所在位置不同（图1-A）。单个内含子最长为19 736 bp，是位于PeABCG27的第16个内含子。另外，22个PeABCGs没有非翻译区（untranslated regions，UTR），剩余55个成员中有36个同时具有5 UTR和3 UTR，5个只有5 UTR，14个只有3 UTR。Motif分析结果表明，在PeABCGs中共鉴定得到 10个 motif（motif 1motif 10）（图 1-B），其表1qRT-PCR和载体构建所用引物Table 1Primer sequences used in qRT-PCR and vector construction基因名称Gene namePeABCG7PeABCG15PeABCG17PeABCG34PeABCG46PeABCG58PeABCG65PeNTBPeKNAT3PeMYB42PeKNAT3PeMYB42PeABCG15pro上游引物（53）Forward primer（53）GGAGTCGATAACGGAGCAAAAGAATACAAGCACCGCGACCTCTTCGGAAGCAGCCTCGTCGTCTTCGAGAGGAAAGGTGTTGCTGATGTGATGATATGAAGGCAACTATAACATATCTACAAGCACCGGAACCTCATCGCCTGTGGTTTCCGTTGAGATCTTGTTTGACACCGAAGAGGAGAACTTCCTGGAGATACTGCGTCTATCATCGACTGGGCCGGCTTCGAGTGGCCATTATGGCCCGGGATGGCGTTCCACTACCCCGAGTGGCCATTATGGCCCGGGATGGGCAGGCAGCCATGCGACTCACTATAGGGCGAATTCACAAACGTGGAATCGCTT下游引物（53）Reverse primer（53）CGTTGCTGTTCCCGCCTGTGTCAGCCTCTGGGGCAAATTGATCCCCTTGAGTATGGTCCTGCTTTTTTAGGCTCTTTCCCGTCTGGGTGATTCTCATCCAACTCCAGCCTCTGGGGCAAATCCTATGAGGCCGAATATTAGTGTTTGAAATAGCTGTCCCTGGAGGAGTTTAGGATGTTGGGTTGCTGTGCGATCAAAGCCAACGCCCGAGGCCGACATGTTTTTTCCCGGGCTACCACGATTGCTCCGCGCCGACATGTTTTTTCCCGGGTCACAGCCACACTTCTTGCGGATCGATTCGCGAACGCGTGCAGGGAGGGAAGGCATA用途ApplicationqRT-PCR载体构建919核农学报37 卷 中 motif 1、motif 2 和 motif 7 是共有 motif 基序，并按motif 2-motif 7-motif 1顺序共同组成ABC家族的特征保守域ABC transporter。另外，motif 9只存在于半分子的ABCG（WBC）中，而motif 3、motif 4、motif 6和motif 8只存在于全分子的ABCG（PDR）中。基因结构和保守基序的差异表明，不同PeABCGs可能具有不同的功能。2.3PeABCGs的系统进化分析系统进化树分析表明，所有毛竹和水稻的ABCGs分为WBC和PDR两个亚组，毛竹中WBC成员数量较多，为42个，PDR中有35个（图2-A）。为进一步分析PeABCGs的进化情况，将PeABCGs定位到scaffold上并与水稻基因组进行共线性分析。结果发现PeABCGs共分布在23个scaffold上，其中47个基因组成28个共线性基因对（图2-B）。Ka/Ks分析发现，毛竹共线性基因对的Ka/Ks均小于1，由此表明PeABCGs在进化上经历了较强的纯化选择。与水稻基因组进行共线性分析发现，有 31 个 OsABCGs 与 50 个 PeABCGs 之间存在共线性，共组成54个共线性基因对，表明毛竹与水稻在进化上具有较近的亲缘关系。2.4PeABCGs启动子序列分析为进一步研究PeABCGs基因家族成员对植物激素和非生物胁迫的响应，对基因上游启动子中的顺式作用元件和应答元件进行了预测分析。结果显示，有8类作用元件与植物激素响应相关，如脱落酸响应元件ABRE，赤霉素响应元件TATC-box、GARE-motif和P-box，生长素响应元件TGA-element、AuxRR-core，以及茉莉酸甲酯响应元件TGACG-motif、CGTCA-motif等（图3）。其中，ABRE出现在74个PeABCGs的启动子中，且数量最多，如PeABCG3、PeABCG24、PeABCG45、PeABCG60、PeABCG61 和 PeABCG76 具有 10 个以上的 ABRE。同时，另有3类作用元件参与胁迫反应，如低温响应元件LTR和干旱响应元件MBS。由此表明，PeABCGs的表达可能受到多种植物激素和逆境胁迫的影响，特别是ABA、低温和干旱。另外，在14个PeABCGs中发现AC元件（AC-和AC-），前人研究表明该元件存在于木质素生物合成相关基因的启动子中，且是MYB转录因子特异结合元件30，由此推测这些PeABCGs可能参与了木质素的合成过程。注：A：基因结构；B：保守基序。Note：A：Gene structures.B：Conserved motifs.图1 PeABCGs基因结构及其编码蛋白的保守基序Fig.1Gene structures of PeABCGs and the conserved motifs of their encoded proteins9205 期毛竹ABCG基因鉴定及其表达模式研究注：A：基于毛竹和水稻ABCG氨基酸序列构建的系统进化树；B：毛竹和水稻ABCG基因的共线性分析。Note：A：Phylogenetic tree constructed on the base of ABCG amino acid sequences in moso bamboo and rice.B：Collinearity analysis of ABCG genes in moso bamboo and rice.图2 ABCG亚家族成员的系统进化分析Fig.2Phylogenetic analyses of the members belonging to ABCG subfamily图3 毛竹PeABCGs启动子响应元件种类统计Fig.3Statistics of response elements in the promoter of PeABCGs921核农学报37 卷 2.5ABA运输相关PeABCGs的表达模式分析根据拟南芥、水稻中运输ABA的ABCG，在毛竹中鉴定到7个同源基因，即PeABCG7、PeABCG15、PeABCG17、PeABCG34、PeABCG46、PeABCG58和 PeABCG65。qRT-PCR结果表明，在ABA处理下，除PeABCG34未检测到表达外，其余6个PeABCGs均呈上调表达趋势。其中PeABCG7和PeABCG17呈持续上升表达趋势，在处理6 h时表达量分别是处理前（0 h）的106倍和273倍，另外4个基因随时间的延长呈先上升后下降的表达模式，在3 h时与处理前相比均显著上调（P0.05）（图 4-AG）。在低温处理条件下，7个PeABCGs的表达量均受诱导。其 中 PeABCG15、PeABCG17、PeABCG34 和 PeABCG65表达量持续上升，特别是PeABCG34，处理6 h后的表达量达到了处理前的 33 倍，而 PeABCG7、PeABCG46 和PeABCG58则呈先上升后下降的表达模式，在3 h时与处理前相比均显著上调（图4-HN）。在干旱处理后，PeABCG17、PeABCG34 和 PeABCG46 的表达量持续上升，且在6 h时均显著高于处理前，特别是PeABCG46，其上调幅度最明显，表达量约为处理前的 34 倍；PeABCG15和PeABCG65呈先上升后下降的表达模式，在处理3 h时其表达量显著升高；而PeABCG7和PeABCG58的表达受到抑制，呈持续下降趋势（图4-OU）。2.6木质素合成相关基因PeABCG15表达分析由上述结果可知，PeABCG15在各个处理下均呈现显著变化，且PeABCG15启动子中存在与木质素合成相关的 AC 元件，因此对其进行表达调控研究。利用WGCNA构建了以PeABCG15为核心基因的共表达网络，并通过相关性分析筛选出与PeABCG15具有较高相关关系的56个转录因子基因（相关系数大于0.90）（图5-A）。这些转录因子基因分别属于13个转录因子家族（如MYB、NAC、HB等），其中PeKNAT3和PeMYB42与PeABCG15的表达具有高度相关性（相关系数大于0.94），PeKNAT3和 PeMYB42的同源基因在拟南芥中均参与调控木质素的生物合成31-32，分别克隆了启动子序列（798 bp）以及 PeKNAT3 和 PeMYB42 的编码区序列（912和795 bp），用于酵母表达载体的构建。酵母单杂交试验结果表明，阳性对照（pGADT7-Rec2-53+p53His2）、pGADT7-Rec2-PeKNAT3+pHis2-PeABCG15pro 和 pGADT7-Rec2-PeMYB42+pHis2-PeABCG15pro均能在TDO/3-AT培养基上正常生长，而阴性对照（pGADT7-Rec2-PeKNAT3+p53His2和pGADT7-Rec2-PeMYB42+p53His2）无法正常生长（图5-B）。由注：AG：ABA处理；HN：低温处理；OU：干旱处理。不同小写字母表示表达水平差异显著（P0.05）。下同。Note：A-G：ABA treatment.H-N：Low temperature treatment.O-U：Drought treatment.Different lowercase letters indicate significant difference of expression levels at 0.05 level.The same as following.图4 不同处理下毛竹叶中PeABCGs的表达分析Fig.4Expression analysis of PeABCGs in leaves of moso bamboo under different treatments9225 期毛竹ABCG基因鉴定及其表达模式研究此说明，PeKNAT3、PeMYB42能够与PeABCG15启动子相结合。同时qRT-PCR结果显示（图5-C），PeABCG15随着笋高度的增加呈上调的表达趋势，峰值出现在8.0 m 竹笋中，PeKNAT3 和 PeMYB42 的表达趋势与PeABCG15一致，特别是PeMYB42在8.0 m笋中较1.0 m笋上调了1 000倍以上。由此推测，PeABCG15的表达可能与木质素的合成密切相关。3讨论在植物中，ABCG是ABC转运蛋白家族中最大的亚家族2，毛竹中同样如此，这表明ABCG亚家族较其他亚家族的功能更为多样，因此在毛竹生长发育过程中起着关键的作用。本研究鉴定到毛竹中有 77 个ABCG家族成员，明显多于进化关系较近的二穗短柄草（44个）、水稻（50个）以及拟南芥（43个）等物种中的数量33，这可能与毛竹在进化过程中经历了全基因组复制事件和基因家族扩张事件有关34。这两种事件发生的原因很可能是毛竹在适应环境过程中需要更多物质来满足自身的生长发育，进而需要更多的转运蛋白作为支撑。另外，毛竹、水稻和拟南芥中所有无内含子的基因均属于WBC35，这一结果表明无内含子基因可能是从一个共同的无内含子基因祖先进化而来，且具有相似的功能。亚细胞定位预测结果表明 PeABCGs大多定位在细胞膜上，这与其他植物中的研究结果一致1，33。除此之外，还有个别成员定位到其他位置，如叶绿体上，由此推测这些成员可能运输光合作用相关的底物。有注：A：以PeABCG15为核心的共表达网络。实线表示相关系数大于0.94，虚线表示相关系数在0.90 0.94之间；B：酵母单杂交试验。pGADT7-Rec2-53+p53His为阳性对照，pGADT7-Rec2-PeKNAT3+p53His2和pGADT7-Rec2-PeMYB42+p53His2为阴性对照；C：不同高度笋中PeABCG15、PeKNAT3和PeMYB42的表达分析。Note：A：Co-expression network with a core of PeABACG15.Solid lines represent correlation coefficients higher than 0.94，dotted lines represent correlation coefficients between 0.90 and 0.94.B：Yeast one-hybrid assay.Co-transformation with pGADT7-Rec2-53+p53His was selected as a positive control，and co-transformation with pGADT7-Rec2-TF and p53His2 was selected as a negative control.C：Expression analysis of PeABCG15，PeKNAT3 and PeMYB42 in shoot with different heights.图5 转录因子调控PeABCG15的验证Fig.5Verification of PeABCG15 regulated by transcription factors923核农学报37 卷 研究表明，当植物处在缺铁环境中时，通过AtABCG37的转运功能可以及时补给含铁的复合物供植物正常生长36。OsABCG9 在水稻（Oryza sativa）叶片表皮蜡质（角质层的组成成分）的运输中发挥关键作用，与野生型相比，osabcg9-1 突变体叶片上的蜡质总量减少了53%，且在osabcg9-2突变体叶片中完全消失。毛竹中的OsABCG9同源基因 PeABCG6在叶片中的表达量较其他组织更高，推测该基因也可能与表皮蜡质的合成相关。研究表明，植物存在依赖ABA和不依赖ABA两种途径响应渗透胁迫37-38，ABA可以作为信号因子调控植物中木质素的生物合成39，高木质素含量能够提高植物的木质化，从而增强植物抵抗胁迫的能力16，40。本研究中，6个与ABA运输相关的PeABCGs在ABA以及低温或干旱处理下均受到诱导，说明上述基因可能通过ABA介导参与抗逆；而PeABCG34经qRT-PCR几乎未检测到表达，且在ABA处理下表达量未发生明显变化，表明该基因可能不受 ABA 调控。PeABCG15 在ABA、低温和干旱处理下均受诱导，推测该基因可能依赖ABA参与毛竹的抗逆过程。研究表明，在拟南芥中AtABCG29能够转运对香豆醇木质素单体，并影响木质素含量10。PeABCG15 是 AtABCG29 的同源蛋白，在本研究中PeABCG15的表达随笋高度的增加而显著上升，同时前人研究表明笋单个节间同一位置的木质化程度随笋高度的增加而加深28，且PeABCG15启动子区域含有MYB转录因子特异结合元件，推测该基因可能参与毛竹中木质素的生物合成。因此，PeABCG15可能在ABA诱导下通过促进毛竹的木质化来发挥抵御逆境的作用，这与葡萄叶片木质化程度高抗旱性增强41，以及棉花中木质素含量增加从而保护细胞壁免受真菌的降解42等研究结果一致，但其在竹子中的具体生物学功能有待进一步验证。4结论本研究从毛竹中鉴定了77个ABCG家族成员，发现PeABCGs的启动子区域中含有多种参与激素、非生物胁迫响应的调控元件以及转录因子结合元件。根据各成员具有完整保守结构域的数量，将PeABCGs分为WBC和PDR两个亚组，分别包括42和35个成员。在ABA处理、低温和干旱胁迫下，叶片中7个与ABA运输相关的 PeABCGs 的表达量变化模式说明，PeABCGs通过 ABA 介导型和非介导两种方式参与抗逆，其中PeABCG15的表达受ABA诱导，且其在毛竹笋中的表达随笋的木质化增加而上升，推测该基因可能通过促进木质素合成参与抗逆过程。参考文献：1 Gupta B B，Selter L L，Baranwal V K，Arora D，Mishra S K，Sirohi P，Poonia A K，Chaudhary R，Kumar R，Krattinger S G，Chauhan H.Updated inventory，evolutionary and expression analyses of G（PDR）type ABC transporter genes of rice J.Plant Physiology and Biochemistry，2019，142：429-4392 Kretzschmar T，Burla B，Lee Y.Functions of ABC transporters in plants J.Essays in Biochemistry，2011，50（1）：145-1603 Jasinski M，Banasiak J，Radom M，Kalitkiewicz A，Figlerowicz M.Full-size ABC transporters from the 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