食品安全地方标准汕头牛肉丸广东卫生和计划生育委员会.doc

DB44

广东省食品安全地方标准
DBS 44/XXX－2015

汕头牛肉丸
（送审稿）

2015-XX-XX 发布
2015-XX-XX实施

广东省卫生和计划生育委员会 发 布

DBS44/ XXX—20XX
前 言
本标准由广东省卫生和计划生育委员会提出。
本标准由广东省卫生和计划生育委员会归口。
本标准主要起草单位：汕头检验检测学会、汕头出入境检验检疫局检验检疫技术中心、汕头市卫生学校、汕头大学分析测试中心、汕头市潮菜研究会、仲凯农业工程学院轻工食品学院、汕头市普香食品有限公司、汕头市潮庭食品有限公司、汕头市澄海区潮禧绿色食品厂、广州衡创测试技术服务有限公司。
本标准主要起草人：吴图扬、林宏、周广彪、白卫东、洪建芬、郑宇晖、张杨、陈习群、刘丽婉、李颖、许如苏、陈图锋、张晓珊、周少芳、曾晓房。
本标准为首次发布。

10
DBS44/ XXX—20XX
汕头牛肉丸
1 范围
本标准适用于汕头牛肉丸。
本标准规定了汕头牛肉丸的术语和定义、产品分类、技术要求、检验方法、检验规则、标签、包装、运输、贮存、生产加工过程的卫生要求、销售和召回。
2 术语和定义
2.1 汕头牛肉丸
汕头牛肉丸是指以牛源性肉类为主原料，添加适量水、盐、淀粉及其它辅料，以传统槌打或机械糜化，制成丸状、固化成型的具有独特地方特色的非即食调制肉制品，包括牛肉丸和牛筋丸。
2.2 牛源性肉类
指分割牛肉、牛筋。
3 产品分类
3.1 汕头牛肉丸
以牛肉为主原料，添加适量水、盐、淀粉及其它辅料，成品中牛源性肉类含量不低于90%。
3.2 汕头牛筋丸
以牛肉和牛筋为主原料，添加适量水、盐、淀粉及其它辅料，成品中牛源性肉类含量不低于90%。
4 技术要求
4.1 原料要求
4.1.1 牛源性肉类
应符合GB/T 17238《鲜、冻分割牛肉》的规定。
4.1.2 食盐
应符合GB 5461《食用盐》的规定。
4.1.3 淀粉
4.1.3.1 木薯淀粉应符合NY/T 875《食用木薯淀粉》的规定。
4.1.3.2 其它淀粉应符合相关国家标准或行业标准的规定。
4.1.4 水
应符合GB 5749《生活饮用水卫生标准》的规定。
4.1.5 其它辅料、调味料、食品添加剂
应符合相应国家标准或行业标准的规定。
4.2 感官要求
应符合表1规定。
表 1 感官要求
项 目
要 求
检验方法
外 观
形态完整，呈球丸状，大小均匀。
取产品若干：1、按产品包装或标签上标明的食用方法进行烹煮后嗅闻和品尝，检查其气味和滋味。2、用手指捏压至牛肉丸直径2/3，应迅速恢复原状。4、置于白色瓷盘中，切开肉丸后在自然光下观察组织形态、色泽及杂质情况；
色 泽
色泽均匀，呈灰褐色。
滋味气味
具有牛肉特有的滋味和气味，无异味。
组织形态
富弹性，手指压后迅速恢复原状；不发粘；切面气孔大小不一，分布不均。
杂质
表面及丸内无肉眼可见杂质。
4.3 理化指标
应符合表2规定。
表 2 理化指标
项 目
指 标
检验方法
牛肉丸
牛筋丸
水分（g/100g） ≤
72
GB/T 9695.15
蛋白质（g/100g） ≥
12
8
GB/T 9695.11
脂肪（g/100g） ≤
12
16
GB/T 9695.1
淀粉（g/100g） ≤
3
GB/T 9695.14
钠（mg/100g） ≤
700
GB/T 9695.8
4.4 非法添加物
不得添加硼酸等国家相关部门规定的非法添加物。按GB/T 21918 《食品中硼酸的测定》等国家相关部门规定的检测方法进行检测。
4.5 牛源性成分含量
按附录A《牛肉丸中牛源性成分含量检测 荧光定量PCR方法》规定的方法测定。
4.6 污染物限量
应符合GB 2762《食品安全国家标准 食品中污染物限量》的规定。
4.7 食品添加剂
应符合GB 2760《食品国家安全标准 食品添加剂使用标准》的规定。
4.8 微生物指标
应符合表4规定。
表 4 微生物指标
项 目
指 标
检验方法
菌落总数/（CFU/g） ≤
30000
GB 4789.2
大肠菌群/（MPN/100g） ≤
90
GB 4789.3
4.9 农药最大残留限量和兽药最高残留限量
4.9.1 农药最大残留限量应符合GB 2763《食品安全国家标准 食品中农药最大残留限量》的规定
4.9.2 兽药最高残留限量应符合《动物性食品中兽药最高残留限量》（中华人民共和国农业部公告第235号）的规定。
4.10 净含量
应符合《定量包装商品计量监督管理办法》（国家质量监督检验检疫总局令〔2005〕第75号）的规定。
5 检验规则
5.1 批次、抽样
5.1.1生产企业
同日或同一班次、同一品种、同一规格的产品为一批。从生产企业成品库抽取。抽样数量为批量的1/1000，但不应少于6份独立包装，总重量不低于3000克。
5.1.2生产作坊
同日或同一品种的产品为一批。从作坊成品区抽取。抽样数量为每批抽取4份，总重量不低于2000克。
5.2 检验分类
5.2.1 出厂检验
5.2.1.1 产品出厂前，应由生产企业的质量检验部门或生产作坊的质量检验员按本标准规定逐批进行检验。无检测能力的生产企业或生产作坊应委托具备相关资质的检测机构检验。检验合格并签发质量合格证明的产品，方可出厂或出售。
5.2.1.2 出厂检验项目：感官要求、水分、菌落总数、大肠菌群、净含量、标签。
5.2.2 型式检验
5.2.2.1 型式检验项目：4.2-4.10要求的全部项目。
5.2.2.2 一般情况下，型式检验半年进行一次。有下列情况之一时，应进行型式检验：
a) 原辅料有较大变化时；
b) 更改关键工艺或设备时；
c) 新试制的产品或正常生产的产品停产3个月后，重新恢复生产时；
d) 出厂检验与上次型式检验结果有较大差异时；
e) 国家食品药品监督机构有关规定需要抽检时。
5.3 结果判定
5.3.1 菌落总数、大肠菌群不符合本标准时，判定整批产品不合格，不得复检。
5.3.2 感官要求、水分、净含量、标签、牛源性成分含量如不符合本标准时，可以在同批产品中抽取双倍量的样品进行复检，以复检结果为准；如复检结果中仍有一项不合格，则判该批产品不合格。
6 标签、包装、运输、贮存
6.1 标签
6.1.1预包装产品标签的标注内容除应符合GB 7718《食品安全国家标准 预包装食品标签通则》及GB 28050《食品安全国家标准 预包装食品营养标签通则》要求外，还应标示产品中牛源性肉类含量、添加辅料名称及添加比例、非即食提示信息及烹煮方法。
6.1.2 散装产品应在盛装容器、外包装上标明产品中牛源性肉类含量、添加辅料名称及添加比例、配料表、生产日期、保质期、生产经营者名称及联系方式、非即食提示信息及烹煮方法等内容。
6.2 包装
6.2.1 预包装产品包装材料应符合相应标准和有关规定。包装箱应清洁、干燥、严密无破损。
6.2.2 散装销售产品盛装容器、外包装材料应符合相应标准和有关规定。盛装前应洗涤容器，避免污染产品。
6.3 运输
产品应在-15℃以下运输、销售。产品装卸时要小心轻放，运输过程中应防止日晒雨淋及挤压碰撞，运输工具要清洁、卫生，不能与有毒、有害、有异味、易污染的货物混载。
6.4 贮存
产品应贮存在≤-18℃、温度波动±2℃的洁净库房内，不应与有毒、有害、有异味、易挥发、易腐蚀的物品混储。
7 生产加工过程的卫生要求
应符合GB 14881《食品安全国家标准 食品生产通用卫生规范》、GB/T 20940《肉类制品企业良好操作规范》和/或《广东省食品生产加工小作坊和食品摊贩管理条例》及附录B要求。
8 销售
8.1 应执行GB 31621《食品安全国家标准 食品经营过程卫生规范》要求。
8.2 应配备相应的冷藏、冷冻设备，并保持正常运转。
8.3 在经营过程中包装或分装的食品，不得更改原有的生产日期和延长保质期。包装或分装食品的包装材料和容器应无毒。
8.4 生产企业（作坊）如同时从事汕头牛肉丸批发业务的，应当建立食品销售记录制度，如实记录批发食品的名称、规格、数量、生产日期或者生产批号、保质期、销售日期以及购货者名称、地址、联系方式等内容，并保存相关凭证。
9 召回
应执行《食品召回管理规定》（国家质量监督检验检疫总局令第98号）。

附录A
牛肉丸中牛源性成分含量检测 荧光定量PCR方法
A.1 范围
本方法规定了肉制品中牛源性成分含量的荧光PCR相对定量分析方法。
本方法适用于汕头牛肉丸中牛源性成分的相对定量检测。
A.2 规范性引用文件
　　下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本附录。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本附录。
GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法
GB/T 27403 实验室质量控制规范 食品分子生物学检测
A.3 术语和定义
牛源性成分（Bovine derived materials）：牛种属特异性物质，本方法指的是牛种属特异性DNA片段。
标准汕头牛肉丸：按照本附录A.7.2制备的牛肉丸。
Ct值（Cycle threshold）：每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数。
A.4 原理
荧光定量PCR技术，是指在荧光PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。
锁核酸（Locked Nucleic Acid，LNA）探针是在传统Taqman探针的基础上，有目的地将一些碱基修饰成LNA碱基，即增加了探针的稳定性，又缩短探针长度，提高了探针的特异性和设计的灵活性，更适用于种属相近的动物源性成分检测。本方法通过设计特异性引物和LNA探针，检测牛特异性线粒体DNA序列来进行牛肉丸中牛源性成分的定量检测。
A.5 试剂和材料
　　除特别说明以外，所有试剂均为分析纯，实验用水为按照GB/T 6682规定的一级水。所有试剂均用无DNA酶污染的容器分装。
A.5.1 牛源性成分检测用引物（对）和探针序列为：
　　上游引物：5’-ttgaattaggccatgaagca-3’
下游引物：5’-cgacttgtctcctctcatgtagc-3’
LNA探针：5’-FAM-cgcccgtcaCcctcctcaaata-BHQ1-3’(探针中的“C”为LNA修饰碱基)
A.5.2 荧光PCR反应试剂
A.5.2.1 Taq DNA 聚合酶。
A.5.2.2 dNTP：dATP、dCTP、dGTP、dTTP。
A.5.2.3 10×PCR反应缓冲液：200 mmol/L Tris-HCl（pH 8.4），200 mmol/L KCl，15 mmol/L MgCl。
A.5.2.4 可使用等效荧光PCR反应试剂盒代替5.2.1～5.2.3。
A.5.3 DNA 提取纯化试剂
A.5.3.1 CTAB 裂解液：1% CTAB（cetyltrithylammonium bromide，十六烷基三甲基溴化铵），0.05 mol/L Tris-HCl（pH8.0）[Tris-：tris (hydroxymethyl) aminomethane，三（羟甲基）氨基甲烷]，0.7 mol/L NaCl，0.01 mol/L EDTA（pH 8.0）( ethylene diaminetetraacetic acid，乙二胺四乙酸)。
A.5.3.2 CTAB 沉淀液：CTAB 5 g/L，NaCl 0.04 mol/L，pH 8.0，高压灭菌。
A.5.3.3 NaCl溶液：1.2 mol/L。
A.5.3.4 蛋白酶K溶液：冻干品，用高压灭菌的去离子水溶解为 20 mg/mL 的溶液，分装后于-20 ℃保存，避免反复冻融。
A.5.3.5 三氯甲烷、无水乙醇、异丙醇。
A.5.3.6 可使用等效DNA提取纯化试剂盒代替5.3.1～5.3.5。
A.5.4 荧光PCR反应管或反应板
A.6 仪器和设备
A.6.1 荧光定量PCR仪。
A.6.2 生物安全柜。
A.6.3 恒温干热器：温度37 ℃～99 ℃。
A.6.4 离心机：离心力不小于12000 RCF。
A.6.5 移液器：0.1 μL～2.5 μL、0.5 μL～10 μL、10 μL～100 μL、20 μL～200 μL、200 μL～1000 μL。
A.6.6 均质器：旋转式均质器，转速不低于8000 rpm/min。
A.6.7 天平：感量 0.01 g。
A.6.8 振荡器。
A.6.9 冰箱：-20 ℃～4 ℃。
A.6.10 高压灭菌器。
A.6.11 干热灭菌器。
A.6.12 离心管：使用密封性好的1.5 mL、2 mL规格离心管。
A.6.13 Tip：使用挂壁残留低的10 μL、200 μL、1000 μL规格吸头。
A.6.14 pH计
A.6.15 搅肉机
A.6.16 研磨皿
A.7 样品制备
A.7.1 检测样品制备
取3至5颗牛肉丸称重，用灭菌剪刀剪成直径小于5 mm的小块，与水按照1:4的质量比混合；均质6 min，没有密封圈的均质器要使用生料带密封接口处，以防均质时水分外溢。制备出均一的悬浊液，制样后必须在5 min内进行检测。
A.7.2 标准汕头牛肉丸制备
将大块牛腿肉剔除筋膜切成小块，称取1000 g置于洁净的砧板上，于＜22 ℃室温环境下，用铁棒或木棒槌打至肉糜状（或用搅肉机、研磨皿破碎至肉糜状），肉糜加工过程中加入100 g碎冰。将肉糜全部转移至洁净的容器内，加入淀粉20 g、食盐6 g，徒手搅拌均匀，一手紧握肉浆控制大拇指和食指成环状并挤出肉丸，用羹匙掏进45 ℃温水内温浴5 min。将肉丸转移至95 ℃水中煮25 min，捞出晾干后用封口袋分装，-20 ℃保存备用。
A.8 检测步骤
A.8.1 DNA 提取和纯化
A.8.1.1 CTAB法
每个样品设置2个提取平行，使用移液器取中层悬浊液50 μL置于2 mL离心管中，加入1 mL CTAB裂解液和20 μL蛋白酶K溶液，65 ℃温育1 h，期间震荡混匀3～5次，；12000 RCF离心5 min，取1 mL上清液于2 mL离心管中，加700 μL三氯甲烷，漩涡震荡30 s，12000 RCF离心10 min，收集600 μL上清液到新的2 mL离心管中，加入2倍体积的CTAB沉淀液，室温放置60 min；12000 RCF离心5 min，去除上清液，加350 μL NaCl溶液溶解沉淀，再加350 μL三氯甲烷，漩涡震荡30 s，12000 RCF离心10 min，转移上清液到新的离心管。加入转移上清液0.8倍体积的异丙醇，室温放置20 min，12000 RCF离心10 min，加500 μL 70%乙醇水溶液，漩涡震荡30 s，12000 RCF离心10 min；去除上清液，敞口于60 ℃恒温干热器中干燥15 min或18 ℃室内空调下放置30 min；加150 μL去离子水溶解沉淀，即刻用于检测或-20 ℃保存备用。
为减少操作误差：取样时须将Tip尖端以45°角剪去大约5 mm；移液时应轻柔细致，离心管尽量垂直，Tip尖端插入液面不得超过3 mm；转移上清时勿触及下层液体。
A.8.1.2 试剂盒法
采用商品化的DNA提取纯化试剂盒，按照试剂盒说明书提取DNA，但提取的悬浊液为50 μL，最终的DNA定容体积为150 μL。
A.8.2 荧光PCR检测
A.8.2.1 PCR 反应体系
　　PCR反应体系见表1。每管DNA设置2个扩增平行。
表1 实验室自备的PCR反应体系
试 剂
加入量（μL）
10×PCR反应缓冲液
2.0
dNTP溶液（10mmol/L）
0.4
Taq DNA聚合酶（5U/μL）
0.2
上游引物(10μmol/L)
1.0
下游引物(10μmol/L)
1.0
LNA探针（10μmol/L）
0.2
DNA模板
2.0
补水至
20.0
A.8.2.2 PCR扩增条件
　　反应参数可根据具体的荧光PCR检测仪器型号和所用试剂的不同来设定，在一般反应程序基础上做适当调整。一般反应程序为：95 ℃，3 min；95 ℃，5 s, 59 ℃ 25 s，35个循环；在每个循环的退火阶段收集荧光信号。
　　检测过程中设置阳性对照、阴性对照和空白对照。
　　用标准汕头牛肉丸作为阳性对照，用非牛肉类肉丸（如猪肉丸）作为阴性对照，用等体积的双蒸水代替模板DNA作空白对照。
A.8.2.3 标准曲线的建立
使用标准汕头牛肉丸和非牛肉类肉丸（如猪肉丸）按不同比例混合，制成相对牛源性成分含量分别为100%、50%、25%、10%、1%及0.1%（m/m）的系列浓度标准样本。从提取DNA开始，每个定量样本各重复检测4次（各8次PCR扩增），检测后共获得48个Ct值，以ct值为横坐标，以log2（浓度）的绝对值为纵坐标绘制散点图，剔除明显偏离数据，保证有效数据不少于5个，制备标准曲线，并按照以下公式进行牛源性成分的含量计算。

公式中：y为牛源性成分含量；
X为检测的Ct值
a为标准曲线的斜率
b为标准曲线在x轴上的截距。
将构建标准曲线的Ct值分别代入公式，得出系列拟合浓度，统计出各定量点的扩展不确定度（95%可信区间）。
构建标准曲线和日常检测样品的所用方法和实验条件必须完全相同，标准曲线建立后可供多次使用。更改DNA提取方法、更换荧光PCR反应试剂，更新荧光PCR仪或仪器关键配件，必须重新制作标准曲线。
A.9 结果判断
A.9.1 结果分析条件设定
直接从荧光定量PCR仪上读取检测的Ct值。阈值的设定原则以阈值线刚好超过正常空白对照扩增曲线的最高点，同时可根据仪器噪声情况进行调整。
A.9.2 荧光PCR检测的质控
阳性对照：出现明显倒S型扩增曲线，且Ct≤25；
阴性对照：无扩增或Ct与阳性对照Ct之差＞7；
空白对照：无Ct值。
标准曲线：R2≥0.950。
A.9.3 样品结果的表述和判定
在质控成立的情况下，根据公式计算牛源性成分含量X.XX %(m/m)。在不超出允许差且高于定量限的前提下，报告检出的均值和相近检测浓度的扩展不确定度；超出允许差的，须复检。
检测的牛源性成分含量低于定量限时，以＜定量限来表述；检测的牛源性成分含量低于检测限时，报告未检出牛源性成分。
A.10 检测限和定量限
本方法的检测限为0.1%（m/m），定量限为1.0%（m/m）。
A.11 允许差
两个样本提取平行检测Ct值的改变＜0.4、扩增平行检测Ct值的改变＜0.2。
A.12 检测过程中防止交叉污染的措施
按照GB/T 27403执行。
A.13 废弃物处理
检测过程中的废弃物无害化处理。

附录B
生产加工过程的食品安全控制
汕头牛肉丸为地方特色产品，生产加工过程除应符合《食品安全国家标准 食品生产通用卫生规范》（GB14881）、《肉类制品企业良好操作规范》（GB/T 20940）和《广东省食品生产加工小作坊和食品摊贩管理条例》外，必须符合以下条文要求：
B.1 厂房和制作间
B.1.1 按照产品工艺特点，应在厂房或作坊制作间设置与产品加工能力相适应的原料处理区、肉糜加工区、肉丸成型区、肉丸煮制区、预冷场所、包装间、原料仓库、成品冷藏库、工器具清洗间等功能区域。
B.1.2 各功能区域应按工艺流程的要求相对独立、分开，并按原料贮存、原料处理、肉糜加工、肉丸成型、肉丸制熟、预冷、包装、成品贮存等先后工序设置，避免交叉污染。
B.2食品加工人员卫生要求
B.2.1 不应配戴饰物、手表；不应化妆、染指甲、留长指甲、喷洒香水；不得携带或存放与食品生产无关的个人用品；不允许在作业区域吸烟、进食、随地吐痰及其它不卫生行为。
B.2.2 进入作业区域前应整理个人卫生，规范穿着洁净的工作服，头发应藏于工作帽内或使用发网约束；
B.2.3 生产操作前按要求洗手、消毒；手工进行肉糜槌打时不允许脱衣操作；使用卫生间、接触可能污染食品的物品、或从事与食品生产无关的其他活动后，再次从事接触食品、食品工器具、食品设备等与食品生产相关的活动前应重新洗手消毒。
B.3 重点工序食品安全控制
B.3.1 原、辅料验收
B.3.1.1在接收或正式入库前必须经过对其卫生、质量的审查，查验供货者的许可证及产品合格证明，对名称、规格、数量、生产日期、保质期、供货者名称、地址、联系方式、卫生检验结果等进行登记后，方可入库；入库和使用应遵照“先进先出”或“效期先出”的原则。
B.3.1.2 采购原、辅料时，按该种原、辅料标准以及政府部门有关规定进行验收。应保证原、辅料具有该品种应有的色、香味和组织形态特征，不含有毒有害物质。应对供货厂家建立档案并对供应商能力进行评价，以便对产品进行全过程跟踪。
B.3.2 原、辅料及成品贮存
B.3.2.1牛源性肉类必须于0℃～4℃储存。
B.3.2.2 辅料冷藏库温度应控制在 0℃～10℃，冷冻库温度应控制在-18℃以下，应建立出入库台帐。
B.3.2.3 成品冷藏库温度应控制在 0℃～10℃，冷冻库温度应控制在-18℃以下，应建立出入库台帐。
B.3.3 原料处理
B.3.3.1 用清水清洗原料肉，采用人工或机械方式对大块原料分切至符合加工要求。
B.3.3.2 原料肉的分割过程应在低于 22℃的环境温度下进行。
B.3.4 肉糜加工
B.3.4.1 应建立每批（日）原料肉的使用台帐，至少包括进货时间、来源、重量、检验、验收、操作者等信息。
B.3.4.2 严格按照产品的配料要求添加辅料，各功能区域不应出现与本产品无关的其它辅料、添加剂及非法添加物。应建立每批（日）配料使用台帐，至少包括配料名称、来源或产地、使用量（配比）、检验、验收、操作者等信息。
B.3.4.3 肉糜加工过程应在低于 22℃的环境温度下进行。
B.3.5 肉丸成型
B.3.5.1 手工挤丸操作者应穿着工作服和工作鞋（靴），佩戴帽子、口罩，并做好手部清洁、消毒；用手紧握肉浆控制大拇指和食指成环状并挤出肉丸，用羹匙掏进温水中定型。
B.3.5.2 机械成型设备应彻底清洗后方可开机使用；应做好防护，防止杂质等混入；
B.3.5.3 根据产品工艺要求，肉丸成型应于45±5℃温水中进行。
B.3.6 肉丸煮制
根据产品工艺要求，肉丸煮制温度为92±5℃，煮制时间为20-30分钟，应由专人负责监控。
B.3.7 预冷
应在预冷区域进行预冷，预冷过程应防止产品再次污染，冷却后应立即进行包装。