培养基与光质对楸树叶柄愈伤组织诱导与再分化的影响_王肖.pdf

Vol.43 No.2Feb.2023第 43 卷 第 2 期2023 年 2 月中 南 林 业 科 技 大 学 学 报 Journal of Central South University of Forestry&Technologyhttp:/收稿日期：2022-04-07基金项目：国家林业和草原局科技成果国家级推广项目（2020133123）；湖南省企业科技特派员计划项目（2021GK5006）；湖南省林业科技创新项目（XLKY202221）。第一作者：王肖（），硕士研究生。通信作者：曾艳玲（），教授，博士。引文格式：王肖,盘鑫海,刘馨蕴,等.培养基与光质对楸树叶柄愈伤组织诱导与再分化的影响 J.中南林业科技大学学报,2023,43(2):84-92.WANG X,PAN X H,LIU X Y,et al.Effects of medium and light quality on the callus induction and re-differentiation of Catalpa bungei petiolesJ.Journal of Central South University of Forestry&Technology,2023,43(2):84-92.培养基与光质对楸树叶柄愈伤组织诱导 与再分化的影响王 肖1，盘鑫海1，刘馨蕴1，侯金波1，2，曾艳玲1（1.中南林业科技大学 a.经济林培育与保护教育部重点实验室；b.经济林育种与栽培国家林业局重点实验室，湖南 长沙 410004；2.安徽泓森高科林业股份有限公司，安徽 亳州 236814）摘 要：【目的】利用楸树间接器官发生途径培养愈伤组织并诱导出芽是楸树良种繁育的高效技术方法，同时也为楸树遗传转化方面的研究提供技术参考。【方法】以楸树试管苗叶柄为外植体，采用 L9（43）正交试验设计分别研究了不同基本培养基、植物生长调节剂浓度和光质等对愈伤组织诱导的影响，并对愈伤组织进行形态学和组织细胞学观察，据此筛选出适宜的诱导培养基，继而探索愈伤组织再分化的培养条件。【结果】在叶柄愈伤组织诱导过程中，基本培养基种类（MS、N6、DKW）的影响效应不显著，而 6-BA 浓度、NAA 浓度和光质对愈伤组织的诱导均具有显著影响。极差分析结果显示，当培养条件为白光，植物生长调节剂 6-BA 与 NAA的浓度比在 101 时最有利于愈伤组织的诱导，即楸树叶柄诱导愈伤组织的最佳培养基为 MS+1.0 mgL-1 6-BA+0.10 mgL-1 NAA，光质为白光；对 9 组愈伤组织制作石蜡切片，显微观察发现蓝光照射条件下，采用 DKW+3.0 mgL-1 6-BA+0.01 mgL-1 NAA 配方诱导出的愈伤组织细胞具有明显的拟分生组织，此愈伤组织在 DKW+0.2 mgL-1 TDZ+0.01 mgL-1 NAA 配方下可以成功诱导出不定芽。【结论】1）光照条件在愈伤组织诱导过程中具有显著的影响；2）TDZ 具有较高的活性，能够高效地促进楸树愈伤组织诱导不定芽生长。本研究初步建立了楸树叶柄愈伤组织诱导方法和不定芽诱导的有效培养条件，为楸树无菌苗培育及遗传转化体系建立提供技术支撑。关键词：楸树；叶柄；愈伤组织；光质；不定芽诱导中图分类号：S722.3+7 文献标志码：A 文章编号：1673-923X(2023)02-0084-09Effects of medium and light quality on the callus induction and re-differentiation of Catalpa bungei petiolesWANG Xiao1,PAN Xinhai1,LIU Xinyun1,HOU Jinbo1,2,ZENG Yanling1(1.a.The Key Lab of Cultivation and Protection for Non-Wood Forest Trees of Education Ministry;b.The Key Lab of Non-wood Forest Products of Forestry State Forestry Administration,Central South University of Forestry&Technology,Changsha 410004,Hunan,China;2.Anhui Hongsen hi tech Forestry Co.,Ltd,Bozhou 236814,Anhui,China)Abstract:【Objective】The use of the indirect organogenesis pathway of Catalpa bungei C.A.Mey in the cultivation of callus and the induction of buds is an efficient technical method for the breeding of Catalpa bungei C.A.Mey,which provides a technical reference for the research on genetic transformation of Catalpa bungei C.A.Mey.【Method】The effects of different basic media,plant growth regulator concentrations and light quality on the induction of callus were investigated by using Catalpa bungei C.A.Mey seedling petioles as the explants in an L9(43)orthogonal test design,and the morphological and histocytological observation of the induced callus was carried out to screen for the suitable induction media and re-differentiation conditions for callus.【Result】The effect of the basic medium(MS,N6,DKW)was not significant,while the concentration of 6-BA,NAA and light quality had significant effects during the induction of petiole callus.The range analysis showed that when the cultivation conditions were white light and a concentration ratio of plant growth regulators of 6-BA to NAA as 101,it was conducive to the induction of callus.That is,the best medium for the induction of callus in Catalpa bungei C.A.Mey petioles was MS+1.0 mgL-1 6-BA+0.10 mgL-1 NAA,and the light condition was white light.Doi:10.14067/ki.1673-923x.2023.02.01085中 南 林 业 科 技 大 学 学 报第 43 卷楸树 Catalpa bungei C.A.Mey 是紫葳科梓属植物，具有耐寒冷、速生丰产、适应性强等优点，是一种园林观赏树种及优质木材资源树种，同时也具有珍贵的药用价值，其叶、树皮、种子均可作药用1-2。楸树在我国已具有几千年的栽培历史，自古以来就有“木王”的美称，受到人们的广泛喜爱3。然而，楸树自花不亲和，结实稀少，实生繁殖非常困难。传统的扦插、嫁接等方式又难以提高成活率且繁殖系数低，因此，开展楸树的组织培养研究，对缩短繁殖周期，提高繁殖系数具有重要的现实意义。通过对植物器官离体培养，经过脱分化与再分化建立植物离体再生体系是实现对珍贵种质快速扩繁、保存和利用的生物技术育种手段之一，同时也是进行遗传转化研究的重要途径之一。目前，许多研究普遍关注到不同基本培养基和植物生长调节剂种类对愈伤组织诱导及分化的影响4-5，然而仅有少量研究关注到光质条件作用于外植体培养过程中也会对愈伤组织的诱导和分化产生显著性影响。如郭君丽等6在山药零余子愈伤组织诱导中发现，红光和黄光有利于愈伤组织生长率的提高；陈博7在喜树愈伤组织形成与分化研究中发现，蓝光对愈伤组织的诱导具有显著的影响。近年来，楸树组织培养植株再生已得到较为广泛的关注，大部分研究围绕带芽茎段展开，已成功建立起快繁体系8-9。而在愈伤组织诱导方面的研究较少，仅有杨燕等10以楸树无菌苗各器官为外植体探讨不同基本培养基、6-BA 和 NAA 对愈伤组织诱导的影响；Lin 等11研究了 6-BA 和 NAA不同浓度配比下愈伤组织的诱导情况。有关综合讨论基本培养基、植物生长调节剂以及培养光质条件对楸树叶柄诱导愈伤组织的影响的研究尚未见报道。本研究以楸树无菌苗幼嫩叶柄为外植体，研究基本培养基、植物生长调节剂和光质条件对楸树愈伤组织诱导及分化的影响，以期为种苗繁育及基因功能研究提供技术参考。1 材料与方法1.1 材 料楸树种子来源于安徽泓森高科林业股份有限公司。本研究以楸树种胚组织培养获得的无菌苗为试验材料，取楸树无菌苗幼嫩的叶柄作为诱导愈伤组织的外植体。1.2 试验方法1.2.1 楸树无菌苗及种胚愈伤组织的获取将 10 月份采摘于母树上的楸树种子带回实验室，进行如下消毒处理：自来水浸泡 48 h，流水冲洗 3 h，超净工作台上 75%酒精消毒 30 s，无菌水冲洗 4 次，然后用 0.1%升汞浸泡 4 min，期间不断摇晃，无菌水冲洗 5 6 次。消毒后的种子放到滤纸上待用，接种时剥去种子外种皮，接种到 MS 培养基中，待其长出楸树无菌苗用作叶柄愈伤组织诱导的材料。经过叶柄愈伤组织诱导培养条件筛选后，取消毒后的种胚接种至最佳培养条件下诱导愈伤组织，用作后续再分化研究的验证材料。1.2.2 楸树叶柄愈伤组织的诱导1）外植体接种培养基组合以培养基、植物生长调节剂（6-BA，NAA）和光质作为研究影响因素，设计 4 因素 3 水平正交试验 L9（43）（表 1），共 9 种组合（A1 A9），另培养基中附加 30 gL-1蔗糖，6.5 gL-1琼脂，pH值调节为 5.8 5.9，将培养基在 121高温高压下灭菌 15 min。2）外植体的接种待楸树无菌苗长到 5 6 cm 高时，取无菌苗的叶柄作为外植体，切成 0.6 0.8 cm 的小段，接种到 A1 A9 组培养基中，每组接种 10 12个外植体，重复 3 次，置于各光质(LED 光源）下培养，培养温度为（255），光照时间 16 h/d，光照强度为（505）molm-2s-1，30 d 后统计各组愈伤组织诱导率。The paraffin sections were prepared for 9 groups of callus,and the microscopic observation revealed that the callus cells induced by the formulation of DKW+3.0 mgL-1 6-BA+0.01 mgL-1 NAA under the blue light had obvious meristemoids,and this callus could successfully produce adventitious buds under the formulation of DKW+0.2 mgL-1 TDZ+0.01 mgL-1 NAA.【Conclusion】1)The light condition has a significant effect on callus induction.2)TDZ has a high activity and can efficiently promote the induction of adventitious buds.In this study,we initially established a method for the induction of petiole callus and effective cultivation conditions for the induction of adventitious buds of Catalpa bungei C.A.Mey,which provided technical support for the cultivation of sterile seedlings and the establishment of the genetic transformation system for Catalpa bungei C.A.Mey.Keywords:Catalpa bungei C.A.Mey;petiole;callus;type of light;adventitious bud induction王 肖，等：培养基与光质对楸树叶柄愈伤组织诱导与再分化的影响86第 2 期1.2.3 楸树叶柄诱导愈伤组织的显微结构观察取 9 组培养基诱导出的愈伤组织，切成小正方体（0.5 cm0.5 cm0.5 cm），置于 FAA 固定液中，经过固定脱水透明浸蜡包埋、切片脱蜡复水染色封片等步骤，在 Olympus BX53 显微镜下观察。1.2.4 楸树愈伤组织的再分化以培养基、植物生长调节剂（TDZ、NAA）和 光质作为研究影响因素，设计 4 因素 3 水平正交试验 L9（43）（表 2），共 9 种组合（B1 B9），培养基中附加 30 gL-1蔗糖，6.5 gL-1琼脂，pH 值调节为 5.8 5.9，将培养基在 121高温高压下灭菌 15 min。1.2.5 数据分析采用 Photoshop 软件处理图片，采用 Excel 2010 和 SPSS 26.0 软件对试验数据分别进行方差分析、LSD 多重比较和 Duncan 多重比较。每处理中愈伤组织诱导率和出芽率按以下公式计算：诱导率=（诱导出的愈伤组织数量/接种外植体总数）100%；出芽率=（诱导出芽的愈伤组织块/接种愈伤组织总数）100%。表 1 4 因素 3 水平脱分化正交试验Table 1 The differentiation orthogonal test of 4 factors and 3 levels编号No.培养基类型Type of medium6-BA 浓度6-BA concentration/(mgL-1)NAA 浓度NAA concentration/(mgL-1)光质Type of lightA1MS1.00.01白光（波长 400 1 050 nm）A2MS3.00.10红光（波长 580 660 nm）A3MS5.00.05蓝光（波长 420 520 nm）A4N61.00.10蓝光（波长 420 520 nm）A5N63.00.05白光（波长 400 1 050 nm）A6N65.00.01红光（波长 580 660 nm）A7DKW1.00.05红光（波长 580 660 nm）A8DKW3.00.01蓝光（波长 420 520 nm）A9DKW5.00.10白光（波长 400 1 050 nm）表 2 4 因素 3 水平再分化正交试验Table 2 The re-differentiation orthogonal test of 4 factors and 3 levels编号No.培养基类型Type of mediumTDZ 浓度TDZ concentration/(mgL-1)NAA 浓度NAA concentration/(mgL-1)光质Type of lightB1MS0.100.01白光（波长 400 1 050 nm）B2MS0.200.10红光（波长 580 660 nm）B3MS0.300.05蓝光（波长 420 520 nm）B4N60.100.10蓝光（波长 420 520 nm）B5N60.200.05白光（波长 400 1 050 nm）B6N60.300.01红光（波长 580 660 nm）B7DKW0.100.05红光（波长 580 660 nm）B8DKW0.200.01蓝光（波长 420 520 nm）B9DKW0.300.10白光（波长 400 1 050 nm）2 结果与分析2.1 培养基和光质对愈伤组织诱导的影响在楸树叶柄诱导愈伤组织正交试验的 9 个处理中，接种 4 d 后叶柄两端均开始膨大；8 d 后一端可见明显的愈伤组织形成，白光下的 A1、A5和 A9 组愈伤组织块大于其他光照下的组合；28 d后各组叶柄长成大小、形态与色泽不一的完整愈伤组织（图 1）。正交试验结果（表 3）表明，将幼嫩的叶柄接种在不同培养基中，A1 组和 A5 组下的愈伤组织诱导率显著高于其他处理组，为 100%；A7 组和 A9 组的愈伤诱导率也达到 90%以上。由表 3 中的极差值可以发现光质的极差值最大，其 次 是 6-BA 和 NAA，且 6-BA 的 极 差 值 大 于NAA，基本培养基的极差值最低，因此这 4 个因素对楸树叶柄诱导愈伤组织的作用大小依次为光质 6-BA 浓度 NAA 浓度基本培养基。通过计算 K 值可知，基本培养基以 MS 效果最佳，6-BA 的最佳浓度为 1.0 mgL-1，NAA 最佳浓度为 0.10 mgL-1，光质以白光条件效果最好。87中 南 林 业 科 技 大 学 学 报第 43 卷方差分析结果（表 4）显示，各因素之间的主间效应为：基本培养基对楸树叶柄诱导愈伤组织的影响不具有显著性，6-BA 浓度、NAA 浓度和光质对楸树叶柄诱导愈伤组织的影响具有显著性。针对显著性影响因素 6-BA 浓度、NAA 浓度和光质进行了 Duncan 多重比较分析，结果如图 2图 1 叶柄在各组培养基下诱导的愈伤组织Fig.1 Petiole-induced callus in each medium group表 3 叶柄诱导愈伤组织正交试验结果Table 3 Results of the orthogonal test for callus induction of petioles编号No.培养基类型Type of medium激素质量浓度Hormone Concentration/(mgL-1)光质Type of light诱导率Induction rate/%形态特征Character生长状态Growth condition6-BANAAA1MS1.00.01白光100.000.00 a质硬，深绿色+A2MS3.00.10红光83.011.66 ab质软，黄色+A3MS5.00.05蓝光67.224.34 b质软，黄褐色+A4N61.00.10蓝光83.339.62 ab黄绿色+A5N63.00.05白光100.000.00 a黄绿色+A6N65.00.01红光42.7811.64 b质软，黄绿色+A7DKW1.00.05红光90.285.01 ab质硬，浅绿色背白+A8DKW3.00.01蓝光55.9615.41 b质硬，浅绿色背白+A9DKW5.00.10白光93.336.67 a质硬，浅绿色背白+K12.502 32.736 11.987 42.933 3K22.261 12.389 72.575 02.160 7K32.395 72.033 32.596 72.065 1R0.241 20.702 80.609 30.868 2 表中数据为均值 标准误差；显著性检验为 LSD 检验，其中小写字母表示 0.05 水平上的差异显著性，字母相同则差异不显著（下同）；K1 K3为 4因子相同水平下的诱导率，R 为 4 因子不同水平下的极差；+表示生长健壮程度，个数越多表示生长状况越好。Data in the table are mean standard error;the significance test is LSD test,while lowercase letters indicate significant differences at the 0.05 level,and the same letters indicate insignificant differences;K1-K3 are induction rates at the same level of the four factors,and R is the extreme difference at different levels of the four factors;+indicates the degree of growth condition,and more+indicate a better growth condition;and the same below.王 肖，等：培养基与光质对楸树叶柄愈伤组织诱导与再分化的影响88第 2 期所示。各因素各水平的多重比较分析结果显示：6-BA 浓度 3 个水平中，1.0 mgL-1的影响显著优于 3.0 mgL-1和 5.0 mgL-1；NAA 浓度的 3 个水平 中，0.10 mgL-1略优于 0.01 mgL-1和 0.05 mgL-1；光质的 3 个水平中，白光条件极显著优于红光和蓝光，因此采用白光最佳。综上，楸树叶柄诱导愈伤组织的最佳培养基配方及光质条件为 MS+1.0 mgL-1 6-BA+0.10 mgL-1 NAA+白光。表 4 叶柄诱导愈伤组织方差分析Table 4 Variance analysis for callus induction of petioles源SourceIII 类平方和III Sum of squares自由度df均方Mean squaresF 值F value显著性Sig.培养基类型Type of medium292.3482146.1740.7880.4706-BA2 469.57321 234.7866.6550.007NAA2 390.65721 195.3296.4420.008光质 Type of light4 532.82522 266.41212.2140.000误差 Error3 339.91818185.551图 2 6-BA，NAA，光质 3 因素 3 水平 Duncan 检验Fig.2 Duncan test with 3 factors and 3 levels 2.2 培养基和光质对愈伤组织质量的影响为选择诱导出芽的最佳愈伤组织，对 A1 A9 各组诱导出的愈伤组织制作石蜡切片进行显微结构观察，各组愈伤结构显微观察如图 3 所示。A1、A4、A7 和 A8 组愈伤组织细胞排列紧密，胞质浓厚、染色深、细胞核明显且体积大，细胞形状较规则。但仅从 A8 组愈伤组织的显微结构中明显观察到拟分生组织，初步判定其为胚性愈伤组织。A2、A3、A5、A6 和 A9 组愈伤组织细胞形状不规则且排列疏松，胞质稀薄、染色浅、细胞核小，没有发现明显的分生结构，为非胚性愈伤组织。2.3 培养基和光质对愈伤组织出芽的影响分析获得的最佳愈伤组织诱导培养基 MS+1.0 mgL-1 6-BA+0.10 mgL-1 NAA，在 白 光 下 培养楸树叶柄获得 100%的愈伤率。根据愈伤率和愈伤组织显微观察结果，取该条件下和 A8 组下诱导出的愈伤组织块接种到 B1 B9 共 9 组培养基中进行再分化培养，结果仅在 A8 条件下的 B8组 培 养 基 中（DKW+0.2 mgL-1 TDZ+0.01 mgL-1 NAA+蓝光条件）分化出了不定芽（图 4）。为更好地分析基本培养基、植物生长调节剂等因素在愈伤组织再分化过程中所产生的影响，以期探索出适合的愈伤组织再分化培养条件。进一步对 B1 B9 组培养基进行验证试验，将种胚诱导出的愈伤组织接种到 B1 B9 组培养基中，一组接种 6 个生长状态相近的愈伤组织块，重复 3次，28 d 后统计试验结果（表 5）。试验结果表明，由种胚诱导出的愈伤组织具有较强的生长活性。接种到培养基 10 d 后，愈伤组织体积可以增殖到接种时的 2 倍大，但出芽的时间较长，且芽的形态呈现出喇叭状，基部膨大，部分不定芽伴有玻璃化的现象（图5）。由表5可知，B1 组的出芽率最高，达到 83.33%，其次是 B8 组的 77.78%，即叶柄愈伤组织再分化出不定芽的培养基配方。另外，由极差值可以发现，NAA 的极差值最大，其次是基本培养基和 TDZ，光质的极差值最小，因此这 4 个因素对愈伤组织再分化的作用大小依次为 NAA 基本培养基 TDZ 光质。通过计算 K 值可知，基本培养基以 MS 效果最佳；TDZ 最佳浓度为 0.2 mgL-1；NAA 最佳浓度为 0.01 mgL-1；光质以白光效果最佳。89中 南 林 业 科 技 大 学 学 报第 43 卷方差分析结果（表 6）显示，各因素之间的主间效应为光质对愈伤组织再分化的影响不具有显著性，基本培养基、TDZ 和 NAA 浓度显著影响愈伤组织再分化。因此，适合愈伤组织再分化的培养基为 MS+0.2 mgL-1 TDZ+0.01 mgL-1 NAA，白光条件下培养。3 结论与讨论本研究就基本培养基种类、激素种类、浓度和光质对楸树叶柄愈伤组织的诱导和再分化的影响进行比较。研究发现，光质、6-BA 和 NAA 浓度对叶柄愈伤组织的诱导有显著影响，就诱导率而言，最佳诱导培养基是 MS+1.0 mgL-1 6-BA+A8 中箭头指示位置为拟分生结构。The arrow in A8 indicates the position of the meristemoid.图 3 愈伤组织显微观察结构Fig.3 Microscopic observation of the structure of the callus图 4 愈伤组织出芽情况Fig.4 Budding of the callus王 肖，等：培养基与光质对楸树叶柄愈伤组织诱导与再分化的影响90第 2 期0.10 mgL-1 NAA，培养条件为白光；而在蓝光照射条件下，DKW+3.0 mgL-1 6-BA+0.01 mgL-1 NAA 培养基配方诱导出的愈伤组织后续可以成功分化出不定芽，诱导出芽的培养基为 DKW+0.2 mgL-1 TDZ+0.01 mgL-1 NAA，培养条件为蓝光。后续验证试验结果表明，种胚愈伤组织再分化的最佳培养条件为 MS+0.2 mgL-1 TDZ+0.01 mgL-1 NAA培 养 基 和 白 光 环 境,在 DKW+0.2 mgL-1 TDZ+0.01 mgL-1 NAA 培养基和蓝光环境下也可以诱导出芽。培养基为植物的生长发育提供营养，基本培养基的种类对愈伤组织的诱导和再分化产生影响。在毛桃12、青钱柳13、水曲柳14和湿地松15愈伤组织培养过程中，不同的基本培养基显现出了不同的分化效果。本试验结果表明，虽然从愈伤组织的诱导率来看，MS 培养基最佳，但是含有DKW 培养基的配方诱导出的愈伤组织可以成功分化出不定芽。表 5 愈伤组织再分化试验结果Table 5 Results of callus re-differentiation tests编号No.培养基类型Type of medium激素质量浓度Hormone concentration/(mgL-1)光质Type of light出芽率Budding rate/%生长状态Growth conditionTDZNAAB1MS0.100.01白光83.3316.67 a深绿色，白色和绿色芽点，平均芽长 1 cmB2MS0.200.10红光38.899.62 b绿色，绿色芽点，平均芽长 0.5 cmB3MS0.300.05蓝光16.6716.67 c绿色，绿色芽点，平均芽长 0.2 cmB4N60.100.10蓝光11.119.62 c黄绿色，组织疏松，无芽点B5N60.200.05白光11.119.62 c绿色，绿色芽点，平均芽长 0.5 cmB6N60.300.01红光38.899.62 b绿色，绿色芽点，平均芽长 0.3 cmB7DKW0.100.05红光11.119.62 c黄绿色，组织疏松，无芽点B8DKW0.200.01蓝光77.789.62 a黄绿色，绿色芽点，平均芽长 0.5 cmB9DKW0.300.10白光27.789.62 bc黄绿色，绿色芽点，平均芽长 0.5 cmK11.388 91.055 521.222 2K20.611 11.277 81.055 60.888 9K31.166 70.833 40.777 81.055 6R0.777 80.444 41.222 20.333 3图中箭头所指为生长出的不定芽。The arrows in the figure indicate adventitious buds.图 5 愈伤组织再分化情况Fig.5 The buds of callus91中 南 林 业 科 技 大 学 学 报第 43 卷表 6 愈伤组织再分化方差分析表Table 6 Variance analysis for callus re-differentiation源SourceIII 类平方和III Sum of squares自由度df均方Mean squaresF 值F value显著性Sig.培养基类型Type of medium3 209.53121 604.76511.9990.000TDZ987.7532493.8773.6930.045NAA14 134.64227 067.32152.8450.000光质Type of light555.6672277.8332.0770.154误差 Error2 407.25918133.737激素的种类和浓度是影响植物愈伤组织诱导和不定芽分化的关键因素。杜建武等16研究了辣木愈伤组织诱导与分化时内源激素的变化，认为在选择外源激素种类与浓度时，应以外植体内源激素作为参考；马林17在喜树愈伤组织诱导与培养中发现 2.0 mgL-1 6-BA+2.0 mgL-1 NAA+4.0 mgL-1 6-BA+2.0 mgL-1 NAA 诱导效果较好，在此基础上添加 2.0 mgL-1 2,4-D 时诱导率明显提升。本试验结果表明，在楸树叶柄诱导愈伤组织过程中，不同浓度的 6-BA 与 NAA 组合均能成功诱导出愈伤组织。就其诱导率而言，细胞分裂素 6-BA 与生长素 NAA 具有显著影响。通过计算 K 值发现较低浓度的 6-BA（1.0 mgL-1）与较高浓度的 NAA（0.10 mgL-1）有利于愈伤组织的诱导。而杨燕10 研究发现楸树无菌苗嫩茎在 3.0 mgL-1 6-BA 和 0.05 mgL-1 NAA 下的愈伤组织诱导率最高。Lin 等11发现在楸树无菌苗叶柄诱导愈伤组织的过程中，NAA 和 6-BA 的组合对愈伤组织的形成没有显著影响。在 NAA(1.0、0.5、0.1、0.05、0.01 mgL-1)和 6-BA(5.0 mgL-1)的浓度下均能获得疏松、浅绿色的愈伤组织且平均诱导率达到 95.7%。这可能与楸树品种差异和不同外植体的选择有关。TDZ 被认为是目前活性较强的细胞分裂素，在多种植物愈伤组织诱导不定芽的过程中均发挥了重要作用。本试验采用 TDZ 后发现其对楸树愈伤组织的生长起到明显促进作用，芽诱导效果较好。这与李晶等18、田歌等19的研究结论一致。光对植物的生长发育具有重要的影响。光质，即不同波长的光谱，作为一种物理调控因子已被广泛应用于植物组织培养。在叶柄诱导愈伤组织的试验中，将光质作为影响因素进行正交试验设计与操作。就愈伤组织诱导率而言，LED 白光、红光和蓝光均具有显著影响，根据 K 值计算结果，LED 白光是最有利于愈伤组织诱导的光质，红光次之，蓝光最差。就愈伤组织的生长状态而言，红光下愈伤组织颜色多为浅绿色，而蓝光下愈伤组织多为深绿色。这一结果与李林山等20的研究结果一致。但与一些学者的研究结果有所不同。熊丽等21在石刁柏愈伤组织的培养及林小苹等22在龙眼愈伤组织培养研究中均认为蓝光和红光对愈伤组织的生长具有促进作用。王维荣等23在黄瓜和番茄愈伤组织培养研究中发现在蓝光和红光下愈伤组织的生物量最大。这可能是因为试验所选光源不同，光的波长峰值及辐射有一定差异，且不同种属及不同品系的植物之间受到光的调节作用也不一致。后续再分化试验结果也表明在蓝光条件下虽然愈伤诱导率不高，但能形成有效出芽的拟分生组织，说明蓝光能促进楸树叶柄愈伤组织形成不定芽，后续种胚愈伤组织诱导出芽的试验结果也证实了这一点。本试验的局限性为叶柄愈伤组织再分化培养的研究不够完整，仅讨论了一组培养基中的不定芽诱导情况且诱导率不高，因而在后续试验中仍需探讨叶柄愈伤组织不定芽诱导的影响因素，从而筛选出更加优良的愈伤组织再分化培养基配方。综上所述，本研究建立了一套高效的楸树叶柄愈伤组织诱导方法，并初步探索出愈伤组织再分化的途径，研究结果可应用于楸树良种组培快繁以及遗传转化体系的建立。参考文献：1 徐洪宇.楸树叶片和种子中化学成分及其生物活性研究 D.杨凌:西北农林科技大学,2015.XU H Y.Studies on chemical constituents and biological activities of the Catalpa bungei C.A.Mey.leaves and seedsD.Yangling:Northwest A&F University,2015.2 MUOZ-MINGARRO D,ACERO N,LLINARES F,et al.Biological activity of extracts from Catalpa bignonioides Walt.(Bignoniaceae)J.Journal of Ethnopharmacology,2003,87(2-3):163-167.3 吴丽华,王军辉,林娟.楸树植物资源的研究概况 J.上海交通大学学报(农业科学版),2010,28(1):91-96.WU L H,WANG J H,LIN J.A survey of the studies on the resources of Catalpa bungeiJ.Journal of Shanghai Jiaotong University(Agricultural Science),2010,28(1):91-96.4 陈敏敏,杨柳燕,杨贞,等.凤丹白 成熟胚愈伤诱导、增殖及组织学观察 J.经济林研究,2021,39(1):9-16.CHEN M M,YANG L Y,YANG Z,et al.Callus induction,proliferation and histological observation of Paeonia ostii cv.Phoenix White mature embryoJ.Non-wood Forest Research,2021,39(1):9-16.5 孙艳艳,江皓,卞健,等.玲珑 枫香叶片愈伤组织培养技 术 J.中南林业科技大学报,2020,40(7):58-64.S