生物制品分析概论市公开课一等奖百校联赛特等奖课件.pptx

生物制品分析概论生物制品分析概论第二军医大学药学院第二军医大学药学院第1页本章内容本章内容背景概述背景概述判别试验判别试验杂质检验杂质检验含量（效价）测定含量（效价）测定第2页第一节第一节 背景概述背景概述生物药品（生物药品（Biopharmaceutics或或Biopharmaceuticals）是利用生物体、生物组织或组成生物体各种成份，）是利用生物体、生物组织或组成生物体各种成份，综合利用综合利用生物学、生物化学、微生物学、免疫学、物生物学、生物化学、微生物学、免疫学、物理化学和药学理化学和药学原理与方法制得一大类药品。原理与方法制得一大类药品。广义生物药品应包含从动物、植物和微生物等生物体广义生物药品应包含从动物、植物和微生物等生物体中直接制取各种天然生物活性物质以及人工合成或半中直接制取各种天然生物活性物质以及人工合成或半合成天然物质类似物。合成天然物质类似物。一、生物药品与生物制品一、生物药品与生物制品第3页生物药品发展生物药品发展第一代生物药品：利用第一代生物药品：利用生物材料加工制成生物材料加工制成含有一些天含有一些天然活性物质与混合成份粗提物制剂然活性物质与混合成份粗提物制剂 甲状腺粉及其片剂、鱼肝油与鱼肝油酸钠注射液、胰酶及甲状腺粉及其片剂、鱼肝油与鱼肝油酸钠注射液、胰酶及其肠溶片、肠溶胶囊等其肠溶片、肠溶胶囊等第二代生物药品：依据生物化学和免疫学原理，第二代生物药品：依据生物化学和免疫学原理，应用应用近代生化分离纯化技术近代生化分离纯化技术从生物体制取含有针对性治疗从生物体制取含有针对性治疗作用特异生化成份作用特异生化成份尿激酶、肝素钠、抑肽酶、胰岛素、人血白蛋白、人免疫尿激酶、肝素钠、抑肽酶、胰岛素、人血白蛋白、人免疫球蛋白、人凝血因子球蛋白、人凝血因子、人纤维蛋白原、人纤维蛋白原第4页生物药品发展生物药品发展第三代生物药品：应用第三代生物药品：应用生物工程技术生产生物工程技术生产天然生理活天然生理活性物质，以及经过性物质，以及经过蛋白质工程原理设计制造蛋白质工程原理设计制造含有比天含有比天然物质更高活性类似物，或与天然物质结构不一样全然物质更高活性类似物，或与天然物质结构不一样全新药理活性成份。新药理活性成份。重组人生长激素、重组人胰岛素、重组人干扰素重组人生长激素、重组人胰岛素、重组人干扰素 1b、重组、重组人白细胞介素人白细胞介素-2、重组人红细胞生成素（、重组人红细胞生成素（EPO）等）等生化药品生化药品生物合成药品生物合成药品生物制品生物制品生物药品分类生物药品分类第5页生物药品分类生物药品分类生化药品生化药品:普通系指从动物、植物及微生物提取，也普通系指从动物、植物及微生物提取，也可用生物可用生物-化学半合成或用当代生物技术制得化学半合成或用当代生物技术制得生命基生命基本物质及其衍生物、降解物以及大分子结构修饰物等本物质及其衍生物、降解物以及大分子结构修饰物等，如如氨基酸、多肽、蛋白质、酶、辅酶、多糖、脂质、氨基酸、多肽、蛋白质、酶、辅酶、多糖、脂质、核苷酸类核苷酸类等。等。生物合成药品生物合成药品:由由微生物代谢微生物代谢所产生药品和必须利用所产生药品和必须利用微生物及其酶转化反应微生物及其酶转化反应共同完成半合成药品，如山梨共同完成半合成药品，如山梨醇、木糖醇、甘露醇、枸橼酸、醇、木糖醇、甘露醇、枸橼酸、氨基酸、维生素、生氨基酸、维生素、生物碱、甾体激素、抗生素物碱、甾体激素、抗生素和一些核苷酸、酶与辅酶类和一些核苷酸、酶与辅酶类药品等。药品等。第6页生物药品分类生物药品分类生物制品生物制品:以以微生物、细胞、动物或人源组织和体液微生物、细胞、动物或人源组织和体液等为原等为原料，应用传统技术或当代生物技术制成，用于人料，应用传统技术或当代生物技术制成，用于人类疾病预防、治疗和诊疗。类疾病预防、治疗和诊疗。生长激素释放抑制激素生产：生长激素释放抑制激素生产：10万只羊下丘脑万只羊下丘脑1mg10L大肠杆菌工程菌株发酵液大肠杆菌工程菌株发酵液核酸疫苗制备技术路线：核酸疫苗制备技术路线：目标抗原基因选择与分离目标抗原基因选择与分离与载体与载体DNA连接连接转入宿主转入宿主扩增质粒扩增质粒重组质粒提取重组质粒提取、纯化与后处理、纯化与后处理第7页二、生物制品种类与特点二、生物制品种类与特点疫苗类药品疫苗类药品细菌类疫苗、病毒类疫苗、联合疫苗和类细菌类疫苗、病毒类疫苗、联合疫苗和类毒素毒素抗毒素及抗血清类药品抗毒素及抗血清类药品破伤风抗毒素等破伤风抗毒素等血液制品血液制品人血白蛋白、人免疫球蛋白、人纤维蛋白原人血白蛋白、人免疫球蛋白、人纤维蛋白原生物技术制品生物技术制品 重组人表皮生长因子凝胶（酵母）、重重组人表皮生长因子凝胶（酵母）、重组人组人p53腺病毒、基因工程乙肝疫苗、单克隆抗体等腺病毒、基因工程乙肝疫苗、单克隆抗体等微生态活菌制品微生态活菌制品如双歧杆菌活菌胶囊、地衣芽孢杆菌如双歧杆菌活菌胶囊、地衣芽孢杆菌活菌颗粒、酪酸梭菌活菌片等活菌颗粒、酪酸梭菌活菌片等诊疗制品诊疗制品体外诊疗制品（体外诊疗制品（HBsAg酶联免疫诊疗试剂盒）酶联免疫诊疗试剂盒）、体内诊疗试剂、体内诊疗试剂第8页二、生物制品种类与特点二、生物制品种类与特点分子量不定值分子量不定值不一样相对分子质量产生不一样活不一样相对分子质量产生不一样活性性生化法结构确证生化法结构确证定时监测制品肽图定时监测制品肽图需检验生物活性需检验生物活性生物检定法证实活性生物检定法证实活性安全性检验安全性检验宿主蛋白残留量，提取溶剂残留量宿主蛋白残留量，提取溶剂残留量效价测定效价测定酶活力测定酶活力测定第9页三、生物制品全程质量控制三、生物制品全程质量控制注射用重组链激酶产品全程质量控制过程注射用重组链激酶产品全程质量控制过程操作操作过过程程详细项目法定法定标标准准1 1 基本要求基本要求生生产产和和检检定用定用设设施、原料及施、原料及辅辅料、料、水、器具、水、器具、动动物等物等符合“凡例”相关要求2 2 制造制造2.1 2.1 工程菌菌种工程菌菌种名称与起源带有链激酶基因重组质粒转化大肠杆菌菌株种子批建立、菌种检定应符合要求2.2 2.2 原液原液种子液制种子液制备备、发发酵用培养基酵用培养基应符合要求种子液接种及种子液接种及发发酵培养酵培养按工按工艺艺操作操作发发酵液酵液处处理、初步理、初步纯纯化、高度化、高度纯纯化化按工艺操作，纯度符合要求原液原液检检定定按按3.13.1项进项进行行2.3 2.3 半成品半成品配制与除菌、半成品配制与除菌、半成品检检定定工艺按要求操作，检定按3.2项进行2.4 2.4 成品成品分批、分装与分批、分装与冻冻干、干、规规格、包装格、包装应符合要求第10页3 3 检检定定3.1 3.1 原液原液检检定定生物学活性、蛋白生物学活性、蛋白质质含量、比活性含量、比活性依法测定，应符合要求纯纯度度电电泳法、泳法、HPLCHPLC测测定，定，纯纯度不度不低于低于95.095.0分子量分子量还还原型原型SDS-PAGESDS-PAGE法法测测定，定，为为47.047.0 4.70kD4.70kD外源性外源性DNADNA、宿主菌蛋白残留量以及、宿主菌蛋白残留量以及残留抗生素残留抗生素依法测定，应符合要求细细菌内毒素菌内毒素依法测定，应符合要求等等电电点点主区主区带应为带应为4.64.6 5.65.6紫外光紫外光谱扫谱扫描描最大吸收波最大吸收波长应为长应为277277 3nm3nm肽图肽图依法依法测测定，定，应应与与对对照品照品图图形形一致一致N-N-末端氨基酸序列末端氨基酸序列Val-Lys-Pro-Val-Gln-Ala-Val-Lys-Pro-Val-Gln-Ala-Ile-Ala-Gly-Ser-Glu-Trp-Ile-Ala-Gly-Ser-Glu-Trp-Leu-Leu-AspLeu-Leu-Asp3.2 3.2 半成品半成品检检定定细菌内毒素、无菌检验依法测定，应符合要求3.3 3.3 成品成品检检定定判别试验、物理检验、化学检定依法测定，应符合要求生物学活性生物学活性应为标示量80150无菌、细菌内毒素、异常毒性检验依法测定，应符合要求第11页对生物制品质量控制重点对生物制品质量控制重点有效成份同一性、结构确证；有效成份同一性、结构确证；有效成份均一性、纯度检验；有效成份均一性、纯度检验；有害物质及残余杂质（特殊杂质）等控制；有害物质及残余杂质（特殊杂质）等控制；高效、灵敏生物活性及比活性等试验方法。高效、灵敏生物活性及比活性等试验方法。为了正确反应生物制品性质与特征，生物制品质量为了正确反应生物制品性质与特征，生物制品质量控制基本方法普通应包含判别试验、杂质检验、安控制基本方法普通应包含判别试验、杂质检验、安全性检验和含量（生物学活性或效价）测定。全性检验和含量（生物学活性或效价）测定。第12页第二节第二节 判别试验判别试验依据生物制品化学结构、理化性质和生物学特点，利依据生物制品化学结构、理化性质和生物学特点，利用用化学法、物理法及生物学方法化学法、物理法及生物学方法进行一些进行一些特殊反应特殊反应，或测定一些或测定一些专属理化常数专属理化常数如紫外吸收系数、等电点、如紫外吸收系数、等电点、电泳迁移率、色谱保留时间和肽图等，来判断与确证电泳迁移率、色谱保留时间和肽图等，来判断与确证产品真伪。产品真伪。需要标准品或对照品在同一条件下进行对照试验。需要标准品或对照品在同一条件下进行对照试验。生物制品判别不是由一项试验就能完成，而是依据其生物制品判别不是由一项试验就能完成，而是依据其特异分子结构和特异分子结构和(或或)其它特征其它特征(包含理化性质和生物包含理化性质和生物学活性等学活性等)设计一组试验来全方面评价一个药品设计一组试验来全方面评价一个药品。第13页一、理化判别法一、理化判别法化学法：化学法：通常利用药品与某试剂在一定条件下反应，通常利用药品与某试剂在一定条件下反应，生成有颜色产物或沉淀进行判别。生成有颜色产物或沉淀进行判别。蛋白质类生物制品蛋白质类生物制品蛋白质变性反应蛋白质变性反应胰蛋白酶胰蛋白酶+对甲苯磺酰对甲苯磺酰-L-精氨酸甲酯盐酸盐精氨酸甲酯盐酸盐紫色紫色胃蛋白酶胃蛋白酶+鞣酸、没食子酸或多数重金属盐溶液鞣酸、没食子酸或多数重金属盐溶液沉淀沉淀紫外分光光度法：紫外分光光度法：蛋白质类生物制品紫外吸收光谱是因为芳香族氨基酸侧链，蛋白质类生物制品紫外吸收光谱是因为芳香族氨基酸侧链，主要是酪氨酸、色氨酸，其次是苯丙氨酸光吸收结果。主要是酪氨酸、色氨酸，其次是苯丙氨酸光吸收结果。对于一个蛋白或多肽分子来说，它最大吸收波长是固定，不对于一个蛋白或多肽分子来说，它最大吸收波长是固定，不一样批次产品紫外光谱图也应该是一致。一样批次产品紫外光谱图也应该是一致。第14页一、理化判别法一、理化判别法高效液相色谱法：高效液相色谱法：基于生物制品供试品溶液和对照品溶液色谱图中基于生物制品供试品溶液和对照品溶液色谱图中主峰主峰保留时间和肽图一致性保留时间和肽图一致性，可用于目标产品判别。可用于目标产品判别。重组人粒细胞集落刺激因子重组人粒细胞集落刺激因子(rhG-CSF)经胰蛋白酶裂解后经胰蛋白酶裂解后RP-HPLC（左）和（左）和CZE（右）肽图经典谱图（右）肽图经典谱图 第15页一、理化判别法一、理化判别法示例：示例：胰岛素判别胰岛素判别 （1）在含量测定项下统计色谱图中，供试品溶）在含量测定项下统计色谱图中，供试品溶液主峰保留时间应与对照品溶液主峰保留时间一液主峰保留时间应与对照品溶液主峰保留时间一致。致。（2）取本品适量，用）取本品适量，用0.1三氟醋酸溶液制成每三氟醋酸溶液制成每lml中含中含10mg溶液，取溶液，取20l，加，加0.2mol/L三羟甲三羟甲基氨基甲烷基氨基甲烷-盐酸缓冲液盐酸缓冲液(pH7.3)20l、0.1V8酶溶液酶溶液20l与水与水140l，混匀，置，混匀，置37水浴水浴2小时小时后，加磷酸后，加磷酸3l，作为供试品溶液；另取胰岛素对，作为供试品溶液；另取胰岛素对照品适量，同法制备，作为对照品溶液。照品适量，同法制备，作为对照品溶液。第16页一、理化判别法一、理化判别法照含量测定项下色谱条件，照含量测定项下色谱条件，以以0.2mol/L硫酸盐缓冲液硫酸盐缓冲液(pH2.3)-乙腈乙腈(90:10)为为流动相流动相A，乙腈，乙腈-水水(50:50)为流动相为流动相B，按右，按右表进行梯度洗脱。取对照表进行梯度洗脱。取对照品溶液和供试品溶液各品溶液和供试品溶液各25l，分别注入液相色谱，分别注入液相色谱仪，统计色谱图，供试品仪，统计色谱图，供试品溶液肽图谱应与对照品溶溶液肽图谱应与对照品溶液肽图谱一致。液肽图谱一致。时间时间（分钟）（分钟）流动相流动相A（%）流动相流动相B（%）0 90 10 60 55 45 70 55 45第17页二、生化判别法二、生化判别法酶法：酶法：利用酶对底物特异性催化活力，能够作为酶类利用酶对底物特异性催化活力，能够作为酶类生物制品简便、快速、灵敏判别方法。生物制品简便、快速、灵敏判别方法。尿激酶判别尿激酶判别：尿激酶尿激酶 用巴比妥用巴比妥-氯化钠缓冲液氯化钠缓冲液(pH7.8)溶解溶解 成成1ml(含含20单单位位)+牛纤维蛋白原牛纤维蛋白原溶液溶液0.3ml 再依次加入再依次加入牛纤维蛋白牛纤维蛋白溶酶原溶酶原溶液溶液0.2ml，牛凝血酶牛凝血酶溶液溶液0.2ml，快速摇匀，快速摇匀，马上置马上置37 0.5恒温水浴恒温水浴中保温，记时，反应系中保温，记时，反应系统应在统应在30s 45s内凝结，且凝块在内凝结，且凝块在15min内重新溶解。内重新溶解。以以0.9氯化钠溶液作空白，同法操作，凝块在氯化钠溶液作空白，同法操作，凝块在2h内不溶。内不溶。第18页二、生化判别法二、生化判别法电泳法：应用电泳技术如等电聚焦电泳、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）等，取得目标产品一致性、同一性电泳图谱和数据，可用于蛋白质类生物制品判别。等电聚焦电泳用于检测蛋白质类生物制品等电点，比如中国药典三部收载重组人干扰素1b、2a、2b和等电点，依法测定，主区带应分别为4.06.5、5.56.8、4.06.7和8.19.1。第19页二、生化判别法二、生化判别法示例：示例：重组人生长激素判别重组人生长激素判别 取本品，加水溶解制成每取本品，加水溶解制成每1ml中含中含1mg溶液，取溶液，取此溶液此溶液90l，加两性电解质，加两性电解质10l和甲基红试液和甲基红试液2l，混匀，作为供试品溶液；另取重组人生长激，混匀，作为供试品溶液；另取重组人生长激素对照品，同法制备，作为对照品溶液。取对照素对照品，同法制备，作为对照品溶液。取对照品溶液和供试品溶液各品溶液和供试品溶液各10l，加至上样孔，照等，加至上样孔，照等电聚焦电泳法（附录电聚焦电泳法（附录 F第六法）试验，供试品第六法）试验，供试品溶液主带位置应与对照品溶液主带位置一致。溶液主带位置应与对照品溶液主带位置一致。第20页三、生物判别法三、生物判别法血清学法血清学法体外抗原抗体试验。抗原抗体反应含有体外抗原抗体试验。抗原抗体反应含有高度特异性，只要一方已知，即可检测高度特异性，只要一方已知，即可检测出另一方。如出另一方。如凝集反应、沉淀反应、中凝集反应、沉淀反应、中和反应和补给结合反应，和反应和补给结合反应，以上四种类型以上四种类型反应即所谓经典血清学反应。反应即所谓经典血清学反应。第21页三、生物判别法三、生物判别法示例：示例：人血白蛋白判别人血白蛋白判别 采取免疫双扩散技术，依法测定（附录 C），供试品仅与抗人血清产生沉淀线，与抗马、抗牛、抗猪、抗羊血清不产生沉淀线。选择免疫电泳技术，依法测定（附录 D），供试品与正常人血清比较，主要沉淀线应为白蛋白。第22页三、生物判别法三、生物判别法生物学法生物学法利用生物体对生物制品特定生物活性反利用生物体对生物制品特定生物活性反应为基础进行供试品判别即为生物学法。应为基础进行供试品判别即为生物学法。第23页三、生物判别法三、生物判别法示例：注射用重组人促红素（CHO细胞）人促红素含有刺激网织红细胞生成生物作用。给小鼠皮下注射供试品后，其血液中网织红细胞数量伴随人促红素注射量增加而升高。所以，中国药典三部收载注射用重组人促红素（CHO细胞），其原液检定依据人促红素独特生物学活性，即采取网织红细胞法。第24页第三节第三节 杂质检验杂质检验生物制品杂质检验可用来判定产品优劣。普通地，只生物制品杂质检验可用来判定产品优劣。普通地，只要在不影响临床疗效及人体健康标准下，药品质量标要在不影响临床疗效及人体健康标准下，药品质量标准能够允许生产过程和贮藏过程中引入微量杂质存在。准能够允许生产过程和贮藏过程中引入微量杂质存在。生物制品来自生物体，生物活性特异性强，制造与纯生物制品来自生物体，生物活性特异性强，制造与纯化工艺复杂，分子结构经常不确定，有时产品成份并化工艺复杂，分子结构经常不确定，有时产品成份并非单一，非单一，极微量杂质可能产生显著效应，极微量杂质可能产生显著效应，所以，生物所以，生物制品杂质检验就显得尤为主要，包括项目也各有特点，制品杂质检验就显得尤为主要，包括项目也各有特点，主要包含普通杂质检验、特殊杂质检验和安全性检验。主要包含普通杂质检验、特殊杂质检验和安全性检验。第25页一、特殊杂质检验一、特殊杂质检验特殊杂质是指药品在生产和贮藏过程中可能引入特有特殊杂质是指药品在生产和贮藏过程中可能引入特有杂质。杂质。特殊杂质检验意义是特殊杂质可能存在毒性会引发安特殊杂质检验意义是特殊杂质可能存在毒性会引发安全性问题；可能影响产品生物学活性和药理作用，或全性问题；可能影响产品生物学活性和药理作用，或使产品变质；也反应产品生产工艺稳定性。使产品变质；也反应产品生产工艺稳定性。生物污染物生物污染物微生物、外源性微生物、外源性DNA等等产品相关杂质产品相关杂质二聚体，多聚体，突变物等二聚体，多聚体，突变物等工艺添加剂工艺添加剂残余抗生素，甲醛，吐温残余抗生素，甲醛，吐温80，曲拉通，曲拉通X-114等等 第26页（一）宿主细胞（菌）蛋白残留量（一）宿主细胞（菌）蛋白残留量 中国药典均采取酶联免疫吸附剂测定法(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)ELISA基础是抗原或抗体固相化及抗原或抗体酶标识。酶标板固相酶标板固相兔抗大肠杆菌菌兔抗大肠杆菌菌体蛋白抗体体蛋白抗体加入供试品加入供试品菌体蛋白与抗体结合菌体蛋白与抗体结合洗涤洗涤加入辣根过氧化酶标加入辣根过氧化酶标识抗体识抗体加入专一性底物，反应后加入专一性底物，反应后测定测定492nm吸光度值吸光度值菌体蛋白菌体蛋白含量含量第27页示例：示例：ELISA法检测大肠杆菌表示系统生产重组制法检测大肠杆菌表示系统生产重组制品中残留菌体蛋白含量品中残留菌体蛋白含量ELISA基础是抗原或抗体固相化及抗原或抗体酶标识。结合基础是抗原或抗体固相化及抗原或抗体酶标识。结合在固相载体表面抗原或抗体仍保持其免疫学活性，酶标识抗在固相载体表面抗原或抗体仍保持其免疫学活性，酶标识抗原或抗体既保留其免疫学活性，又保留酶活性。原或抗体既保留其免疫学活性，又保留酶活性。1、在测定时，受检标本、在测定时，受检标本(测定其中残留菌体蛋白抗原测定其中残留菌体蛋白抗原)与固与固相载体表面兔抗大肠杆菌菌体蛋白抗体起反应；相载体表面兔抗大肠杆菌菌体蛋白抗体起反应；2、经过洗涤使固相载体上形成抗原抗体复合物与液体中其、经过洗涤使固相载体上形成抗原抗体复合物与液体中其它物质分开；它物质分开；3、加入辣根过氧化酶、加入辣根过氧化酶(HRP)标识兔抗大肠杆菌菌体蛋白抗体，标识兔抗大肠杆菌菌体蛋白抗体，也形成抗原抗体复合物而结合在固相载体上。也形成抗原抗体复合物而结合在固相载体上。第28页示例：示例：ELISA法检测大肠杆菌表示系统生产重组制法检测大肠杆菌表示系统生产重组制品中残留菌体蛋白含量品中残留菌体蛋白含量4、所以，固相上酶量与标本中受检物质量呈一定百分比；、所以，固相上酶量与标本中受检物质量呈一定百分比；5、加入酶反应底物后，底物被酶催化成为有色产物，产物量、加入酶反应底物后，底物被酶催化成为有色产物，产物量与标本中受检物质量直接相关；与标本中受检物质量直接相关；6、故可依据呈色深浅进行定性或定量分析。、故可依据呈色深浅进行定性或定量分析。因为酶催化效率很高，间接地放大了免疫反应结果，使宿主因为酶催化效率很高，间接地放大了免疫反应结果，使宿主细胞（菌）残留蛋白测定方法到达很高敏感度，以确保生物细胞（菌）残留蛋白测定方法到达很高敏感度，以确保生物制品安全有效。制品安全有效。第29页详细操作：详细操作：取兔抗大肠杆菌菌体蛋白抗体适量，用包被液溶解并稀释取兔抗大肠杆菌菌体蛋白抗体适量，用包被液溶解并稀释成每成每1ml中含中含l0 g溶液，以溶液，以100 l/孔加至孔加至96孔酶标板内，孔酶标板内，4放置过夜放置过夜(16h 18h)。用洗涤液洗板。用洗涤液洗板3次；用洗涤液制次；用洗涤液制备备1牛血清白蛋白溶液，以牛血清白蛋白溶液，以200 l孔加至板内，孔加至板内，37放放置置2h；将；将封闭好酶标板封闭好酶标板用洗涤液洗板用洗涤液洗板3次；以次；以100 1孔孔加入标准品溶液和供试品溶液，每个稀释度做加入标准品溶液和供试品溶液，每个稀释度做双孔，同时双孔，同时加入两孔空白对照加入两孔空白对照(稀释液稀释液)，37放置放置2h；用稀释液稀释；用稀释液稀释辣根过氧化酶辣根过氧化酶(HRP)标识兔抗大肠杆菌菌体蛋白抗体标识兔抗大肠杆菌菌体蛋白抗体1000倍，以倍，以100 1孔加至板内，孔加至板内，37放置放置1h，用，用洗涤液洗板洗涤液洗板10次次，以，以100 1孔加入底物液，孔加入底物液，37避光放置避光放置40min，以以50 l孔孔加入终止液终止反应加入终止液终止反应。用酶标仪在。用酶标仪在492nm波优波优点测定吸光度，应用计算机分析软件进行读数和数据分析，点测定吸光度，应用计算机分析软件进行读数和数据分析，也可使用手工作图法计算。也可使用手工作图法计算。以标准品溶液吸光度对对应浓度作以标准品溶液吸光度对对应浓度作标准曲线标准曲线，并以供试品，并以供试品溶液吸光度在标准曲线上得到对应菌体蛋白含量。溶液吸光度在标准曲线上得到对应菌体蛋白含量。第30页（二）外源性（二）外源性DNA残留量残留量 伴随生物技术发展以及人们对细菌、病毒和细胞长久伴随生物技术发展以及人们对细菌、病毒和细胞长久研究与不停认识，制造生物制品宿主细胞（菌）残留研究与不停认识，制造生物制品宿主细胞（菌）残留DNA（外源性（外源性DNA）安全性问题逐步清楚，）安全性问题逐步清楚，大样本、大样本、长时间临床试验深入证实生物制品中外源长时间临床试验深入证实生物制品中外源DNA不应该不应该视为一个潜在危险原因，视为一个潜在危险原因，而是作为生物制品中一个不而是作为生物制品中一个不纯、应该去掉杂质成份来对待，为此相关外源性纯、应该去掉杂质成份来对待，为此相关外源性DNA限量要求也随之放宽。限量要求也随之放宽。外源性外源性DNA测定方法当前主要有三种，即测定方法当前主要有三种，即分子杂交分子杂交（Hybridization）技术）技术、基于基于DNA结合蛋白结合蛋白(Threshold)分析系统分析系统和和实时定量实时定量PCR（Q-PCR）方）方法法。第31页生物制品中外源性生物制品中外源性DNA残留检测方法比较残留检测方法比较HybridizationThresholdQ-PCR特异性特异性物种特异性物种特异性无特异性无特异性序列特异性序列特异性检测最小序列长度(bp)50600150抗干扰性和稳定性抗干扰性和稳定性+所需时间（所需时间（h）4862灵敏度（灵敏度（pg）10630560000第32页（三）产品相关杂质（三）产品相关杂质 产品相关杂质是生物制品在生产制造、分离纯化和贮产品相关杂质是生物制品在生产制造、分离纯化和贮藏保留过程中产生与产品结构类似同系物、异构体、藏保留过程中产生与产品结构类似同系物、异构体、突变物、氧化物、聚合体和降解产物等。突变物、氧化物、聚合体和降解产物等。产品相关杂质在生物制品中可能被认为是活性成份，产品相关杂质在生物制品中可能被认为是活性成份，而且经验表明许多产品相关杂质是均匀和非免疫原性，而且经验表明许多产品相关杂质是均匀和非免疫原性，但因为生物效应没有经过严格安全性试验研究，应制但因为生物效应没有经过严格安全性试验研究，应制订允许程度加以控制。订允许程度加以控制。惯用分离测定方法有高效液相色谱法和电泳法。惯用分离测定方法有高效液相色谱法和电泳法。第33页示例：重组人生长激素产品中高分子蛋白质示例：重组人生长激素产品中高分子蛋白质 取本品适量，用取本品适量，用0.025mol/L磷酸盐缓冲液（磷酸盐缓冲液（pH7.0）制成）制成每每1ml中含重组人生长激素中含重组人生长激素1.0mg溶液，作为供试品溶液；溶液，作为供试品溶液；另取重组人生长激素对照品适量，同法制备，作为对照品另取重组人生长激素对照品适量，同法制备，作为对照品溶液。溶液。照照分子排阻色谱法测定分子排阻色谱法测定，以适合分离，以适合分离分子量为分子量为5000 60000球状蛋白色谱用亲水硅胶为填充剂球状蛋白色谱用亲水硅胶为填充剂；异丙醇；异丙醇-0.063mol/L磷酸盐缓冲液（无水磷酸氢二钠磷酸盐缓冲液（无水磷酸氢二钠5.18g，磷，磷酸二氢钠酸二氢钠3.65g，加水，加水950ml，用，用85%磷酸溶液调整磷酸溶液调整pH值值至至7.0，加水至，加水至1000ml）（）（397）为流动相；流速为每）为流动相；流速为每分钟分钟0.6ml；检测波长为；检测波长为214nm。第34页取重组人生长激素单体与二聚体混合物对照品，用取重组人生长激素单体与二聚体混合物对照品，用0.025mol/L磷酸盐缓冲液（磷酸盐缓冲液（pH7.0）（取）（取0.063 mol/L 磷酸盐缓冲液磷酸盐缓冲液12.5）制成每）制成每1ml中含中含1.0mg溶液，取溶液，取20l注入液相色谱仪，重组人生长注入液相色谱仪，重组人生长激素单体与二聚体分离度应符合要求。激素单体与二聚体分离度应符合要求。取供试品溶液取供试品溶液20l注入液相色谱仪，统计色谱图，注入液相色谱仪，统计色谱图，按按面积归一化法计算，高分子蛋白质含量不得过面积归一化法计算，高分子蛋白质含量不得过4.0%。第35页（四）残余抗生素（四）残余抗生素 对于生物制品制造工艺，标准上不主张使用抗生素。比如中国药典三部收载注射用重组人干扰素2a（酵母）和注射用重组人促红素（CHO细胞）产品生产各个步骤均严格限制抗生素使用，故产品检定包含原液、半成品、成品无须检验残余抗生素活性。假如生物制品在生产过程中使用了抗生素，则不但要在纯化工艺中去除，而且要在原液检定中增加残余抗生素活性检测项目。依据中国药典三部附录A抗生素残留量检验法能够检测残余氨苄西林或四环素活性。该法系依据在琼脂培养基内抗生素对微生物抑制作用，比较对照品与供试品对接种试验菌产生抑菌圈大小，检验供试品中氨苄西林或四环素残留量。第36页二、安全性检验二、安全性检验来自生物体生物制品因为本身独特大分子结构、高效生物活性以及制造、纯化、贮藏过程带来潜在危险原因，使安全性检验成为生物制品质量标准中一个必不可少检验项目，是确保临床用药安全、有效主要指标。中国药典()对于生物制品安全性检验主要项目包含以下几个方面：无菌检验法、热原检验、细菌内毒素检验、异常毒性检验法、支原体检验法、病毒外源因子检验法、微生物检验法和鼠源性病毒检验法。第37页第四节第四节 含量（效价）测定含量（效价）测定理化分析法、生化测定法和生物检定法理化分析法、生化测定法和生物检定法定量表征生物制品方法通常有两种：定量表征生物制品方法通常有两种：用百分含量表示用百分含量表示，适合用于成份已知、结构明，适合用于成份已知、结构明确生物制品确生物制品用生物效价或酶活力单位表示用生物效价或酶活力单位表示，适合用于大多，适合用于大多数酶类和蛋白质类生物制品数酶类和蛋白质类生物制品 第38页一、理化分析法 滴定法：滴定法：示例：示例：胰酶中胰淀粉酶测定胰酶中胰淀粉酶测定 利用氧化还原反应，利用氧化还原反应，以以1可溶性淀粉溶液为底物，经胰可溶性淀粉溶液为底物，经胰淀粉酶水解后产生还原糖，淀粉酶水解后产生还原糖，在碱性溶液中过量碘滴定液在碱性溶液中过量碘滴定液氧化生成还原糖，而剩下碘滴定液用硫代硫酸钠滴定液氧化生成还原糖，而剩下碘滴定液用硫代硫酸钠滴定液滴定至无色。依据每滴定至无色。依据每1ml碘滴定液（碘滴定液（0.05 mol/L）相当于）相当于9.008mg无水葡萄糖滴定度来推算还原糖含量，进而求无水葡萄糖滴定度来推算还原糖含量，进而求得每得每1g胰酶中含胰淀粉酶活力（单位）。胰酶中含胰淀粉酶活力（单位）。第39页一、理化分析法一、理化分析法光谱法：蛋白质制品含量测定，既能够依据在280nm左右有最大吸收直接测定，也能够利用蛋白质与双缩脲试剂发生颜色反应而进行含量测定，选择依据取决于测定方法专属性、稳定性和简便性。中国药典二部收载胰蛋白酶效价测定是基于酶活力选择性和底物产物光谱特征，即依据胰蛋白酶与底物N-苯甲酰-L-精氨酸乙酯作用后生成产物在253nm处吸收度值改变来进行胰蛋白酶效价测定。第40页一、理化分析法一、理化分析法高效液相色谱法：高效液相色谱法：反相高效液相色谱法反相高效液相色谱法测定重组人胰岛素含量测定重组人胰岛素含量 取本品适量，精密称定，用取本品适量，精密称定，用0.01mol/L盐酸溶液盐酸溶液定量稀释至每定量稀释至每1ml中约含中约含10单位溶液（临用新配）单位溶液（临用新配）。精密量取。精密量取20 l注入液相色谱仪，统计色谱图；注入液相色谱仪，统计色谱图；另取重组人胰岛素对照品适量，同法测定。按外另取重组人胰岛素对照品适量，同法测定。按外标法以人胰岛素峰面积计算，即得。标法以人胰岛素峰面积计算，即得。第41页分子排阻色谱法（分子排阻色谱法（size-exclusion chromatography，SEC）也称凝胶色谱法（也称凝胶色谱法（gel chromatography），是），是快速分离不一样分子量混合物色谱方法，广泛应快速分离不一样分子量混合物色谱方法，广泛应用于多肽和蛋白质等生物制品分离分析及其分子用于多肽和蛋白质等生物制品分离分析及其分子量测定。量测定。分子排阻色谱柱惯用固定相是分子排阻色谱柱惯用固定相是亲水性有机凝胶亲水性有机凝胶（如葡萄糖、琼脂糖、聚丙烯酰胺等）、硅胶或（如葡萄糖、琼脂糖、聚丙烯酰胺等）、硅胶或改性硅胶，流动相是能够溶解样品低黏度缓冲溶改性硅胶，流动相是能够溶解样品低黏度缓冲溶液或有机溶剂液或有机溶剂-缓冲液混合溶液等。缓冲液混合溶液等。第42页分子排阻法应用特点分子排阻法应用特点（1）生物活性蛋白质能够回收制备。）生物活性蛋白质能够回收制备。（2）色谱分离是在固定百分比水溶液体系中进行。）色谱分离是在固定百分比水溶液体系中进行。（3）色谱分离是依据蛋白质或多肽在溶液中对应有效）色谱分离是依据蛋白质或多肽在溶液中对应有效粒径而进行。粒径而进行。（4）分子排阻色谱法峰容量有限，在整个色谱图上普）分子排阻色谱法峰容量有限，在整个色谱图上普通只能容纳通只能容纳10 12个色谱峰，分离度低。个色谱峰，分离度低。第43页一、理化分析法一、理化分析法示例：示例：分子排阻色谱法测定重组人生长激分子排阻色谱法测定重组人生长激素含量素含量1、照分子排阻色谱法测定，以适合分离分子量、照分子排阻色谱法测定，以适合分离分子量为为5000 60 000球状蛋白色谱用亲水硅胶为填充球状蛋白色谱用亲水硅胶为填充剂；以异丙醇剂；以异丙醇-0.063mol/L磷酸盐缓冲液（无水磷酸盐缓冲液（无水磷酸氢二钠磷酸氢二钠5.18g，磷酸二氢钠，磷酸二氢钠3.65g，加水，加水950ml，用，用85%磷酸溶液调整磷酸溶液调整pH值至值至7.0，加水，加水至至1000ml）（）（397）为流动相；流速为每分钟）为流动相；流速为每分钟0.6ml；检测波长为；检测波长为214nm。第44页一、理化分析法一、理化分析法2、取人生长激素单体与二聚体混合物对照品，、取人生长激素单体与二聚体混合物对照品，用用0.025mol/L磷酸盐缓冲液（磷酸盐缓冲液（pH7.0）（取）（取0.063mol/L磷酸盐缓冲液磷酸盐缓冲液12.5）制成每）制成每1ml中中含含1.0mg溶液，取溶液，取20l注入液相色谱仪，重组人注入液相色谱仪，重组人生长激素单体与二聚体分离度应符合要求。生长激素单体与二聚体分离度应符合要求。3、取本品，用、取本品，用0.025mol/L磷酸盐缓冲液磷酸盐缓冲液（pH7.0）溶解并定量稀释制成每）溶解并定量稀释制成每1ml中含中含1.0mg溶液，精密量取溶液，精密量取20l注入色谱仪，统计色谱图；注入色谱仪，统计色谱图；另取重组人生长激素对照品，同法测定。按外标另取重组人生长激素对照品，同法测定。按外标法以峰面积计算，即得。法以峰面积计算，即得。第45页二、生化分析法二、生化分析法（一）电泳法（一）电泳法 醋酸纤维素薄膜电泳法醋酸纤维素薄膜电泳法 琼脂糖凝胶电泳法琼脂糖凝胶电泳法 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法聚丙烯酰胺凝胶电泳法 毛细管电泳法毛细管电泳法 第46页示例：重组人胰岛素及其相关物质毛细管区带示例：重组人胰岛素及其相关物质毛细管区带电泳分析电泳分析 亲水性多肽、蛋白质成份在反相色谱柱上保留较差，亲水性多肽、蛋白质成份在反相色谱柱上保留较差，且疏水性相同或相近多肽、蛋白质成份采取普通且疏水性相同或相近多肽、蛋白质成份采取普通RP-HPLC条件不易分离条件不易分离 电泳条件电泳条件 石英毛细管柱石英毛细管柱(Beckman)75 m 57 cm，有效，有效长度长度50 cm；电极缓冲液；电极缓冲液 0.05 mol/L 醋酸钠醋酸钠-0.85 mol/L 2-环己胺基乙磺酸环己胺基乙磺酸-10%乙腈。每次进样前，依次用乙腈。每次进样前，依次用0.1 mol/L氢氧化钠溶液、电极缓冲液清洗毛细管柱氢氧化钠溶液、电极缓冲液清洗毛细管柱3 min；压力进样压力进样6 s，进样后再进，进样后再进5 s电极缓冲液；分离电压电极缓冲液；分离电压16 kV；检测波长；检测波长214 nm，柱温，柱温30。在上述电泳条件下进。在上述电泳条件下进行对照品溶液、供试品溶液行对照品溶液、供试品溶液CZE法分析法分析。第47页 重组人胰岛素及其相关重组人胰岛素及其相关物质毛细管区带电泳分物质毛细管区带电泳分析经典谱图析经典谱图1.苯酚苯酚 2.重组人胰岛素重组人胰岛素 3.相关物质相关物质 注射剂样品测定结果（标示量，注射剂样品测定结果（标示量，n=3）注射剂批号CZE法（RSD%）RP-HPLC法（RSD%）97052298.1（0.76）97.4（0.42）97053097.6（0.72）97.6（0.22）97063098.1（0.36）98.1（0.33）第48页（二）酶分析法（二）酶分析法 以酶为分析对象，目标在于测定样品中某种酶含量以酶为分析对象，目标在于测定样品中某种酶含量或活性或活性“酶活力测定酶活力测定”以酶为分析工具或分析试剂，主要用以测定样品中以酶为分析工具或分析试剂，主要用以测定样品中酶以外其它物质含量酶以外其它物质含量“酶法分析酶法分析”以酶能专一而高效地催化某化学反应为基础，以酶能专一而高效地催化某化学反应为基础，经过对酶反应速度测定或对底物、生成物等经过对酶反应速度测定或对底物、生成物等浓度测定而检测对应物质含量。浓度测定而检测对应物质含量。第49页酶反应速度能够用单位时间反应底物降低或产物增加来酶反应速度能够用单位时间反应底物降低或产物增加来表示，酶反应速度愈快则表示酶活力愈高。表示，酶反应速度愈快则表示酶活力愈高。酶活性单位（国际单位酶活性单位（国际单位IU）：是指在：是指在25下，以最适宜底物