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生化试验技术专题生化试验技术专题 主要内容和要求：以蛋白质分离纯化为例主要内容和要求：以蛋白质分离纯化为例介绍生物大分子分离纯化普通步骤和注意事项；介绍生物大分子分离纯化普通步骤和注意事项；介绍层析技术、电泳技术、离心技术原理及其介绍层析技术、电泳技术、离心技术原理及其应用；总结蛋白质、核酸、酶、氨基酸测定主应用；总结蛋白质、核酸、酶、氨基酸测定主要方法要方法。探生科技旗下Fantibody电子商务编辑部第1页相关帮助bb需要相关抗体试剂能够访问需要相关抗体试剂能够访问FantibodyFantibody全球抗体搜索引擎全球抗体搜索引擎bbfantibodyfantibody全球抗体搜索引擎是一个供公共检索抗体数据库，其抗全球抗体搜索引擎是一个供公共检索抗体数据库，其抗体信息数据起源于全球范围研究机构与商业企业。该引擎由商品体信息数据起源于全球范围研究机构与商业企业。该引擎由商品化抗体数据库与抗体应用评价数据库两部分组成，以帮助研究者化抗体数据库与抗体应用评价数据库两部分组成，以帮助研究者更高效寻找并评定该抗体性能。全球抗体搜索引擎是继基因与蛋更高效寻找并评定该抗体性能。全球抗体搜索引擎是继基因与蛋白数据库之后更为复杂应用型检索平台，网址：白数据库之后更为复杂应用型检索平台，网址：http:/http:/bb需要相关试验室仪器设备、生物试剂、医疗器械、制药设备、医需要相关试验室仪器设备、生物试剂、医疗器械、制药设备、医药原料、体外诊疗试剂及耗材与技术服务信息，能够访问探生网药原料、体外诊疗试剂及耗材与技术服务信息，能够访问探生网进行咨询，期待您加入：进行咨询，期待您加入：http:/http:/第2页目录第一节第一节 生物大分子物质制备生物大分子物质制备第二节第二节 几个主要生物化学试验技术几个主要生物化学试验技术第三节第三节 生物分子检测生物分子检测第3页第一节第一节 生物大分子物质制备生物大分子物质制备一一普通过程普通过程二二注意事项注意事项三纯化方案设计和评价三纯化方案设计和评价例：例：宇佐美曲霉宇佐美曲霉537酸性蛋白酶纯化酸性蛋白酶纯化材料选择和处理材料选择和处理确立测定方法确立测定方法细胞破碎细胞破碎有效成份抽提有效成份抽提有效成份浓缩有效成份浓缩第4页生物大分子分离纯化普通步骤生物大分子分离纯化普通步骤生物大分子分离纯化普通步骤生物大分子分离纯化普通步骤层析法层析法 电泳法电泳法 超离心法超离心法 超滤超滤盐析盐析（硫酸铵盐析硫酸铵盐析）等点电沉淀等点电沉淀有机溶剂沉淀有机溶剂沉淀透析透析前处理前处理 粗分级粗分级 细分级细分级 材料选择与处理材料选择与处理细胞破碎（机械破细胞破碎（机械破碎、溶账和自溶、碎、溶账和自溶、酶解、化学处理）酶解、化学处理）生物组织生物组织无细胞提取液无细胞提取液粗产品粗产品结晶结晶第5页几个主要沉淀方法比较几个主要沉淀方法比较几个主要沉淀方法比较几个主要沉淀方法比较第6页调整硫酸铵溶液饱和度计算表调整硫酸铵溶液饱和度计算表第7页注意事项注意事项1控制适当控制适当pH2控制低温控制低温3注意提取过程中溶液环境注意提取过程中溶液环境4预防提纯过程中丟失一些辅助因子或亚基预防提纯过程中丟失一些辅助因子或亚基第8页宇佐美曲霉宇佐美曲霉537酸性蛋白酶纯化酸性蛋白酶纯化 纯化步骤纯化步骤 总蛋白总蛋白 总活力总活力 比活力比活力 纯化倍数纯化倍数 回收率回收率 （mg）（U）（U/mg蛋白）蛋白）（%）1、粗酶液、粗酶液 80 4320 54 1 1002、乙醇沉淀、乙醇沉淀 29 3585 123 2.27 833、醋酸钙沉淀、醋酸钙沉淀 21 2980 141 2.64 694、盐析、盐析 4 1771 464 8.52 415、丙酮沉淀、丙酮沉淀 1 1166 1104 20.29 276、结晶、结晶 0.12 130 1072 19.70 3第9页第二节第二节 几个主要生物化学试验技术几个主要生物化学试验技术一、一、层析技术层析技术二二、电泳技术电泳技术三三 、离心技术离心技术第10页一层析技术（一层析技术（chromatographychromatography）1层析技术普通原理层析技术普通原理2层析技术分类及应用层析技术分类及应用第11页层析技术原理层析技术原理 层层析析技技术术是是一一个个物物理理分分离离方方法法。不不论论何何种种层层析析，其其系系统统通通常常由由互互不不相相溶溶两两个个相相组组成成：一一是是固固定定相相（固固体体或或吸吸附附在在固固体体上上液液体体），一一是是流流动动相相（液液体体或或气气体体）。层层析析时时，利利用用混混合合物物中中各各组组分分理理化化性性质质（如如吸吸附附力力、分分子子形形状状和和大大小小、分分子子极极性性、分分子子亲亲和和力力、溶溶解解度度等等）差差异异，使使各各组组分分不不一一样样程程度度地地分分布布在在两两相相中中，伴伴随随流流动动相相从从固固定定相相上上流流过过，不不一一样样组组分分以以不不一一样样速速度度移动而最终被分离。移动而最终被分离。样品在层析时移动速度可用迁移率样品在层析时移动速度可用迁移率RfRf值表示：值表示：样品原点到斑点中心距离样品原点到斑点中心距离 RfRf=样品原点到溶剂前沿距离样品原点到溶剂前沿距离第12页层析法分类（按装置分类层析法分类（按装置分类 ）纸层析纸层析 薄膜层析薄膜层析 柱层析柱层析洗脱液洗脱液样品样品填充物填充物分部搜集分部搜集玻璃柱玻璃柱第13页氨基酸分析仪图解缓冲液泵缓冲液泵显色反显色反应管应管茚三酮泵茚三酮泵已分开氨已分开氨基酸基酸离子交换柱离子交换柱样品注入口样品注入口统计仪统计仪光电倍光电倍增管增管光源光源第14页层析法层析法分类分类及原理（按分离原理分类及原理（按分离原理分类 ）吸附层析吸附层析分配层析分配层析凝胶过滤凝胶过滤（分子筛层析）（分子筛层析）离子交换层析离子交换层析亲和层析亲和层析 聚焦层析聚焦层析第15页各类层析原理和载体各类层析原理和载体类别类别 分离原理分离原理 基质或载体基质或载体吸附层析吸附层析 化学、物理吸附化学、物理吸附 硅胶、氧化铝硅胶、氧化铝、羟基磷酸、羟基磷酸分配层析分配层析 两溶剂相中溶解效应两溶剂相中溶解效应 纤维素、硅藻土纤维素、硅藻土、硅胶、硅胶凝胶层析凝胶层析 分子筛效应排阻效应分子筛效应排阻效应 sepharose 、sephadex离子交换层析离子交换层析 离子基团交换反应离子基团交换反应 离子交换树脂离子交换树脂 、纤维素、纤维素、葡聚糖葡聚糖亲和层析亲和层析 分离物与配体之间有分离物与配体之间有 带配基带配基sepharose 特殊亲和力特殊亲和力 或或sephadex聚焦层析聚焦层析 等电点和离子交换作用等电点和离子交换作用 多缓冲交换剂（与带有各种电多缓冲交换剂（与带有各种电 荷基团配体相偶联荷基团配体相偶联 sepharose 6B）第16页吸附层析吸附层析（absorption chromatographyabsorption chromatography）原理：原理：以吸附剂作为固定相，选择适以吸附剂作为固定相，选择适当溶剂作流动相。因为各种物质极当溶剂作流动相。因为各种物质极性不一样，被吸附剂吸附程度和在性不一样，被吸附剂吸附程度和在流动相中溶解度不一样。层析时，流动相中溶解度不一样。层析时，当流动相从固定相上流过时，各组当流动相从固定相上流过时，各组分也就不一样程度地被溶解（解吸）分也就不一样程度地被溶解（解吸），然后又再被吸附、再溶解再吸附，然后又再被吸附、再溶解再吸附，从而以不一样速度随流动相向前移从而以不一样速度随流动相向前移动。动。载体载体：硅胶硅胶 氧化铝氧化铝 羟基磷石灰羟基磷石灰应应用用：分分离离纯纯化化蛋蛋白白质质、酶酶、氨氨基基酸酸、核核苷苷酸酸 等生化物质等生化物质第17页分配层析分配层析原理：原理：分配层析实际上是一个连续抽提方式。分配层析实际上是一个连续抽提方式。如纸层析中滤纸结合水为固定相，以水饱如纸层析中滤纸结合水为固定相，以水饱和有机溶剂为流动相（展开剂）。当流动和有机溶剂为流动相（展开剂）。当流动相沿滤纸经过样品点时，样品点中溶质在相沿滤纸经过样品点时，样品点中溶质在水和有机相中溶解度不一样而不均匀地分水和有机相中溶解度不一样而不均匀地分配在两相中，各种组分按其各自分配系数配在两相中，各种组分按其各自分配系数进行不停分配，从而使物质得到分离和纯进行不停分配，从而使物质得到分离和纯化。化。载体载体：纤维素纤维素 硅藻土硅藻土 硅胶硅胶应用：各种生化物质分离判定应用：各种生化物质分离判定第18页分子筛层析分子筛层析（gel-filtration gel-filtration chromatographychromatography）原理原理基质基质 葡聚糖凝胶（葡聚糖凝胶（sephadex）琼脂糖凝胶（琼脂糖凝胶（sepharose）应用应用 测定分子量测定分子量 脱盐和浓缩脱盐和浓缩 分离提纯生物大分子分离提纯生物大分子 除去热原物质除去热原物质第19页离子交换层析离子交换层析（ion-change chromatographyion-change chromatography）原理原理基质基质 疏水型离子交换剂；亲水型离子交换剂疏水型离子交换剂；亲水型离子交换剂应用应用 制备纯化生物物质制备纯化生物物质 定量、定性测定混合物中各组分定量、定性测定混合物中各组分1.平衡阶段平衡阶段:离子交换剂离子交换剂与反离子结合与反离子结合2.吸附阶段：样品与反离吸附阶段：样品与反离子进行交换子进行交换3、4.解吸附阶段：用解吸附阶段：用梯度缓冲溶液洗脱，先梯度缓冲溶液洗脱，先洗下弱吸附物质，后洗洗下弱吸附物质，后洗下强吸附物质下强吸附物质5.再生阶段：用原始平再生阶段：用原始平衡液进行充分洗涤，既衡液进行充分洗涤，既可重复使用可重复使用12345原始缓冲溶原始缓冲溶液反离子液反离子样品溶液样品溶液梯度浓度梯度浓度第20页亲和层析亲和层析（affiuity chromatographyaffiuity chromatography）应用应用 分离纯化酶、分离纯化酶、抗原、抗体抗原、抗体 分离纯化核酸分离纯化核酸 研究酶结构与功效研究酶结构与功效+待纯化分子待纯化分子配体配体a.待纯化分子和配体间含有亲和性待纯化分子和配体间含有亲和性+基质基质b.活性基质与配体结合产生亲和吸附剂活性基质与配体结合产生亲和吸附剂+杂质杂质c.待纯化分子与亲和吸附剂结合，与杂质分离待纯化分子与亲和吸附剂结合，与杂质分离+d.偶联复合物经解离后，得到纯待纯化分子偶联复合物经解离后，得到纯待纯化分子原理：原理：基质基质 纤维素、聚丙烯酰胺凝胶、纤维素、聚丙烯酰胺凝胶、sepharose、sephadex第21页聚焦层析（聚焦层析（ChromatofocusingChromatofocusing）该法是在等电点聚焦方法基础上发展起来，其分离纯化蛋白质依据是该法是在等电点聚焦方法基础上发展起来，其分离纯化蛋白质依据是等电点差异和离子交换行为。蛋白质按其等电点在等电点差异和离子交换行为。蛋白质按其等电点在pH梯度环境中进行排列梯度环境中进行排列过程叫做聚焦效应。过程叫做聚焦效应。pH梯度形成梯度形成(由多缓冲剂和多缓冲交换剂形成由多缓冲剂和多缓冲交换剂形成)是聚焦是聚焦效应先决条件，假如一个蛋白质加到已形成效应先决条件，假如一个蛋白质加到已形成pH梯度层析柱上时，因为洗脱梯度层析柱上时，因为洗脱液连续流动，蛋白质将快速地液连续流动，蛋白质将快速地 迁移到与它等电点相同迁移到与它等电点相同pH处。从此位置开始，处。从此位置开始，该蛋白质将以迟缓速度进行吸附、解吸附，直到在等电点该蛋白质将以迟缓速度进行吸附、解吸附，直到在等电点pH时被洗出。在时被洗出。在聚焦层析过程中，一个样品分次加入时，只要先加入者还未洗出，而且有一聚焦层析过程中，一个样品分次加入时，只要先加入者还未洗出，而且有一定时间进行聚焦，剩下样品还能够加到柱上，其聚焦过程都能顺利完成。定时间进行聚焦，剩下样品还能够加到柱上，其聚焦过程都能顺利完成。层析时聚焦效应示意图层析时聚焦效应示意图pH梯度溶液形成示意图梯度溶液形成示意图蛋白质蛋白质1（pI=7）蛋白质蛋白质2（pI=8）流速流速移动速率移动速率第22页几个主要层析方法比较几个主要层析方法比较几个主要层析方法比较几个主要层析方法比较第23页二二 、电泳技术电泳技术 1电泳普通原理电泳普通原理 2.电泳技术类别电泳技术类别、原理及应用、原理及应用第24页电泳普通原理电泳普通原理 电电泳泳是是带带电电颗颗粒粒在在电电场场作作用用下下向向着着与与其其电电荷荷相相反反电电极极移移动动现现象象 。许许多多生生物物分分子子都都带带有有电电荷荷，其其电电荷荷多多少少取取决决于于分分子子组组成成、性性质质及及其其所所在在介介质质pHpH。假假如如混混合合物物中中各各组组分分结结构构组组成成不不一一样样，在在某某一一pHpH溶溶液液中中，各各组组分分所所带带电电荷荷性性质质、电电荷荷数数量量不不一一样样，加加之之其其分分子子量量不不一一样样，在在同同一一电电场场作作用用下下，各各组组分泳动方向和速度也各异，而到达分离判定各组分目标。分泳动方向和速度也各异，而到达分离判定各组分目标。第25页电泳技术分类（按试验装置分类）电泳技术分类（按试验装置分类）纸电泳纸电泳 薄膜电泳薄膜电泳 凝胶电泳凝胶电泳 毛细管电泳毛细管电泳垂直板凝胶电泳垂直板凝胶电泳毛细管电泳毛细管电泳第26页惯用电泳技术惯用电泳技术1、醋酸纤维薄膜电泳、醋酸纤维薄膜电泳2、聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳（polyacrylamide gel electrophoresis,PAGE）3、SDS-PAGE4、PAGE等电点聚焦等电点聚焦 3、琼脂糖电泳、琼脂糖电泳 4、毛细管电泳毛细管电泳第27页聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGEPAGE）凝胶聚合反应及催化系统凝胶聚合反应及催化系统 不连续不连续PAGE 可产生三种效应：可产生三种效应：电荷效应、电荷效应、分子筛分子筛 效应、效应、浓缩效应浓缩效应第28页SDS-PAGESDS-PAGE原理：原理：当当SDSSDS（Sodium Dodecyl SulfateSodium Dodecyl Sulfate）与蛋白质结合后，蛋白质分子）与蛋白质结合后，蛋白质分子即带有大量负电荷，并远远超出了其原来电荷，从而使天然蛋白质分子即带有大量负电荷，并远远超出了其原来电荷，从而使天然蛋白质分子间电荷差异就降低乃至消除了。与此同时蛋白质在间电荷差异就降低乃至消除了。与此同时蛋白质在SDSSDS作用下结构变得作用下结构变得涣散，形状趋向一致，所以各种涣散，形状趋向一致，所以各种SDS-SDS-蛋白质复合物在电泳时产生泳动蛋白质复合物在电泳时产生泳动率差异，就反应了分子量差异。在此条件下，样品分子量对数与其在凝率差异，就反应了分子量差异。在此条件下，样品分子量对数与其在凝胶中迁移率呈直线关系。可用下式表示：胶中迁移率呈直线关系。可用下式表示：Log M=a b应用应用:测定蛋白质分子量测定蛋白质分子量 测定蛋白质亚基数测定蛋白质亚基数第29页等电点聚焦（等电点聚焦（isoelectric focusingisoelectric focusing）原理原理:在在一一定定抗抗对对流流介介质质（如如凝凝胶胶）中中加加入入两两性性电电解解质质载载体体(Ampholyte,是是一一个个多多氨氨基基多多羧羧基基混混合合物物，由由异异构构物物和和同同系系物物组组成成，其其pK和和pI值值各各自自相相异异却却又又相相近近），当当直直流流电电经经过过时时，便便形形成成一一个个由由阳阳极极到到阴阴极极pH值值逐逐步步上上升升梯梯度度。两两性性化化合合物物在在此此电电泳泳过过程程中中，就就被被浓浓集集在在与与其其等等电电点点相相等等pH区域，从而使不一样化合物能按其各自等电点得到分离。区域，从而使不一样化合物能按其各自等电点得到分离。应用：应用：高效率分离纯化蛋白质高效率分离纯化蛋白质 测定蛋白质分子量测定蛋白质分子量第30页免疫电泳免疫电泳immunoelectrophoresisimmunoelectrophoresis 微量多槽免疫电泳微量多槽免疫电泳 火箭免疫电泳火箭免疫电泳第31页毛细管电泳毛细管电泳 毛毛细细管管电电泳泳又又称称毛毛细细管管区区带带电电泳泳，它它是是在在毛毛细细管管（2-2-75m75m）中中装装入入缓缓冲冲液液，从从其其一一端端注注入入样样品品，在在毛毛细细管管两两端端加加高高压压直直流流电电实实现现对对样样品品分分离离，分分离离后后样样品品依依次次经经过过设设在在毛毛细细管管一一端端检检测测器器检检出出。该该法法克克服服了了传传统统区区带带电电泳泳热热扩扩散散和样品扩散问题，实现了快速和高效分离。和样品扩散问题，实现了快速和高效分离。毛细管电泳是近年来发展起来一项新技术，被认为是毛细管电泳是近年来发展起来一项新技术，被认为是9090年代最有影响分离伎俩之一。当前已广泛用于氨基酸分析、年代最有影响分离伎俩之一。当前已广泛用于氨基酸分析、蛋白质高效分离、指纹图谱研究、分离合成寡核苷酸、蛋白质高效分离、指纹图谱研究、分离合成寡核苷酸、DNADNA序列测定序列测定及及PCRPCR产物分析判定等。产物分析判定等。第32页毛细管电泳装置示意图毛细管电泳装置示意图高压电源高压电源光源光源光电倍光电倍增管增管数据采集数据采集毛细管毛细管缓冲液缓冲液-样品样品缓冲液缓冲液第33页三、三、离心技术离心技术1离心机类别离心机类别 普通离心机普通离心机 6000转转/分分 高速离心机高速离心机 2-3万转万转/分分 超速离心机超速离心机 3万转万转/分分2沉降系数（沉降系数（S）概念概念3超离心法类别超离心法类别 沉降速度法（沉降速度法（sedimentation velocity）沉降平恒法（沉降平恒法（sedimentation eguilibrium）第34页超速离心机工作原理图解光光源源转转轴轴转转头头样样品品池池光学光学系统系统液液面面沉降沉降界面界面沉降沉降物质物质平平衡衡池池沉降界沉降界面峰面峰浓度对距离图谱浓度对距离图谱第35页沉降系数（沉降系数（S）生生物物大大分分子子在在单单位位离离心心力力场场作作用用下下沉沉降降速速度度称称为为沉沉降降系系数数。即即沉沉降降系系数数是是微微颗颗粒粒在在离离心心力力场场作作用用下下，从从静静止止状状态态抵抵达达极极限限速速度度所所需需要要时时间间。其其单单位位用用SvedbergSvedberg，即即S S表示，表示，S=110S=110-13-13秒。秒。沉降系数（沉降系数（S S）与分子量（）与分子量（M M）关系）关系M=RTSD(1-)Svederg方程方程:第36页生物分子检测生物分子检测1、蛋白质测定、蛋白质测定 凯氏定氮法（凯氏定氮法（含含N量量 6.25）双缩脲法、双缩脲法、Folin-酚法酚法 紫外光度法（紫外光度法（max=280nm）离心沉降法、电泳法、层析法离心沉降法、电泳法、层析法2、酶活力测定、酶活力测定 终点法、动力学法终点法、动力学法3、氨基酸测定、氨基酸测定 茚三酮法茚三酮法 Sangerf法、法、Edmam法、法、DNS法法4、核酸测定、核酸测定 紫外光度法（紫外光度法（max=260nm）分子杂交法分子杂交法 离心沉降法、电泳法离心沉降法、电泳法第37页