基于质粒的轮状病毒反向遗传学研究进展_刘夏飞.pdf

病 毒 学 报CHINESE JOURNAL OF VIROLOGYVol.39No.2March 2023第 39 卷 第 2 期 2 0 2 3 年 3 月基于质粒的轮状病毒反向遗传学研究进展刘夏飞，段招军*（中国疾病预防控制中心 病毒病预防控制所，北京 102206）摘要：轮状病毒是全球范围内引起婴幼儿急性胃肠炎的最主要病原体，2016年导致的儿童死亡病例为 228047例，每年导致的住院病例则高达 200万例。轮状病毒属于呼肠孤病毒科，基因组由 11条分节段的双链 RNA（dsRNA）组成，被三层衣壳包裹。病毒反向遗传学技术的建立加快了病毒学的研究。2017 年，完全依赖质粒的轮状病毒反向遗传学技术获得突破，随后在轮状病毒致病机制、疫苗研发、载体构建等方面取得重要进展。本文将就此技术的建立、发展和应用进行综述，供相关领域人员参考，以期加快我国轮状病毒的研究和应用，推动我国轮状病毒急性胃肠炎的预防和控制。关键词：轮状病毒；依赖质粒；反向遗传学中图分类号：R373.2 文献标识码：A 文章编号：10008721（2023）02054912DOI：10.13242/ki.bingduxuebao.004276轮状病毒属于呼肠孤病毒科，轮状病毒属，基因组由 11条分节段的双链 RNA（dsRNA）组成，分别编码 6 种结构蛋白（VP1 VP4，VP6 和 VP7）和 6种非结构蛋白（NSP1 NSP6）1。病毒的遗传物质包裹在由结构蛋白构成的三层衣壳中，它们分别是 VP1 VP3 构成的核心衣壳、VP6 构成的内层衣壳和 VP7与刺突蛋白 VP4共同构成的外层衣壳。非结构蛋白则在病毒的包装、复制和致病等过程中发挥重要功能2。轮状病毒是全球范围内引起婴幼儿肠胃炎的主要病原体之一，它的临床症状主要包括严重的腹泻、呕吐和由此引起的严重脱水3。事实上，轮状病毒 2016 年导致的死亡病例为 228 047例，每年导致的住院病例则高达 200万例，给社会造成了严重的经济负担4。相对经典遗传学而言，反向遗传学是从生物的遗传物质入手来阐述生命现象发生本质的研究方法。该方法的优点是，编辑用于转染的 DNA 或RNA 直接生成含有修饰基因的目的性重组或重配病毒。因此，反向遗传学方法很快在病毒学领域得到了广泛的应用。然而，由于轮状病毒基因组为双链 RNA，基因组较大（18.5 kb），节段较多等特点，其反向遗传学发展却较为缓慢。尽管在 2006 年建立了依赖辅助病毒的轮状病毒反向遗传学系统，但直到 2017 年，Kanai 等人才建立了首个完全基于质粒的轮状病毒反向遗传学系统5，实现了轮状病毒反向遗传学技术的里程碑式突破。本文将对此技术的发展和应用进行综述，以期为推动我国轮状病毒致病机制研究、新型疫苗研发及创新载体技术发展等研究提供参考。1 轮状病毒反向遗传学技术的发展1.1 依赖辅助病毒的轮状病毒反向遗传技术2006年，Komoto S等描述了第一个轮状病毒反向 遗 传 学 系 统6。该 系 统 将 猴 SA11（G3P2）VP4基因的 5端连接 T7 启动子，3末端连接丁型肝炎病毒 HDV 核酶序列，在转染被痘苗病毒 rDIsT7pol 感染的 COS7 细胞后，感染人类轮状病毒KU（G1P 8）。然后，使用辅助病毒 KU VP4 的特异性中和抗体来筛选重配 SA11 VP4的毒株。这一系统的开发，增加了我们对胰蛋白酶在 VP4蛋白裂解中所起作用的理解，并使携带 VP4基因的轮状病毒重配株的开发成为可能。2010 年，Troupin C 等建立了基于重排基因片段具有优先包装顺序的特点，将人轮状病毒的 NSP3 基因重配到牛轮状病毒 RF（G6P 1）中7。同年，Trask S D 等利用含有NSP2 突变基因的温度敏感株作为辅助病毒，并利用 NSP2 特异性 RNA 干扰，获得 NSP2 单基因重配的毒株8。这三种依赖辅助病毒的反向遗传学系统在很大程度上取决于它们所使用的特定辅助病毒和用于重配的特定基因，而且需要有效的筛选系统，因此，操作复杂、应用范围有限。收稿日期：20220629；接受日期：20220923基金项目：国家自然科学基金（项目号：21934005），题目：中国母乳糖组分离分析及与轮状病毒蛋白相互作用研究作者简介：刘夏飞（1988），女，从事轮状病毒分子流行病学、病原生物学研究，Email：通讯作者：段招军（1973），男，研究员，从事病毒病原生物学、免疫学、流行病学等研究，Email：开放科学（OSID）病 毒 学 报39卷1.2 完全基于质粒的轮状病毒反向遗传技术2017 年，Kanai Y 等首次成功建立了完全基于质 粒 的 轮 状 病 毒 反 向 遗 传 学 系 统6。该 系 统 将SA11（G3P 2）11 个基因 cDNA 的 5端连接 T7 启动子，3端连接丁型肝炎病毒 HDV 核酶，以此获得准确表达病毒基因组全长的序列，共转染稳定表达T7 RNA 聚合酶的 BHKT7细胞。在反向遗传学系统中，精确的病毒基因组和末端对病毒的成功拯救至关重要。在基因组转录过程中，T7 RNA 聚合酶识别 T7 启动子并从第一位碱基起始转录。当识别到 HDV 核酶后的 T7 终止子时，转录停止。HDV 核酶行使自剪切功能，从而保证转录序列端的精确性。除了 11 个 SA11 cDNA 克隆质粒外，编 码 FAST 蛋 白 和 痘 苗 病 毒 加 帽 酶 亚 基（D1R，D12L）的质粒也被共转染到 BHKT7细胞中，以提高拯救效率6。随后开发的非结构蛋白 NSP2 和NSP5同时过度表达的 11质粒系统进一步提高了拯救 效 率9。继 SA11 被 成 功 拯 救 后，人 类 毒 株 KU10、Odelia11、CDC9、猴 RRV 12、禽 PO1313和牛 RF14 也被成功拯救（表 1）。准确克隆的基因组对于反向遗传学系统的开发至关重要。特别是，分节段病毒基因组的 5和 3端非翻译区含有顺式作用元件，在基因组的转录、翻译和 病 毒 包 装 中 发 挥 重 要 作 用17。位 于 轮 状 病 毒 ssRNAs 3 端 的 七 个 高 度 保 守 的 核 苷 酸（UGUGACC 或 UGUGGCU）被认为与 RNA 聚合酶的特异性作用有关18。此外，保守的核苷酸序列与 ATP5B（线粒体 ATP合酶的核心亚单位）相互作用对于调节病毒复制至关重要19。因此，ssRNA 两端正确的 5和 3端核苷酸序列对于确保轮状病毒反向 遗 传 学 的 成 功 非 常 重 要。Kanai Y 等 总 结 了SA11、Odelia 和 KU 的 5和 3端序列20，阐述了由于SA11 和 RRV、Odelia、KU 和 CDC9 之间可以产生单基因重配病毒，因此，这些毒株末端序列的微小变化在病毒复制期间被认为是可以容忍的。鉴于轮状病毒的复制在细胞质中发生21，而通过质粒转入的T7 RNA 聚合酶定位于细胞质中且在各种细胞中都可以发挥功能。尤其是考虑到 T7 RNA聚合酶对于以鸟嘌呤（G）启始的转录是高效的，轮状病毒各基因片段正链 RNA 的 5端转录正好是从 G 开始。因此，使用 T7 RNA 聚合酶构建轮状病毒反向遗传质粒系统不仅确保了高转录水平，同时也确保了正链RNA的准确起始22，23。1.2.1 依赖 FAST 蛋白和痘病毒加帽酶的轮状病毒反向遗传学系统FAST 蛋 白 是 由 正 呼 肠 孤 病 毒 属（Orthoreovirus）和水生呼肠孤病毒属（Aquareovirus，AQRV）成员编码的一种诱导细胞间膜融合的蛋白质24，25。编码 FASTp10（9598 aa）的基因来源于在正呼肠病毒属的禽呼肠孤病毒（ARV）和内尔森海湾病毒（Nelson Bay，NBV），这些融合蛋白可以增加呼肠孤病毒科中不编码FAST 蛋白的非融合病毒（例如，哺乳动物正呼肠孤病毒和轮状病毒）的复制26。因此，将编码内尔森海湾病毒 FASTp10的表达质粒与轮状病毒基因组的 11个表达质粒共转染 BHKT7细胞，可以提高病毒拯救的效率6。此外，编码痘病毒加帽酶两个亚基（D1R 和 D12L）的加入则可确保在新生 RNA 转录本的 5 端加帽，从而稳定 mRNA 结构，促进其翻译27。1.2.2 将 NSP2 和 NSP5 同时提高的轮状病毒反向遗传学系统在使用 FAST 蛋白和痘病毒加帽酶的轮状病毒反向遗传学系统的发展早期，轮状病毒的拯救效表 1完全基于质粒的轮状病毒反向遗传学系统Table 1Entirely plasmidbased reverse genetics system for rotaviruses毒株SA11KUOdeliaCDC9 和 RRVPO13RF质粒系统141114121114121114辅助系统FAST蛋白和痘病毒加帽酶（D1R，D12L）3倍的 NSP2和 NSP5FAST蛋白和痘病毒加帽酶（D1R，D12L），3倍的 NSP2和 NSP5非洲猪瘟病毒 NP868R加帽酶，3倍的 NSP2和 NSP53倍的 NSP2和 NSP5FAST蛋白和痘病毒加帽酶（D1R，D12L），3倍的 NSP2和 NSP5基因改造的 MA104细胞系，C3P3G1，3倍的 NSP2和 NSP53倍的 NSP2和 NSP5FAST蛋白和痘病毒加帽酶（D1R，D12L），3倍的 NSP2和 NSP5参考文献6915161011121314 5502期刘夏飞，等.基于质粒的轮状病毒反向遗传学研究进展率 仅 为 1/122/12 6。为 了 提 高 拯 救 效 率，Komoto S 等尝试了通过过度表达病毒蛋白对病毒拯救的影响，经过一系列反复的实验和验证，作者认为将有利于病毒质区形成的非结构蛋白 NSP2 和NSP5 的表达量提高 35 倍，可以实现轮状病毒的高效率拯救（1/22/2）28。病毒质区是呼肠孤病毒科的一种常见结构，是病毒复制和组装的场所，轮状病毒的非结构蛋白 NSP2和 NSP529，以及蓝舌病毒和非洲马瘟病毒的非结构蛋白 NS230，31都可以相互作用形成病毒质区，并且从拯救质粒中招募病毒基因组和蛋白，以实现提高病毒拯救效率的目的。1.2.3 依赖 NP868R 加帽酶和 C3P3G1 质粒的轮状病毒反向遗传学系统当 非 洲 猪 瘟 病 毒 加 帽 酶 NP868R 与 基 于 T7 RNA 聚合酶的反向遗传学系统结合时，可提高哺乳动物正呼肠孤病毒的拯救效率32，因此，NP868R 也被用于轮状病毒反向遗传学系统。随后，在此基础上开发了融合表达 NP868R 和痘苗病毒 T7 RNA 聚合酶的 C3P3G1质粒，用于轮状病毒反向遗传学系统，该质粒的加入既能增强基因组的转录，又有利于维持转录产物的稳定性30，33。因此，大大提高了轮状病毒及其它呼肠孤病毒科成员的拯救效率63。此外，该系统的作者还对轮状病毒易于感染的 MA104细胞系进行基因组改造，将牛腹泻病毒（BVDV）的N 蛋白和 5 型副流感病毒（PIV5）的 V 蛋白稳定转入 MA104 细胞系，使它们分别靶向 IRF3 和 STA1蛋白降解34，从而起到 IFN 应答拮抗的目的。这种天然免疫显著减弱的稳定转染细胞株被命名为MA104 N*V11。与之前的方法相比，优化后的反向遗传学系统对人类和动物毒株的拯救效率更高，也更有利于轮状病毒复制和发病机制等的研究。2 轮状病毒反向遗传学的应用进展2.1 应用于轮状病毒基础研究在反向遗传学系统出现之前，轮状病毒结构蛋白和非结构蛋白的功能已通过表达重组蛋白、使用siRNA 技术以及特异性中和抗体进行了广泛的研究3538。反向遗传学方法则可以通过产生基因缺失或突变的重组轮状病毒来验证其蛋白质的功能。2.1.1 研究 NSP1 C端区域的功能在轮状病毒的复制中，NSP1 可以通过促进干扰素调节因子 3（IRF3）的降解来拮抗干扰素信号39，为了确定 NSP1 的 C 端区域是否在 IFN 信号的抑制中起关键作用，Kanai S 等利用 14质粒系统，分 别 构 建 了 rSA11 和 NSP1 C 端 截 短 的 突 变 体（rSA11dC103），通过对这两株毒株进行比较发现，rSA11 dC103 在 猴 和 人 类 细 胞 系（MA104，HCC2998，Caco2，HT29，OVCAR4，PC3）中 的复制受到阻碍，而且没有诱导 IRF3 降解。但是，IRF3 在感染 rSA11 的 HT29 细胞中显著降解。一系列研究结果表明，NSP1 的 C 端区域在通过诱导IRF3 降解来对抗先天性免疫应答的反应中发挥重要作用6。2.1.2 研究 NSP6在病毒复制中的作用轮状病毒基因组的第 11 个节段编码 NSP5 和NSP6两种非结构蛋白。NSP6 的 ORF 存在于绝大多数轮状病毒基因组中，因此，被认为在病毒的复制中发挥作用。然而，目前还没有直接的证据表明NSP6在病毒复制周期中的功能及其必要性。2017年，Komoto S 等 利 用 反 向 遗 传 学 系 统 成 功 拯 救rSA11 和 NSP6 缺 陷 株 rSA11 delNSP6，以 研 究NSP6在病毒复制周期中的作用40。通过蚀斑实验和一步生长曲线的结果证明，虽然 NSP6 可以有效地促进病毒生长，但对细胞培养中病毒的复制并不是必需的。2022年，Komoto S团队检测了不能表达NSP6 的重组 RVA 在哺乳期小鼠中引起腹泻的能力。结果证明感染 NSP6缺陷病毒的乳鼠出现明显腹泻，尽管症状较轻，腹泻持续时间也短于感染野毒株 SA11L2的小鼠。但是，结合之前细胞培养的结果，可以得出结论，NSP6对于轮状病毒在体内和体外的复制以及致病性并不是必须的41。2.1.3 研究 NSP2在病毒复制中的作用研究表明，单独的 NSP5 在细胞中表达时无法实现高磷酸化，需要 NSP2 的帮助才能获得高磷酸化状态。Criglar JM 等发现 NSP2有两种不同形式：细胞质中分散的 NSP2（dispersed NSP2，dNSP2）和病毒质体 NSP2（viroplasmic NSP2，vNSP2），它们分别与低磷酸化和高磷酸化 NSP5 发生作用，并调节病毒体组装的磷酸化依赖机制42。研究表明细胞激酶 CK1 使丝氨酸 313 上的 dNSP2 磷酸化，触发 vNSP2定位于病毒体组装位点，并与高磷酸化NSP5 相关。为了评估 NSP2 磷酸化在病毒体形成中的作用，Criglar JM 等将丝氨酸突变为天冬氨酸，产生了氨基酸 313位发生突变的 NSP2 S313D，这种突变模仿了原始轮状病毒中的磷酸化蛋白。NSP2 S313D 突变体在病毒体形成、病毒复制方面显著延迟，并在共感染期间干扰野生型轮状病毒复制，表明该氨基酸在病毒复制期间的重要性43。利用病毒体组装的延迟，作者发现 vNSP2与轮状病毒诱导的脂 551病 毒 学 报39卷滴共定位优先于其他蛋白质的组装，并且病毒体组装需要 NSP5过度磷酸化。2.1.4 研究 NSP5在病毒复制中的作用NSP5 的磷酸化由单个丝氨酸残基的磷酸化引发，这种翻译后修饰在病毒体形成中的作用及其对病毒复制的影响尚不清楚。Papa G 等构建了许多NSP5 磷酸化受损的突变体，以进一步研究这种翻译后修饰在病毒体组装中的作用44。他们发现，rSA11 突变株表现出复制受损且在 MA104 细胞中的组装能力受到影响。此外，作者还研究了轮状病毒感染期间 NSP5 过度磷酸化的机制，结果表明，NSP5 的过度磷酸化是病毒质区组装的关键步骤，突出了 NSP5的 C 末端在形成复制能力强的病毒粒子中的关键作用。由此证明了，缺乏 NSP5 的轮状病毒完全无法组装和复制，证实了 NSP5 在轮状病毒复制中的关键作用。2.1.5 研究 VP3在病毒复制中的作用Song 等的研究为证明宿主干扰素诱导的 25寡腺苷酸合成酶（oligoadenylate synthetase，OAS）和核糖核酸酶（RNase）L 途径有效抑制异源轮状病毒的复制提供了体外和体内证据45。同源轮状病毒 的VP3 依 赖 其2 5 磷 酸 二 酯 酶（phosphodiesterase，PDE）结构域对抗核糖核酸酶 L介导的抗病毒信号。利用反向遗传学系统对 PDE进行突变的结果表明，与亲本株相比，VP3 PDE 突变型轮状病毒在小肠中以低水平复制，且在小鼠的粪便中脱落较少。这些发现强调了 VP3 在促进病毒复制和体内发病机制中的重要作用，也强调了VP3作为 RNA加帽酶的功能。近年来，完全基于质粒的轮状病毒反向遗传学技术已广泛用于轮状病毒研究的各个领域，通过产生基因缺失或突变的重组轮状病毒可以对更多的病毒蛋白和致病机制等进行研究。因此，完全基于质粒的轮状病毒反向遗传学技术在未来将广泛应用于轮状病毒生物学研究的各个方面。3 应用于构建报告病毒和病毒载体的研究报告病毒是一种具有编码荧光或发光蛋白的外源报告基因的工程病毒，可以在体内和体外对病毒的复制、跨物种传播、发病机制和抗病毒药物筛选等进行实时和可视化研究46。病毒载体的研究是以轮状病毒作为载体，在不同的基因节段插入外源基因，以实现对外源基因的抗原性或药物功能检测的研究。在许多情况下，轮状病毒可以在自然传代中发生重排，经常发生重排的基因为 NSP147，48、VP649、NSP250、NSP346，51，52、NSP453和 NSP5/654，55的片段。目前，被用作报告病毒及载体改造的基因研究最多的是 NSP1 和 NSP3 基因。轮状病毒衣壳大约可容纳 1 800 bp 异源 dsRNA56而不会对病毒复制产生实质性影响。但是，较大的外源基因插入可能会使反向遗传学系统的拯救效率非常低57，58。此外，轮状病毒的包装信号迄今尚未明确，它们很可能超出 5 UTR 和 3UTR 而延伸到基因组的 ORF，因此，插入外源基因可能会破坏包装信号的结构59，60，会不会因此而影响反向遗传学系统的拯救效率还有待于进一步研究。3.1 基于 NSP1基因的报告病毒及载体改造的研究NSP1 已被证明对细胞培养中病毒的复制不是必须的6163，最初的报告病毒是将 NLuc 荧光素酶、绿色或红色荧光蛋白插入 NSP1 基因，但是这些报告基因在长期连续传代后不稳定。因此，开发了一种将 NSP1 基因截短的稳定表达报告基因的策略。2017年，Kanai等利用 14质粒系统将 splitGFP 融合到 NSP1 的 C 端，并将 NLuc 荧光素酶插入 NSP1 截短体的 N 端，生成报告基因6，并且发现插入长达516 bp的 NLuc荧光素酶对病毒复制没有不良影响。2018 年，Komoto S 等 通 过 利 用 11 质 粒 系 统，将mCherry或 EGFP插入 NSP1基因 N 端，并成功拯救出报告病毒64。2021年，Hatazawa等将三个报告基因（Nluc、EGFP 和 mCherry）插入 NSP1 截短体中，产生了具有复制能力的多重报告基因病毒，表明轮状 病 毒 具 有 插 入 多 个 外 源 基 因 的 能 力65。这 些NSP1突变株的成功拯救和在细胞培养的连续传代中保持遗传稳定，证明了 NSP1 可以耐受外源基因的插入，并且具有作为外源基因表达载体的潜力。但是，NSP1在感染细胞中的表达水平较低，并且易发生蛋白酶体降解，因而，荧光蛋白或外源基因的表达量也不高。此外，荧光蛋白或外源基因以改变NSP1 ORF 的方式插入，可能会损害该蛋白作为干扰素拮抗剂的功能66，67，从而影响病毒的生物学特性。3.2 基于 NSP3基因的报告病毒及载体改造的研究由于在 NSP1中插入报告基因的轮状病毒不能表达 NSP1 的功能，因此，产生了在 NSP3 的 C 末端插入荧光报告基因的第二代报告病毒，NSP3 的ORF被编码 NSP3和报告基因的融合基因取代。其中，已有六种荧光报告蛋白（UnaG、mKate、mRuby、TagBFP、CFP、YFP）分别被融合到 NSP3 ORF 的C 末端15，6870。在这些报告病毒中，报告基因通过 5522期刘夏飞，等.基于质粒的轮状病毒反向遗传学研究进展T2A 连接到 NSP3 的 ORF，T2A 可实现对 NSP3 和报告基因的“终止再启动”表达，因此，不影响 NSP3和报告基因的功能。而且，NSP3 可容纳的最大外源基因可达 1.3 kb49。NSP3 是一种病毒翻译增强子，在感染细胞中以中等水平表达，鉴于 NSP3基因高效的转录效率，NSP3 已成为开发轮状病毒报告系统以研究其生物学的一个最具有开发意义的节段71。NSP3mRuby rSA11已令人印象深刻地证明了这一点，该重组病毒已被用于研究轮状病毒感染过程中钙信号异常的潜在机制48。2021年，Philip AA 等探索了建立以轮状病毒作为载体，将 SARSCoV2 不同抗原（S1 片段、NTD、RBD、ExRBD 和 CR）插入 NSP3 阶段的可行性，结果强调了轮状病毒作为 SARSCoV2 S蛋白免疫原性 表 达 载 体 的 潜 在 可 能72。2022 年，Diebol 将SARSCoV2 棘 突 蛋 白 的 受 体 结 合 域（RBD）或RBD 内较短的受体结合基序（RBM）融合到牛 RV RF 株的非结构蛋白 NSP3 的 C 末端，在 ELISA 中，表达 RBD 肽的重组病毒显示出与 SARSCoV2 RBD 抗体的交叉反应。结果强调了反向遗传学方法在开发同时针对多种肠道病原体的疫苗载体方面的潜力14。由于轮状病毒感染在肠道中诱发强烈的粘膜免疫73，74，因此，在 NSP1 或 NSP3 中插入报告基因的策略也将为开发针对诺如病毒、戊肝病毒、星状病毒和霍乱弧菌等肠道病原体提供一个有用的载体平台。4 应用于病毒重配及新型疫苗的研究轮状病毒基因组的分段性质允许其在一个细胞内共同感染两种或两种以上病毒，并进行重配，这种现象已被用来生成重配病毒作为减毒活疫苗，如世界范围内广泛使用的乐儿德（RotaTeq，默克，肯尼尔沃思，新泽西州，美国）就是用这种方法生成的。众所周知，传统重配病毒的开发是劳动密集型且耗时的工作。基于质粒的轮状病毒反向遗传学系统的开发可将重配病毒开发所需的时间从数月缩短到数周，并且大大减少工作量。因此，非常适合在出现具有临床意义的新基因型的情况下快速生成候选疫苗75。4.1 轮状病毒重配机制的研究轮状病毒重配在体外7687和体内88，89都可能以高频率发生。一系列单重配轮状病毒已被用于确定基因片段与特定表型的关系。2017 年，Kanai 等将人类毒株 KU 的 VP6节段重配入 SA11，产生具有复制 能 力 的 VP6 KU/SA11 重 配 株6。2019 年，Falkenhagen 等 将 一 组 来 自 牛（B223）、蝙 蝠（BatLy03）、猪（OSU）、家鸡（02V0002G3）和野鸡（10V0112H5）的 VP4 重配入 SA11 骨架，产生了一系列 VP4基因重配株。然而，来自火鸡（03V0002E10）和 人 类（Wa）VP4 的 重 配 株 却 没 有 拯 救 成功14。此 外，该 实 验 室 还 尝 试 构 建 了 家 鸡（02V0002G3）的反向遗传学系统，将 02V002G3 的11个节段分别与 SA11骨架进行重配。然而令人遗憾的是，只能生成 VP3和 VP4的单基因重配，其余 9个节段的重配均无法成功拯救90。此外，该实验室在将 3株非洲人类流行株（GR10924/99、Moz308和Moz60a）的 VP4 和 VP7 节段与 SA11 骨架重配时，也遇到了类似的瓶颈。3/3个 VP7基因的单重配株均 被 成 功 拯 救，但 是，只 有 1/3 个 VP4 基 因（GR10924/99）的重配获得成功，并且没有 VP4和VP7 的 双 基 因 重 配 株 被 拯 救 成 功91。为 了 解 开VP4 重配受到限制的原因，该实验室设计了一系列编码嵌合 VP4 的质粒。结果证明将 VP6 和 VP7 基因改变为与 VP4 相匹配的基因并不能够解决病毒拯救的瓶颈。相反，编码 VP4受体结合域的区域对于病毒的拯救至关重要92。2020 年，SnchezTacuba 等利用优化的反向遗传学系统成功地拯救了一株鼠样 RV rD6/2，它包含了来自 RRV 的 VP4，SA11 的 VP1 和 NSP4，和来自小鼠 EW 的其余 8个节段。该实验室还成功拯救了以人类 CDC9 为骨架重配入牛 UK 的牛人重配株rCDC9/UK_VP4。值得注意的是，在早期的反向遗传学系统中这种重配株的拯救是很困难的93。2020 年，Fukuda 等使用 11 质粒系统，将人类 KU 的11 个节段分别重配入 SA11 骨架中，生成了 11 个重配病毒。除此之外，还成功拯救了 VP1、VP2、VP3的三基因重配株和多个 VP7来自 G1G4、G9和 G12基因型的 VP7 单基因重配株57。综上所述，目前，已经有多家实验室通过反向遗传学系统生成了各种不同的重配株用于研究轮状病毒的复制机制、宿主范围限制和发病机制。4.2 人和动物重配减毒活疫苗研究在疫苗中使用时，减毒活疫苗需要经过重配程序，将人类流行株的 VP7和 VP4基因整合到动物的骨架中。到目前为止，重配病毒的制备是通过使用两种不同的毒株以高感染倍数感染细胞，通过蚀斑纯化和聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）来验证的。这些经典的实验必须通过大量重复才能分离出目的性重配毒株。即便如此，有时也很难获得所需的重配 553病 毒 学 报39卷毒株，因为呼肠孤病毒科成员的重配事件似乎是非随机的9497，而且两个亲本毒株之间还存在遗传兼容性的问题98，99。反向遗传学是一种易于处理、快速且可重复的方法，用于产生携带特定 VP4 和 VP7 抗原的重配RV 候选疫苗。2021年，Kanai Y 等开发了一个疫苗平台，通过反向遗传学方法快速生成携带 VP4（P4和 P8）、VP7（G1、G2、G3、G8 和 G9）和/或VP6 基因的重配 RV，这些重配病毒以猴 RV SA11株（G3P 2）作为骨架，携带从临床样本中克隆的VP4 和 VP7 片段。使用单克隆抗体和小鼠抗血清的中和试验表明，VP4和 VP7单重配病毒表现出抗原性改变100。由于 VP4 和 VP7 基因直接决定轮状病毒的抗原性，完全基于质粒的反向遗传学系统能更好地促进目的基因的靶向重配，并在人和动物之间产生范围更广的 VP4 和 VP7 重配病毒14，91，101，102。因此，使用完全基于质粒的反向遗传学系统将有助于开发新型的轮状病毒基因重配减毒活疫苗，并有可能大大降低疫苗生产所需的时间成本。4.3 定向基因突变减毒活疫苗研究反向遗传学技术已成功用于开发非复制型或减毒的流感病毒疫苗103。制备减毒流感病毒疫苗的策略，包括在血凝素（HA 片段）的裂解位点引入突变104或者将 NS1截短以抑制先天性免疫反应、去密码子优化、产生假型病毒以及通过重新排列基因组来产生重组病毒91。所有这些策略都可以应用于轮状病毒新型减毒活疫苗的开发。4.4 轮状病毒为载体的联合疫苗研究2020年，Philip AA 等使用完全基于质粒的轮状病毒反向遗传学系统，将片段 7的天然 ORF 替换为编码 NSP3GFP融合蛋白的 ORF，生成了两种不同的蛋白质（NSP3 和 GFP 荧光报告蛋白）105。这一研究为以轮状病毒作为表达载体的肠道病毒联合疫苗的开发提供了可能性。通过使用轮状病毒作为疫苗表达平台，可以制备以轮状病毒为载体的联合疫苗，不仅可以预防轮状病毒，而且可以对抗其他肠道病毒，包括诺如病毒、星形病毒和戊型肝炎病毒等。5 总结和展望综上所述，目前已经成功建立了完全基于质粒的轮状病毒反向遗传学系统，该技术为轮状病毒蛋白质功能的研究提供了新的、简单、高效的方法。此外，该技术还将成为研究轮状病毒生物学各方面的有力工具，并将为轮状病毒基因重配或重组疫苗以及以轮状病毒作为表达载体的联合疫苗的开发提供支持。然而，该系统并非没有挑战，目前成功拯救的毒株仅限于几株体外传代培养的适应性毒株，即使是优化的反向遗传系统也无法用于流行株的拯救。因此，完全基于质粒的轮状病毒反向遗传学系统仍处于发展的早期阶段，仍然需要进一步优化以提高该系统的拯救效率。参考文献：1 Desselberger U.RotavirusesJ/OL.Virus 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