生物芯片原理省公共课一等奖全国赛课获奖课件.pptx

生物芯片原理生物芯片原理 principle of biochip 医学院病毒所医学院病毒所第1页本章提要本章提要l生物芯片介绍生物芯片介绍l生物芯片分类生物芯片分类l基因芯片基本原理、流程与应用基因芯片基本原理、流程与应用l蛋白质芯片及应用蛋白质芯片及应用第2页第一节第一节 生物芯片介绍生物芯片介绍 一、一、什么是生物芯片什么是生物芯片 生生物物芯芯片片主主要要指指经经过过平平面面微微细细加加工工技技术术，在在固固体体芯芯片片等等载载体体上上微微型型生生物物化化学学分分析析系系统统，以以实实现现对对细细胞胞、蛋蛋白白质质、核核酸酸以以及及其其它它生生物物组组分分准准确确、快快速速、大大信信息息量量检检测测第3页芯片上每平方厘米可密集排列成千上万个芯片上每平方厘米可密集排列成千上万个生物分子，能快速准确地检测细胞、蛋白生物分子，能快速准确地检测细胞、蛋白质、质、DNA及其它生物组分，并获取样品及其它生物组分，并获取样品中相关信息，其效率是传统检测方法成百中相关信息，其效率是传统检测方法成百上千倍。上千倍。第4页生物芯片分析过程生物芯片分析过程试样处理试样处理点阵固定点阵固定反应或杂交芯片制作标识洗涤检测扫描检测扫描光刻合成微量点样喷墨纯化、标识光化学检测电化学检测计算处理第5页 基因芯片基因芯片最大优点在于其高通量最大优点在于其高通量。传统方法。传统方法检测众多基因要经历屡次试验而且自动化程检测众多基因要经历屡次试验而且自动化程度低，因而每次试验之间是存在系统误差。度低，因而每次试验之间是存在系统误差。基因芯片能够克服这个缺点，基因芯片能够克服这个缺点，众多基因探针众多基因探针标识、杂交等过程是在一次试验过程中完成，标识、杂交等过程是在一次试验过程中完成，而且自动化程度高，数据客观可靠而且自动化程度高，数据客观可靠第6页l1996年美国年美国Affymetrix企业成功地制作出世界企业成功地制作出世界上首批用于药品筛选和试验室试验用生物芯片，上首批用于药品筛选和试验室试验用生物芯片，并制作出对应芯片系统。另外，美国并制作出对应芯片系统。另外，美国Hyseq企企业、业、Aurora企业、企业、Nanogen企业、企业、Incyte企业企业等也在主动开展等也在主动开展DNA芯片研究工作。近二年，芯片研究工作。近二年，摩托罗拉、惠普、摩托罗拉、惠普、IBM等跨国企业也相继投以等跨国企业也相继投以巨款加入生物芯片研究开发。巨款加入生物芯片研究开发。第7页l我国是从一九九七年开始对生物芯片研究。l中国医药生物技术协会生物芯片分会在北京成立。l中国在北京、上海、陕西、天津、南京建立了五大生物芯片研发和产业化基地。l我国生物芯片产业还未形成统一技术标准，不规范。在产品认证认可方面也存在与国际通例不接轨情况。第8页l生物芯片技术是生物芯片技术是20世纪世纪90年代以来，影响年代以来，影响最为深远重大科技进展。它是继大规模集最为深远重大科技进展。它是继大规模集成电路之后又一次含有深远意义科学技术成电路之后又一次含有深远意义科学技术革命。革命。l该技术被评为该技术被评为1998年度世界十大科技进展年度世界十大科技进展之一。之一。第9页发展趋势发展趋势 缩微芯片试验室缩微芯片试验室 生物芯片研究领域一生物芯片研究领域一个热点，它是将传统生物化学样品制备、个热点，它是将传统生物化学样品制备、生化反应、检测三个步骤集于一体，缩生化反应、检测三个步骤集于一体，缩小组成芯片上试验室系统小组成芯片上试验室系统第10页第二节第二节 生物芯片分类生物芯片分类第11页普通分类第12页 信息生物芯片和功效生物芯片信息生物芯片和功效生物芯片第13页第三节基因芯片基本原理与流程第三节基因芯片基本原理与流程第14页 基基因因芯芯片片技技术术是是指指经经过过微微阵阵列列(Microarray)(Microarray)技技术术将将高高密密度度DNADNA片片段段阵阵列列经经过过高高速速机机器器人人或或原原位位合合成成方方式式以以一一定定次次序序或或排排列列方方式式使使其其附附着着在在如如玻玻璃璃片片等等固固相相表表面面，以以荧荧光光标标识识DNADNA探探针针，借借助助碱碱基基互互补补杂交原理，进行大量基因表示及检测等研究技术。杂交原理，进行大量基因表示及检测等研究技术。第15页基因芯片发展历史基因芯片发展历史Southern and Northern Southern and Northern BlotBlotDot Dot BlotBlotMacroarrayMacroarrayMacroarrayMacroarray第16页RNADNA1DNA2ProbeSouthernhybridizationNorthernhybridizationHybridization of Nucleic Acids第17页Amino acid sequenceGLY-ASP-GLU-SER-SER-VAL-LEU-GGG-GAC-GAG-TCC-TCC-GTT-CTC-Nucleic acid sequenceSynthesizingoligonucleotidePROBE GGGGACGAGTCCTCCGTTCTThe nucleic acid sequence isDeduced from amino acid sequenceChemical synthesisPreparation of Traditional Nucleic Acid Probe第18页基因芯片分类基因芯片分类l按芯片制备方法分类按芯片制备方法分类 原位合成芯片（原位合成芯片（synthetic genechip）DNA微阵列芯片（微阵列芯片（DNA microarray）l按探针分类按探针分类 寡核苷酸阵列寡核苷酸阵列 DNA阵列阵列 基因芯片基因芯片 cDNA芯片芯片 RNA芯片芯片第19页Types of DNA Chips第20页生物芯片原理l生物芯片利用空间位置固定事先已知核酸、蛋生物芯片利用空间位置固定事先已知核酸、蛋白质、脂质和碳水化合物分子白质、脂质和碳水化合物分子l芯片技术对固定相分子要求较高，要求生物分芯片技术对固定相分子要求较高，要求生物分子固定在芯片基质上之后仍要保持生物活性稳子固定在芯片基质上之后仍要保持生物活性稳定。定。l在分子杂交反应和洗片等处理过程中能稳定结在分子杂交反应和洗片等处理过程中能稳定结合所亲和分子，预防其在杂交洗涤过程中被冲合所亲和分子，预防其在杂交洗涤过程中被冲洗掉，确保检测信息准确可靠。洗掉，确保检测信息准确可靠。第21页l制作芯片片基材料首先必须有很好制作芯片片基材料首先必须有很好光学性质，光学性质，能利用能利用光进行透射和反射检测光进行透射和反射检测l芯片表面含有能够进行化学反应芯片表面含有能够进行化学反应活性基团，活性基团，方便生物方便生物分子偶联而固定分子偶联而固定l芯片表面活性化学基团有足够芯片表面活性化学基团有足够吸附能力，吸附能力，要能结合最要能结合最正确容量生物分子正确容量生物分子l芯片要有很好稳定性，含有一定抗压能力，而且在生芯片要有很好稳定性，含有一定抗压能力，而且在生物分子杂交反应过程中要处于物分子杂交反应过程中要处于惰性状态，惰性状态，不会发生其不会发生其它化学反应或其它物质吸附它化学反应或其它物质吸附l生物芯片要有很好生物芯片要有很好兼容性，兼容性，能够广泛应用于生物学检能够广泛应用于生物学检测和研究测和研究芯片片基第22页生物分子与芯片结合l生物芯片表面活性基团形成生物芯片表面活性基团形成特异亲和生物分特异亲和生物分子位点，子位点，用来吸附和固定生物活性分子，比用来吸附和固定生物活性分子，比如多肽、核酸、酶、抗体或抗原等如多肽、核酸、酶、抗体或抗原等l依据芯片基片表面活性基团类型，芯片能够依据芯片基片表面活性基团类型，芯片能够分为分为氨基片、醛基片、环氧乙基片和氨基片、醛基片、环氧乙基片和N一羟一羟基琥珀酰亚胺酯片基琥珀酰亚胺酯片l依据不一样需要来选取芯片，如对大分子依据不一样需要来选取芯片，如对大分子DNA吸附要用氨基片，对寡聚核苷梭或小片吸附要用氨基片，对寡聚核苷梭或小片段段DNA要用醛基片要用醛基片第23页a.氨基片氨基片 表面为氨基，直接与核酸分子磷酸基团靠电表面为氨基，直接与核酸分子磷酸基团靠电荷作用相结合荷作用相结合b.醛基片醛基片 表面醛基直接与生物分子氨基共价结合表面醛基直接与生物分子氨基共价结合第24页c.环氧已基片环氧已基片 表面环氧已基直接与生物分子氨基表面环氧已基直接与生物分子氨基共价结合；共价结合；d.N-羟基琥珀酰亚胺酯片羟基琥珀酰亚胺酯片 表面表面N-羟基琥珀酰亚胺羟基琥珀酰亚胺酯基直接与生物分子氨基共价结合。酯基直接与生物分子氨基共价结合。第25页DNA Chip TechnologylSolid support.glass,plastic,metal,silicon.lMiniaturized array of DNA(genetic material)lWork on the biochemical principle of DNA/DNA hybridizationlHybridized probes(DNA molecules)are fluorescently labeled第26页Comparison of DNA Chip Technologies Sensitivity of DNA chip assaysSensitivity of DNA chip assaysn nProbe and target DNA/RNA ComplexityProbe and target DNA/RNA Complexityn nChip surface(autofluorescence and non-spec.bkg)Chip surface(autofluorescence and non-spec.bkg)n nAttachment chemistry/methodology(hyb.efficiency&Attachment chemistry/methodology(hyb.efficiency&crosshyb.)crosshyb.)n nHybridization efficiency(lots of factors)Hybridization efficiency(lots of factors)n nDetection technology(signal type,efficiency,noise)Detection technology(signal type,efficiency,noise)Oligo-Chip Oligo-Chip cDNA-Chip cDNA-Chip Genomic Chip Genomic Chip 8 n or 20 n 8 n or 20 n 50,000 n 50,000 nsequencingsequencingexpressionexpressionexpressionexpressiongenomic analysisgenomic analysis第27页基因芯片原理基因芯片原理 依据双螺旋原理，核酸分子杂交依据双螺旋原理，核酸分子杂交技术，在靶标样品与探针之间进行选技术，在靶标样品与探针之间进行选择性反应，将反应一方，探针固定在择性反应，将反应一方，探针固定在芯片上，另一方，荧光标识制备好芯片上，另一方，荧光标识制备好cDNA，分别标识绿色，分别标识绿色Cy3和红色和红色Cy5经过流路或加至芯片上。经过流路或加至芯片上。第28页基基 因因 芯芯 片片 流流 程程样品制备样品制备芯片制备芯片制备杂交杂交杂交信号检测杂交信号检测数据分析数据分析第29页Each spot contains known DNAComplementary DNA hybridizeSignal appearsBiochip Based on Hybridization第30页试验流程第31页第32页第33页影响杂交反应原因影响杂交反应原因 1 探针浓度探针浓度 其浓度差异对信号有影响，浓度高信其浓度差异对信号有影响，浓度高信号强。号强。2 阳离子阳离子 阳离子存在可提升异源杂交双链生成速阳离子存在可提升异源杂交双链生成速度。度。3 温度温度 ONA2542 C，cDNA 5570 C 4 序列组成序列组成 芯片上一次产生上万个异源杂交反应，芯片上一次产生上万个异源杂交反应，应选择最协调条件。应选择最协调条件。5 高灵敏度监测系统，阅读仪。高灵敏度监测系统，阅读仪。第34页 基因芯片检测原理 荧光扫描成像用激光激发芯片上样品发射荧荧光扫描成像用激光激发芯片上样品发射荧光，严格配正确杂交分子，其热力学稳定性较光，严格配正确杂交分子，其热力学稳定性较高，荧光强；而不完全杂交分子热力学稳定性高，荧光强；而不完全杂交分子热力学稳定性低，荧光信号弱；不杂交无荧光。不一样位点低，荧光信号弱；不杂交无荧光。不一样位点信号被扫描后由计算机软件处理，并对每个点信号被扫描后由计算机软件处理，并对每个点荧光强度数字化后进行分析。荧光强度数字化后进行分析。第35页基因芯片数据分析 图像分析，图像分析，Ratio值分析，基因聚类分析值分析，基因聚类分析 图像分析图像分析 激光扫描仪得到扫描图像文件经过划格，激光扫描仪得到扫描图像文件经过划格，确定杂交斑点位置，然后经过过滤背景噪音，提取确定杂交斑点位置，然后经过过滤背景噪音，提取得到荧光信号强度值，最终以数据列表形式输出。得到荧光信号强度值，最终以数据列表形式输出。这一系列工作都是依靠软件来完成，如这一系列工作都是依靠软件来完成，如Biodiscovery，Imagene 7.0分析软件。分析软件。第36页 Ratio值分析值分析 在惯用双色荧光芯片系统下，各杂交斑点两色在惯用双色荧光芯片系统下，各杂交斑点两色荧光荧光cy3cy5比值又称比值又称R/G值。普通认为值。普通认为RG值值在在0.52.0范围内基因不存在显著表示差异，该范范围内基因不存在显著表示差异，该范围之外则认为基因表示出现显著改变。围之外则认为基因表示出现显著改变。因为试验条件不一样，该域值范围会依据置信区因为试验条件不一样，该域值范围会依据置信区间进行调整。处理后得到信息能够依据需要以各种间进行调整。处理后得到信息能够依据需要以各种形式输出，如柱形图、饼形图、点图、原始匡像拼形式输出，如柱形图、饼形图、点图、原始匡像拼图等。将每个信号斑点全部相关信息如位标、基因图等。将每个信号斑点全部相关信息如位标、基因名称、克隆号、名称、克隆号、PCR结果、信号强度、结果、信号强度、Ratio值等值等自动关联并依据需要筛选数据。自动关联并依据需要筛选数据。第37页 聚类分析聚类分析 clustering analysis 从生物芯片图像分析中可得到大量数据，要从从生物芯片图像分析中可得到大量数据，要从中提取所需要信息就必须对这些数据统计分析。经中提取所需要信息就必须对这些数据统计分析。经过建立各种数学模型，分析芯片图像数据生物学意过建立各种数学模型，分析芯片图像数据生物学意义。义。聚类分析是利用大量相关数据对事物进行分类聚类分析是利用大量相关数据对事物进行分类处理，其方法为直接比较样本中各种特征数据，将处理，其方法为直接比较样本中各种特征数据，将特征相近归为一类，差异较大归为不一样类。特征相近归为一类，差异较大归为不一样类。第38页四四 生物芯片制作生物芯片制作基本方法基本方法 点样法和原位合成法点样法和原位合成法 原位合成法原位合成法 原位光刻合成原位光刻合成 压电打印法压电打印法第39页 点样法点样法 这一方法相对技术要求不高，是最这一方法相对技术要求不高，是最惯用方法。点样法是将预先合成好探针、惯用方法。点样法是将预先合成好探针、PCR产物、蛋白或多肽、抗原或抗体等经产物、蛋白或多肽、抗原或抗体等经纯化、定量分析后，经过由阵列复制器或阵纯化、定量分析后，经过由阵列复制器或阵列点样机准确、快速地将不一样探针样品定列点样机准确、快速地将不一样探针样品定量点样于带正电荷尼龙膜或玻片等对应位置量点样于带正电荷尼龙膜或玻片等对应位置上，再进行固定处理，如紫外线交联固定。上，再进行固定处理，如紫外线交联固定。第40页 点样方式分接触式点样与非接触式点样点样方式分接触式点样与非接触式点样两种。接触式点样是点样针直接与固相支持两种。接触式点样是点样针直接与固相支持物表面接触，将生物分子样品留在固相支持物表面接触，将生物分子样品留在固相支持物上。非接触式点样以压电原理将样品经过物上。非接触式点样以压电原理将样品经过毛细管直接喷至固相支持物表面。打印法优毛细管直接喷至固相支持物表面。打印法优点是探针密度高，通常点是探针密度高，通常1平方厘米可打印平方厘米可打印2 500个探针；缺点是定量准确性及重现性不个探针；缺点是定量准确性及重现性不好，打印针易堵塞且使用寿命有限。好，打印针易堵塞且使用寿命有限。第41页原位合成法 原位合成法原位合成法 该方法技术比较复杂，除了该方法技术比较复杂，除了Affymetrix 等少数实力雄厚生物芯片企业能等少数实力雄厚生物芯片企业能够用该技术外，其它企业和试验室都是采取够用该技术外，其它企业和试验室都是采取点样法制作芯片。点样法制作芯片。原位合成方法有两种路径，一个是原位光刻原位合成方法有两种路径，一个是原位光刻合成，该技术是由合成，该技术是由Affymerix企业企业Fodor试验试验室开发。该方法主要优点是能够用极少步骤室开发。该方法主要优点是能够用极少步骤合成极其大量多肽或寡聚核苷酸阵列。合成极其大量多肽或寡聚核苷酸阵列。第42页 另一个原位合成是压电打印法，主要用于合成另一个原位合成是压电打印法，主要用于合成寡聚核苷酸探针，其原理与普通彩色喷墨打印机寡聚核苷酸探针，其原理与普通彩色喷墨打印机相同，所用技术为常规固相合成方法。依据芯片相同，所用技术为常规固相合成方法。依据芯片上不一样位点探针序列需要将特定碱基喷印在芯上不一样位点探针序列需要将特定碱基喷印在芯片上特定位置，冲洗、去保护、偶联等与普通固片上特定位置，冲洗、去保护、偶联等与普通固相合成技术相同。相合成技术相同。该技术采取化学原理与传统该技术采取化学原理与传统DNA固相合成一致，固相合成一致，不需要特殊制备化学试剂，能够合成出长度为不需要特殊制备化学试剂，能够合成出长度为4050个碱基探针。个碱基探针。第43页一个实例基因芯片筛选宫颈癌相关基因研究基因芯片筛选宫颈癌相关基因研究摘要摘要 本研究中采取本研究中采取细胞原癌、抑癌基因分类芯片细胞原癌、抑癌基因分类芯片对原发性宫颈癌标本进行分析，以期探讨宫颈癌对原发性宫颈癌标本进行分析，以期探讨宫颈癌基因组中存在癌基因表示变异，基因组中存在癌基因表示变异，确定与宫颈癌相确定与宫颈癌相关候选原癌或抑癌基因，关候选原癌或抑癌基因，为宫颈癌诊疗和治疗提为宫颈癌诊疗和治疗提供新线索和依据。供新线索和依据。第44页试验结果1 组织总组织总RNA制备制备 本试验中共搜集到宫颈癌组织0.96g，正常对照宫颈组织0.56g，分别提取总RNA。两种宫颈组织总RNA提取质量见表1 表表1 总总RNA提取结果提取结果样品类型样品类型 编号编号 总总RNA量量 OD260 OD280 OD260/OD280 荧光荧光标识标识正常宫颈组织正常宫颈组织 N 706.8g 0.592 0.289 2.059 Cy3 对照组对照组宫颈癌组织宫颈癌组织 C 1200.0g 1.015 0.488 2.114 Cy5 试验组试验组第45页 芯片扫描结果芯片扫描结果 Cy3 Cy5第46页宫颈组织宫颈组织/对照组织双色荧光标识芯片对照组织双色荧光标识芯片扫描叠加图扫描叠加图 第47页 图中X轴、Y轴分别以cy3荧光强度值(前景值背景值)和 cy5荧光强度值为坐标，每一个数据点代表芯片上一个基因点杂交信号；数据点若为红色，则代表Y值与X值比值在0.5至2.0之间，属非差异表示；数据点若为黄色，则代表Y值与X值比值在0.5到2.0范围之外，表明所代表基因存在表示差异。第48页第49页经过对基因芯片结果分析，发觉经过对基因芯片结果分析，发觉BLACP，bladder cancer related protein基因基因即膀胱癌相关蛋白基因即膀胱癌相关蛋白基因表示下调最为显著，提醒表示下调最为显著，提醒BLACP基因与宫颈癌之间存在着联络。很基因与宫颈癌之间存在着联络。很可能是一个宫颈癌相关候选抑癌基可能是一个宫颈癌相关候选抑癌基因。该基因在包含人在内各种动物因。该基因在包含人在内各种动物中已经有发觉。还未发觉与人类其中已经有发觉。还未发觉与人类其它基因有任何同源性。鉴于此，在它基因有任何同源性。鉴于此，在本试验中本试验中BLACP 基因克隆到真核基因克隆到真核表示载体上，转染宫颈癌细胞系表示载体上，转染宫颈癌细胞系HeLa，发觉它确实，发觉它确实能够抑制能够抑制HeLa细胞生长及增殖。细胞生长及增殖。第50页 Genomic chiplScreen specimens to determine gene copy number changeslEstablish correlations between gene copy number changes and disease biologylDetermine the interaction of multiple genes on the initiation and progression of diseaselAccelerate development of products for genomic disease management to guide therapeutic interventionlCombined with expression chips,gives full understanding of disease process第51页三、芯片技术应用1 基因表示分析基因表示分析 分析基因表示时空特征分析基因表示时空特征 检测基因差异表示检测基因差异表示 发觉新基因发觉新基因 大规模测序大规模测序第52页 DNA序列测定序列测定 人类基因组计划人类基因组计划 判别和测定人类基因判别和测定人类基因DNA序序列列,杂交测序杂交测序 sequencing by hybridization,SBH 建立在特定序列建立在特定序列DNA与特定长度寡核苷与特定长度寡核苷酸集合杂交基础之上。未知酸集合杂交基础之上。未知DNA序列能够经序列能够经过判定与靶过判定与靶DNA序列形成完整双链体寡核苷序列形成完整双链体寡核苷酸重合区域来确定；酸重合区域来确定；65536个八核苷酸点阵可个八核苷酸点阵可测定约测定约200个核苷酸序列；一百万个十二核苷个核苷酸序列；一百万个十二核苷酸点阵可测定约酸点阵可测定约1000个碱基对。个碱基对。第53页2 基因型、基因突变和多态性分析基因型、基因突变和多态性分析 分析基因组中不一样基因与性状或疾病关系分析基因组中不一样基因与性状或疾病关系 3 疾病诊疗与治疗疾病诊疗与治疗 遗传病相关基因定位，产前筛查与诊疗遗传病相关基因定位，产前筛查与诊疗 肿瘤诊疗肿瘤诊疗 感染性疾病诊疗感染性疾病诊疗 基因突变检测与遗传病和肿瘤诊疗基因突变检测与遗传病和肿瘤诊疗大量大量 平行测定平行测定第54页4.药品研究中应用药品研究中应用 新药开发新药开发 发觉药品新功效发觉药品新功效 调查药品处理细胞后基因表示情况调查药品处理细胞后基因表示情况 对药品进行毒性评价对药品进行毒性评价 在基因水平上寻找药品靶标，毒性对在基因水平上寻找药品靶标，毒性对 基因影响。基因影响。第55页其它其它病原体检出病原体检出肿瘤相关基因表示谱肿瘤相关基因表示谱 位点突变位点突变 耐药基因检测耐药基因检测 疾病分子分型疾病分子分型 HLA分型分型第56页l基因芯片缺点基因芯片缺点 不能对待检测基因在组织中准确定位进行判断。另外很多蛋白质功效不是主要依赖是否表示或表示量高低，而是依赖蛋白质磷酸化/去磷酸化等方式。在这种情况下，用核酸类生物芯片就没有什么意义，蛋白类芯片可能会有所作为。l不能盲目崇敬高精尖端技术和仪器设备。实事不能盲目崇敬高精尖端技术和仪器设备。实事求是，定位明确，按规律办事。求是，定位明确，按规律办事。第57页生物芯片未来生物芯片未来第58页l 您只需提供保存完好组织或细胞标本，企业芯片技术服务人员就可替您完成实验操作与数据分析，向您提供由您所选任何一个芯片实验结果，可认为您节省大量时间与精力。l 客户样品RNA抽提RNA质量检测cDNA模板制备实时定量PCR芯片数据处理提供实验报告第59页细胞凋亡细胞凋亡PCR芯片芯片细胞周期细胞周期PCR芯片芯片血管生成血管生成PCR芯片芯片肿瘤转移肿瘤转移PCR芯片芯片癌通路发觉者癌通路发觉者PCR芯片芯片DNA损伤信号通路损伤信号通路PCR芯片芯片氧化应激与抗氧化氧化应激与抗氧化PCR芯片芯片应激和毒性通路发觉者应激和毒性通路发觉者PCR芯芯片片肿瘤药品耐受和代谢肿瘤药品耐受和代谢PCR芯片芯片细胞因子细胞因子PCR芯片芯片乳腺癌和雌激素受体信号通路乳腺癌和雌激素受体信号通路PCR芯片芯片药品代谢药品代谢PCR芯片芯片内皮细胞生物学功效研究内皮细胞生物学功效研究PCR芯片芯片骨再生骨再生PCR芯片芯片干细胞干细胞PCR芯片芯片动脉粥样硬化动脉粥样硬化PCR芯片芯片糖尿病糖尿病PCR芯片芯片趋化因子与受体趋化因子与受体PCR芯片芯片第60页l生长因子生长因子PCR芯片芯片l炎症细胞因子与受体炎症细胞因子与受体PCR芯片芯片l干扰素及其受体干扰素及其受体PCR芯片芯片lTh1-Th2-Th3PCR芯片芯片lToll样蛋白受体信号转导样蛋白受体信号转导PCR芯片芯片l细胞外基质与粘连分子细胞外基质与粘连分子PCR芯片芯片l神经营养素与受体神经营养素与受体PCR芯片芯片l低氧信号通路低氧信号通路PCR芯片芯片第61页l胰岛素信号通路胰岛素信号通路PCR芯片芯片lJAK/STAT信号通路信号通路PCR芯片芯片lMAPK信号转导通路信号转导通路PCR芯片芯片lNF-kB信号通路信号通路PCR芯片芯片l一氧化氮一氧化氮PCR芯片芯片lNotch信号通路信号通路PCR芯片芯片l信号转导通路发觉者信号转导通路发觉者PCR芯片芯片lTGFb/BMP信号通路信号通路PCR芯片芯片lTNF配体及受体配体及受体PCR芯片芯片lWnt信号通路信号通路PCR芯片芯片l管家管家PCR芯片芯片第62页第四节第四节 蛋白质芯片及应用蛋白质芯片及应用第63页l蛋白质芯片蛋白质芯片 是指以蛋白质分子作为配基，将是指以蛋白质分子作为配基，将其有序地固定在固相载体表面形成微阵列，用其有序地固定在固相载体表面形成微阵列，用标识了荧光蛋白质或其它它分子与之作用，洗标识了荧光蛋白质或其它它分子与之作用，洗去未结合成份，经荧光扫描等检测方式测定芯去未结合成份，经荧光扫描等检测方式测定芯片上各点荧光强度，来分析蛋白之间或蛋白与片上各点荧光强度，来分析蛋白之间或蛋白与其它分子之间相互作用关系。其它分子之间相互作用关系。l又称为又称为蛋白质阵列蛋白质阵列或或蛋白质微阵列蛋白质微阵列（protein microarray）第64页l依据其固定生物分子不一样，能够分为依据其固定生物分子不一样，能够分为受体配受体配体检测芯片，抗原芯片，抗体芯片体检测芯片，抗原芯片，抗体芯片l依据芯片载体不一样，分为普通玻璃载玻片，依据芯片载体不一样，分为普通玻璃载玻片，多孔凝胶覆盖芯片和微孔芯片多孔凝胶覆盖芯片和微孔芯片3种主要形式。种主要形式。普遍应用是玻璃片，另外也能够应用普遍应用是玻璃片，另外也能够应用PVDF膜，膜，聚丙烯酰氨凝胶，硝化纤维素膜，聚苯乙烯聚丙烯酰氨凝胶，硝化纤维素膜，聚苯乙烯微珠，磁性微珠等微珠，磁性微珠等 第65页蛋白质芯片分类蛋白质芯片分类l蛋白质检测芯片蛋白质检测芯片l蛋白质功效芯片蛋白质功效芯片第66页与基因芯片比较与基因芯片比较1.蛋白质是基因表示最终产物蛋白质是基因表示最终产物,靠近生命活动靠近生命活动物质层面物质层面 2.探针蛋白特异性高、亲和力强探针蛋白特异性高、亲和力强,可简化样品可简化样品前处理，甚至可直接利用生物材料，血样、前处理，甚至可直接利用生物材料，血样、尿样、细胞及组织等进行检测尿样、细胞及组织等进行检测3.适合高通量筛选与靶蛋白作用化合物适合高通量筛选与靶蛋白作用化合物4.有利于了解药品或毒物与其效应相关蛋白质有利于了解药品或毒物与其效应相关蛋白质相互作用相互作用第67页蛋白质芯片技术原理 蛋白质芯片技术主要包含四个基本关键蛋白质芯片技术主要包含四个基本关键点点1.芯片阵列构建芯片阵列构建2.样品制备样品制备3.芯片生化反应芯片生化反应4.信号检测及分析信号检测及分析第68页提出生物学问题（实验目）样品预处理样品预处理（重组蛋白，（重组蛋白，制备一、二级抗体，制备一、二级抗体，荧光标识）荧光标识）生化反应生化反应化学偶合，加底物，化学偶合，加底物，反应温度和时间，反应温度和时间，冲洗条件冲洗条件检测检测（荧光和比色扫描或拍照，（荧光和比色扫描或拍照，参数设置）参数设置）数据分析和建模数据分析和建模 图象量化，标准化图象量化，标准化建立模型）建立模型）1 12 23 34 45 5蛋白质芯片制备蛋白质芯片制备6 6第69页 首先将蛋白按设计阵列方式点印在介质上，首先将蛋白按设计阵列方式点印在介质上，样品蛋白质与芯片反应，然后用经过能够样品蛋白质与芯片反应，然后用经过能够是酶、荧光、同位素、生物素等是酶、荧光、同位素、生物素等标识蛋白标识蛋白质与芯片质与芯片-蛋白质复合物结合蛋白质复合物结合，经过激光共，经过激光共聚焦显微镜和聚焦显微镜和CCD摄影机对标识信号进行摄影机对标识信号进行扫描分析扫描分析第70页l蛋白质芯片关键技术是蛋白芯片制备和反应蛋白质芯片关键技术是蛋白芯片制备和反应信号检测分析。所以信号检测分析。所以蛋白质纯度蛋白质纯度,蛋白质固蛋白质固定定是蛋白质芯片技术重点和难点。是蛋白质芯片技术重点和难点。l因为蛋白质分子活性依赖于不一样折叠方式，因为蛋白质分子活性依赖于不一样折叠方式，所以对芯片表面修饰至关主要，要确保被点所以对芯片表面修饰至关主要，要确保被点在芯片上蛋白质不失活而又能牢靠固定在芯在芯片上蛋白质不失活而又能牢靠固定在芯片上。片上。第71页 对最普遍应用玻璃片而言，用于制备蛋白对最普遍应用玻璃片而言，用于制备蛋白质芯片方法主要有质芯片方法主要有戊二醛修饰法、聚赖氨戊二醛修饰法、聚赖氨酸修饰法、巯基修饰法和多糖修饰法等酸修饰法、巯基修饰法和多糖修饰法等第72页面临问题 成本过高成本过高,需一系列昂贵尖端仪器，芯需一系列昂贵尖端仪器，芯片标准化问题，提升芯片特异性、简化片标准化问题，提升芯片特异性、简化样品制备和标识操作程序、增加信号检样品制备和标识操作程序、增加信号检测灵敏度和消除芯片背景对于结果分析测灵敏度和消除芯片背景对于结果分析影响等影响等第73页Protein chip应用应用lDiagnostic immunoassay simultaneous high-throughput analysis of known auto-antigens.lProtein-Protein Interaction.lDNA-Protein Interaction第74页Protein chip应用应用l 微生物感染病原体抗原、抗体检测微生物感染病原体抗原、抗体检测l 本身抗体检测本身抗体检测l 特定蛋白检测特定蛋白检测l HLA HLA分型分型l 过敏原检测过敏原检测l 肿瘤标志检出肿瘤标志检出第75页结语结语新技术启示新技术启示l“自强自强”语出周易语出周易“天行健、天行健、君子以自强不息君子以自强不息”。l“求是求是”语出汉书语出汉书“修学好修学好古，实事求是古，实事求是”。l“拓新拓新”意为创新，不停进取意为创新，不停进取。第76页Thank you!第77页