蜡样芽孢杆菌NJSZ-13中蛋白酶ATP-α与ClpX的杀线虫活性研究.pdf

DOI:10.12171/j.10001522.20220231蜡样芽孢杆菌 NJSZ-13 中蛋白酶 ATP-与ClpX 的杀线虫活性研究孙玉凤谈家金袁裕超赵晓佳叶建仁（南京林业大学林草学院，南方现代林业协同创新中心，江苏南京210037）摘要:【目的】阐明蜡样芽孢杆菌 NJSZ-13 中杀线蛋白酶 ATP-与 ClpX 的杀线分子机制，构建杀线蛋白酶 ATP-与ClpX 的原核表达载体。【方法】克隆杀线蛋白酶编码基因 atpA 与 clpX，利用基因工程手段对杀线蛋白酶编码基因进行PCR扩增，并与载体 pET-21b 连接构建重组载体，提取重组质粒转入蛋白表达载体大肠杆菌 BL21（DE3）。利用菌落PCR 和测序验证转化效果。加入 IPTG 诱导蛋白表达，使用 Ni-NTA 柱进行重组蛋白的纯化，利用 SDS-PAGE 与Westernblot 验证 ATP-与 ClpX 纯化效果并进行杀线活性测定。【结果】菌落 PCR 验证和测序表明，重组载体中含有蛋白酶编码基因 atpA 与 clpX，且基因序列与参考序列一致，证明目的基因已经成功插入 BL21（DE3）表达载体中。SDS-PAGE 与 Westernblot 验证表明，重组蛋白得到正确诱导与纯化，成功构建杀线蛋白酶 ATP-与 ClpX 的原核表达载体。杀线活性测定结果表明 ATP-与 ClpX 均具有较强的杀线效果。ATP-在 72h 达到 66.75%的杀线率，ClpX 在 72h达到 75.46%的杀线率。同时，两个蛋白酶共同作用杀线能力显著增强，24h 便达到 66.32%的杀线率，72h 杀线率达到91.01%。【结论】ATP-与 ClpX 经原核表达及纯化后具有较高的杀线活性，且两者共同处理松材线虫，杀线效果更强，证明蛋白酶 ATP-与 ClpX 是重要的杀线因子，为设计和筛选杀线药物提供了新的线索和依据。关键词：蜡样芽孢杆菌 NJSZ-13；松材线虫；ATP-；ClpX；原核表达中图分类号：S763.18文献标志码：A文章编号：10001522(2024)04008407引文格式：孙玉凤，谈家金，袁裕超，等.蜡样芽孢杆菌 NJSZ-13 中蛋白酶 ATP-与 ClpX 的杀线虫活性研究 J.北京林业大学学报，2024，46(4)：8490.SunYufeng,TanJiajin,YuanYuchao,etal.ProkaryoticexpressionofnematicidalproteasesATP-andClpXfromBacillus cereusNJSZ-13J.JournalofBeijingForestryUniversity,2024,46(4):8490.Prokaryotic expression of nematicidal proteases ATP-andClpX from Bacillus cereus NJSZ-13SunYufengTanJiajinYuanYuchaoZhaoXiaojiaYeJianren(Co-InnovationCenterfortheSustainableForestryinSouthernChina,CollegeofForestryandGrassland,NanjingForestryUniversity,Nanjing210037,Jiangsu,China)Abstract:ObjectiveInordertoelucidatethemolecularmechanismofnematicidalproteasesATP-andClpXinBacillus cereusNJSZ-13,prokaryoticexpressionvectorsofnematicidalproteasesATP-andClpXwereconstructed.MethodThenematicidase-encodinggenesatpAandclpXwerecloned,PCR-amplifiedthenematicidase-encodinggenebymeansofgeneticengineeringandconnectedwiththevectorpET-21btoconstructarecombinantvector.Therecombinantplasmidwasextractedandtransferredintotheproteinexpression vector E.coli BL21(DE3).The transformation effect was verified by colony PCR andsequencing.IPTGwasaddedtoinduceproteinexpression,andtherecombinantproteinwaspurifiedusingaNi-NTAcolumn.ThepurificationeffectofATP-andClpXwasverifiedbySDS-PAGEandWesternblot,andthenematicidalactivitywasdetermined.ResultColonyPCRverificationandsequencingshowedthat收稿日期:20220610修回日期:20230627基金项目:国家重点研发计划（2021YFD1400900）。第一作者:孙玉凤。主要研究方向：微生物学。Email：地址：210037江苏省南京市龙蟠路 159号南京林业大学。责任作者:谈家金，博士，教授。主要研究方向：森林保护学。Email：地址：同上。本刊网址:http:/；http:/第46卷第4期北京林业大学学报Vol.46，No.42024年4月JOURNALOFBEIJINGFORESTRYUNIVERSITYApr.，2024the recombinant vector contained protease-encoding genes atpA and clpX,and the gene sequence wasconsistentwiththereferencesequence,provingthatthetargetgeneshadbeensuccessfullyinsertedintotheBL21(DE3)expressionvector.SDS-PAGEandWesternblotshowedthattherecombinantproteinwascorrectlyinducedandpurified,andtheprokaryoticexpressionvectorsofnematicideproteaseATP-andClpXweresuccessfullyconstructed.TheresultsofnematicidalactivityassayshowedthatbothATP-andClpXhadstrongnematicidaleffects.ATP-reachedanematicidalrateof66.75%at72h,andClpXreachedanematicidalrateof75.46%at72h.Atthesametime,theabilityofthetwoproteasesworkingtogethertokillthenematodeswasgreatlyenhanced,showingthatthenematicidalrateof66.32%in24hand91.01%in72h.ConclusionATP-andClpXhavehighernematicidalactivityafterprokaryoticexpressionandpurification,andthetwotogetherhavestrongernematicidaleffectonB.xylophilus.ItisprovedthatproteaseATP-andClpXareimportantkillingfactors,whichprovidesnewcluesandbasisforthedesignandscreeningofkillingdrugs.Key words:Bacillus cereusNJSZ-13;Bursaphelenchus xylophilus;ATP-;ClpX;prokaryoticexpression松材线虫病是由松材线虫（Bursaphelenchusxylophilus）引起的一种全球性重大检疫性森林病害，成灾面积巨大，对我国林业生产和生态环境产生极大影响，造成巨大经济损失1。目前针对松材线虫病的防治对策包括疫木除治隔离、培育抗病树种、媒介昆虫防治、化学药剂防治等2。利用化学药剂治理松材线虫病见效快，效果好，但化学药剂易污染生态环境，且长期频繁使用易使线虫产生抗药性，使得利用化学药剂治理松材线虫受到一定限制。基于使用药物治理松材线虫可能引起的环境和健康问题，开发生防剂控制松材线虫显得尤为重要3。各国科学家开始以真菌、细菌等为研究对象，探索致死松材线虫的毒力因子。生防细菌可以通过产生毒素、分泌胞外蛋白酶以及捕食线虫等多种方式杀死松材线虫4。例如苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis）、放线菌等均能够分泌毒素杀死松材线虫56，在松材线虫的防治中得到了广泛的研究和应用。Huang 等78报道了水解酶参与宿主感染的步骤。Niu 等910研究发现芽孢杆菌 B16 能够分泌丝氨酸蛋白酶 Bace16 和中性蛋白酶 Bae16，均能够破坏线虫体壁，降解线虫体表角质层。现已发现苏云金芽孢杆菌、坚强芽孢杆菌（Bacillus firmus）、穿刺芽孢杆菌（Bacillus penetrans）等多种对植物寄生线虫有拮抗活性的细菌11。研究发现在健康植物体内或植物附近土壤中能够筛选到对松材线虫具有高效拮抗活性的细菌，李亮亮等12从南京中山陵湿地松（Pinus elliottii）茎部分离到一株蜡样芽孢杆菌 NJSZ-13，研究表明该菌株对松材线虫有显著的杀线作用。本研究从蜡样芽孢杆菌 NJSZ-13 与松材线虫混合后的上清中获得蛋白酶 ATPsynthasesubunitalpha（ATP-）与 ATP-dependent Clp protease ATP-bindingsubunitClpX（ClpX），通过构建蛋白酶编码基因 atpA 与 clpX 原核表达载体，在大肠杆菌中异源表达并进行杀线活性测定，以确定 ATP-与 ClpX是否具有杀线活性，为全面解析蛋白酶功能提供参考，也为松材线虫病的生防菌剂研究提供新的思路。1材料与方法1.1 材料蜡样芽孢杆菌 NJSZ-13、松材线虫 AMA3、质粒pET-21b 和大肠杆菌（Escherichia coli）DH5 均由南京林业大学森林病理实验室保存。Ni-NTA1mL购自上海生工生物工程股份有限公司，ECL 显影液购自上海 biosharp 公司，质粒提取试剂盒与胶回收试剂盒购自南京诺唯赞公司，反转录试剂与蛋白表达载体 BL21（DE3）感受态购自北京全式金生物，PCR 产物纯化试剂盒与感受态制备试剂购自北京TAKARA 生物，一抗 His-Tag（2A8）MousemAb 与二抗 GoatAnti-MouseIgG-HRP 购自上海 ABMART，限制性内切酶 EcoRV 购自北京 NEB 公司，细菌RNA 提取试剂盒（BacterialRNAKitR6950）购自上海吉诺生物科技有限公司。1.2 方法1.2.1基因组 RNA 的提取及 atpA 与 clpX 的克隆提取 NJSZ-13 细菌 RNA 并反转录合成 cDNA，以 cDNA 基因组为模板，根据基因序列设计 atpA与 clpX 的特异引物（表 1）并进行 PCR 扩增。PCR反应条件：95 预变性 3min；95 变性 15s，61 退火 15s，72 延伸 2min30s，共 35 个循环；72 彻底延伸 5min。用 1%琼脂糖凝胶电泳进行验证，切取目的片段利用 Vazyme 胶回收试剂盒收集纯化产物。1.2.2原核表达载体的构建提取载体 pET-21b 质粒并使用 EcoRV 进行单第4期孙玉凤等：蜡样芽孢杆菌 NJSZ-13 中蛋白酶 ATP-与 ClpX 的杀线虫活性研究85酶切，将 atpA 和 clpX 的 PCR 纯化产物与酶切载体pET-21b 连接。制备大肠杆菌 DH5感受态，将连接产物转入感受态细胞中，加入 Luria-Bertani（LB）液体培养基摇培 1h 后涂布于含有氨苄青霉素（Amp）的 LB 平板上 37 培养 1216h，挑取单菌落进行菌落 PCR 鉴定。鉴定正确后送南京思普金生物科技有限公司测序。提取测序正确的阳性转化子提取重组质粒，将重组质粒转入蛋白表达载体大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞中，并在含有 Amp 的 LB 平板上 37 培养 1216h。挑取阳性菌落进行 PCR鉴定并送至南京思普金公司测序。1.2.3ATP-和 ClpX 的诱导表达挑取验证正确的阳性菌株接入含 Amp 的 LB液体培养基中，37、200r/min 的条件下过夜活化培养。按 150 的比例将过夜活化的培养物接入含 Amp 的 LB 液体培养基中培养至 OD600约为0.40.6，以使大肠杆菌处于最适合表达外源蛋白的生长状态。向 3 瓶菌液中加入异丙基-D-硫代半乳糖 苷（Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside，IPTG）至终浓度为 0.5mmol/L，分别置于 16、110r/min摇培 16h，25、180r/min 摇培 12h，37、200r/min摇培 3h，诱导蛋白表达。使用细胞破碎仪超声破碎菌体，分别收集上清和沉淀，沉淀用 1PBS 缓冲液重悬，进行 SDS-PAGE 验证蛋白表达情况。1.2.4ATP-和 ClpX 的纯化选择最优诱导条件按 1.2.3 所述方法进行重组蛋白的大量诱导，收集诱导后的菌体上清使用 Ni-NTA 蛋白纯化柱进行重组蛋白酶的纯化，并进行SDS-PAGE 验证重组蛋白酶的纯化效果。1.2.5原核表达蛋白酶的 Westernblot 鉴定纯化蛋白酶 ATP-和 ClpX 经 SDS-PAGE 后电转至 PVDF 膜，一抗按 15000比例稀释，将膜置于一抗中孵育 1.5h，结束后 1PBST 洗涤 3 次。二抗按 110000 比例稀释，将膜浸没于二抗中室温避光孵育 30min，结束后 1PBST 洗涤 3 次。将 PVDF膜平铺于成像仪 X 光胶片暗盒中，并滴加 ECL 显影液进行显色。扫描图片，观察结果。1.2.6ATP-和 ClpX 杀线活性测定在 1.5mL 离心管中分别加入 200L 纯化蛋白酶ATP-、ClpX 以及100LATP-与100LClpX 的混合物，随后向每个离心管中分别加入 200L 松材线虫虫液（约 2000 条），置于 25 黑暗条件下静置。每隔 24h 从每个离心管中吸取 20L（大约 50条松材线虫）样本，通过显微镜观察线虫的运动状态来判断其死亡情况（以针持续戳刺不动视为死亡）。以 1PBS 为对照处理，每个处理组重复 5 次。使用 SPSS 对试验数据进行单因素方差分析，分析各处理组之间杀线活性的差异。2结果与分析2.1 杀线蛋白酶编码基因atpA与clpX的克隆杀线蛋白酶 ATP-与 ClpX 的编码基因 atpA与 clpX 经 PCR扩增、连接转化试验和菌落 PCR 验证后结果如图 1、2 所示。图 1 中经凝胶电泳检测显示扩增片段位于 10002000bp 之间，与 ATP-预测（1509bp）符合。未经过 EcoRV 酶切的 pET-21b载体与经 EcoRV 单酶切的载体比较显示载体被成功切开。菌落 PCR 产物电泳检测结果显示，条带大小与 ATP-克隆片段（1509bp）符合。图 2 中扩增片段稍高于 1000bp，与 ClpX 预测（1335bp）符合。菌落 PCR 产物电泳条带与 ClpX 克隆片段（1335bp）大小符合。测序结果显示，重组载体中含有 atpA 基因与 clpX 基因，且基因序列与参考序列一致，表明杀线蛋白酶 ATP-与 ClpX 的编码基因得到成功克隆。2.2 原核表达载体的构建将转入重组质粒的大肠杆菌BL21（DE3）进行PCR菌落鉴定，结果显示条带位置与预期位置一致（图 3）。将阳性转化子送南京思普金公司进行测序，证明目的基因已经成功插入 BL21（DE3）表达载体中。2.3 ATP-与 ClpX 的诱导表达在16、25、37 条件下，原核表达蛋白酶ATP-与ClpX 均获得表达（图 4）。与对照组相比，目标蛋白酶 ATP-和 ClpX 分别于 55kDa 和 48kDa 处获得集中表达。并且ATP-与ClpX 在16、110r/min 摇培 16h 的诱导条件下获得集中表达且包涵体较少。因此，16、110r/min 摇培 16h 为最佳诱导条件。2.4 ATP-与 ClpX 的纯化将经 IPTG 诱导表达后的 ATP-与 ClpX 使用表1PCR 引物Tab.1Polymerasechainreactionprimers基因名称Genename正向引物Forwardprimer反向引物ReverseprimeratpAAATGGGTCGGGATCCGAATTCATGAGCATCAGAGCTGAAGAAATTTTGTCGACGGAGCTCGAATTCTTCAGAAGCTACGAATACTTTCclpXAATGGGTCGGGATCCGAATTCATGTATTTACATACGATACATTTATCGTGTACTTGTCGACGGAGCTCGAATTCTGCAGATGTTTTTGTATCAAGTACAGTA注：划线部分为同源臂序列。Note:theunderlinedpartisthesequenceofthehomologousarms.86北京林业大学学报第46卷Ni 柱纯化后进行 SDS-PAGE 电泳检测，结果显示原核表达蛋白酶 ATP-与 ClpX均呈现为单一条带（图 5），表明 ATP-与 ClpX 得以彻底纯化。2.5 原核表达蛋白酶的 Western blot 鉴定由于所构建的杀线蛋白酶原核表达载体 pET-21b带有 His 检测标记，应用特异性 His 标签抗体，通过12121232 000 bp5 000 bp2 000 bp750 bp1 509 bp100 bp3 000 bp2 000 bp1 500 bp1 000 bp750 bp500 bp250 bp100 bp1 509 bp1 000 bp750 bp500 bp250 bp100 bpa atpA 全长的 PCR 扩增PCR amplification of the full length of atpA b pET-21b 载体过 EcoR V 单酶切验证 pET-21b vector verified by EcoR Vsingle digestionc 菌落 PCR 验证Colony PCR validation图 a：1 表示 2000bpDNAladder+marker；2 表示 atpA 克隆条带。图 b：1 表示 5000bpDNAladder+marker；2 表示未经过 EcoRV 酶切的pET-21b 载体；3 表示经过 EcoRV 酶切的 pET-21b 载体。图 c：1 表示 2000bpDNAladder+marker；2 表示 atpA 转化子（DH5）。InFig.a,1indicates2000bpDNAladder+marker,2indicatesatpAcloneband.InFig.b,1indicates5000bpDNAladder+marker,2indicatespET-21bvectornotdigestedwithEcoRV,3indicatespET-21bvectordigestedwithEcoRV.InFig.c,1indicates2000bpDNAladder+marker,2indicatesatpAtransformant(DH5).图1ATP-蛋白编码基因 atpA 基因的克隆Fig.1ATP-cloningoftheproteincodinggeneatpA2 000 bp1 335 bp1 335 bp12121 000 bp750 bp500 bp250 bp100 bpa clpX 全长的 PCR 扩增PCR amplification of the full length of clpXb 菌落 PCR 验证Colony PCR validation2 000 bp1 000 bp500 bp100 bp图 a：1 表示 2000bpDNAladder+marker；2 表示 clpX 克隆条带。图 b：1 表示 2000bpDNAladder+marker；2 表示 clpX 转化子（DH5）。InFig.a,1indicates2000bpDNAladder+marker,2indicatesclpXcloneband.InFig.b,1indicates2000bpDNAladder+marker,2indicatesclpXtransformant(DH5).图2ClpX 蛋白编码基因 clpX 基因的克隆Fig.2CloningofClpXproteincodinggeneclpX2 000 bp1 509 bp1 335 bp12121 000 bp750 bp500 bp250 bp100 bpa atpA 基因菌落 PCR 验证atpA gene colony PCR verificationb clpX 基因菌落 PCR 验证clpX gene colony PCR verification2 000 bp1 000 bp750 bp500 bp250 bp100 bp图 a：1 表示 2000bpDNAladder+marker；2 表示 atpA 转化子 BL21(DE3)。图 b：1 表示 2000bpDNAladder+marker；2 表示 clpX 转化子BL21(DE3)。InFig.a,1indicates2000bpDNAladder+marker,2indicatesatpAtransformantBL21(DE3).InFig.b,1indicates2000bpDNAladder+marker,2indicatesclpXtransformantBL21(DE3).图3atpA 与 clpX 在大肠杆菌 BL21(DE3)中的诱导表达Fig.3InducibleexpressionofatpAandclpXinE.coliBL21(DE3)第4期孙玉凤等：蜡样芽孢杆菌 NJSZ-13 中蛋白酶 ATP-与 ClpX 的杀线虫活性研究87免疫印迹试验对原核表达蛋白酶 ATP-和 ClpX 的纯化效果进行检测和鉴定。结果显示在全菌裂解液上清中，ATP-和 ClpX 均有 His 抗体检测阳性的目标蛋白表达，而对照组没有检测出带有 His 标签的阳性蛋白（图 6）。上述结果与 SDS-PAGE 的检测结果相吻合，说明在上述诱导条件下，实现了 ATP-和 ClpX 的原核表达，且 ATP-和 ClpX 大小分别为55kDa 和 48kDa，与预期分子量一致。2.6 原核表达蛋白酶的杀线活性测定使用纯化蛋白酶 ATP-与 ClpX 处理松材线虫，结果显示，ATP-与 ClpX 在 24h 是杀线率较低，但仍显著高于对照组 PBS 处理的杀线率，随着时间推移杀线率越来越高，ATP-在 72h 达到了 66.75%的杀线率，ClpX 在 72h 达到了 75.46%的杀线率（表 2），与对照相比差异显著。此外，用两个蛋白酶180 kDa100 kDa63 kDa48 kDa35 kDa25 kDa17 kDa11 kDaa 载体 pET-21b 诱导表达 SDS-PAGE 验证Vector pET-21b induced expression verified by SDS-PAGEc ClpX 诱导表达 SDS-PAGE 验证ClpX-induced expression verified by SDS-PAGEb ATP-诱导表达 SDS-PAGE 验证ATP-induced expression verified by SDS-PAGE180 kDa100 kDa63 kDa48 kDa35 kDa25 kDa17 kDa11 kDa180 kDa100 kDa63 kDa48 kDa35 kDa25 kDa17 kDa11 kDaM123456M123456M123456M.蛋白分子量彩虹 marker。1.16 上清；2.16 沉淀；3.25 上清；4.25 沉淀；5.37 上清；6.37 沉淀。M,proteinmolecularmassrainbowmarker.1,16supernatant;2,16precipitation;3,25supernatant;4,25precipitation;5,37supernatant;6,37precipitation.图4ATP-与 ClpX 诱导表达 SDS-PAGE 分析Fig.4SDS-PAGEanalysisofinducedexpressionofATP-andClpXM12120 kDa70 kDa55 kDa45 kDa25 kDa15 kDaM.蛋白分子量彩虹 marker；1.ATP-；2.ClpX。M,proteinmolecularmassrainbowmarker;1,ATP-;2,ClpX.图5ATP-和 ClpX 的纯化结果分析Fig.5AnalysisofpurificationresultsofATP-andClpXM123120 kDa70 kDa55 kDa35 kDa15 kDa25 kDaM.蛋白分子量彩虹 marker；1.ATP-；2.ClpX；3.空载体对照。M,proteinmolecularmassrainbowmarker;1,ATP-;2,ClpX;3,emptyvectorcontrol.图6ATP-和 ClpX 的 Westernblot 检测Fig.6WesternblotdetectionofATP-andClpX88北京林业大学学报第46卷同时处理松材线虫，杀线能力大大增强，24h 便达到 66.32%的杀线率，72h 杀线率达 91.01%。表2ATP-与 ClpX 的杀线活性测定Tab.2DeterminationofnematodeactivityofATP-andClpX处理Treatment松材线虫死亡率B.xylophilusmortality/%24h48h72hATP-12.331.74c34.842.45b66.572.13cClpX18.752.17b33.342.05b75.462.64bATP-+ClpX66.321.53a74.911.57a91.010.62aPBS2.740.56d5.910.78c7.781.18d3讨论近年来利用细菌防治松材线虫成为新的突破口13。线虫的角质层是一种坚硬的具有多层细胞外结构的外骨骼，由结构成分、可溶性蛋白和脂质组成，是防止松材线虫受到外界损害的有效屏障14。因此，蛋白酶、胶原酶和几丁质酶等在松材线虫生物防治中越来越受到重视15。据报道，多种细菌能够分泌蛋白酶或晶体蛋白等毒性物质，对松材线虫有很好的杀线效果16。牛秋红等17从土壤样本中分离得到 6 株松材线虫生防细菌，其中菌株 NS-3 的上清蛋白粗提物处理松材线虫 48h 后死亡率达到 100%。对致病菌而言，宿主免疫应答与蛋白降解系统紧密联系，蛋白酶一直被认为是致病菌的重要毒力因子。研究发现结核分枝杆菌可分泌 16 类蛋白酶，其中蛋白酶与结核分枝杆菌的致病性相关18。克隆具有杀线活性的毒性蛋酶编码基因，利用该基因的编码产物或通过转基因技术来防治线虫，现已成为松材线虫生物防治中最具前景的一个方面。蛋白酶 ATP-与 ClpX 最初均发现于大肠杆菌，分别由 atpA 基因与 clpX 基因所编码，广泛分布于原核生物和真核生物中1920。atpA 基因突变可导致细菌中氨基酸的变化21。ATP 合成酶 F1 亚单位 亚基（ATP-F1-）可作为感染宿主的感染相关蛋白，在细菌的毒力和致病性方面起重要作用。鸭疫里默氏杆菌（Riemerella anatipestifer）中的 ATP-F1-蛋白酶可增强细菌的毒力22。Clp 蛋白酶复合体在细菌的蛋白质降解和平衡稳定中发挥重要作用23。Clp 家族的一些成员已被证明与许多细菌的发病有关2425。ClpX 是依赖于 ATP 的普遍保守的蛋白家族成员之一，可介导底物的降解26。ClpX 在调节细菌毒力表达、能力发展、细菌毒素产生、生物膜形成和应激反应等方面至关重要，还能够以特定蛋白质为目标，直接降解蛋白质2728。对于致病菌而言，ATP-与 ClpX 是细菌毒力所必需的因子。熊曦29发现蜡样芽孢杆菌中 ClpX 能够降解蛋白。Frees 等30发现金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）致病性与其所分泌的蛋白质息息相关，其致病力强弱主要取决于细菌所产生的毒素和侵袭性酶。ClpX 在细菌的生理和毒力方面具有重要作用，而缺乏 ClpX 蛋白酶的突变体产生的几种胞外毒力因子减少。目前关于蛋白酶 ATP-与 ClpX 对松材线虫的作用尚未报道，本研究首次从蜡样芽孢杆菌 NJSZ-13 中分离纯化到两种杀线虫蛋白酶类物质ATP-与 ClpX，分别由 atpA 基因与 clpX 基因所编码。经原核表达纯化并进行杀线虫活性测定后发现均有较好的杀线虫作用，两者共同作用于松材线虫后杀线效果更好，为利用细菌进行高效防治松材线虫奠定了基础。参 考 文 献 张旭,赵京京,闫峻,等.2017 年中国大陆松材线虫病灾害经济损失评估 J.北京林业大学学报,2020,42(10):96106.ZhangX,ZhaoJJ,YanJ,etal.Economiclossassessmentofpinewilt disease in mainland China in 2017J.Journal of BeijingForestryUniversity,2020,42(10):96106.1叶建仁,吴小芹.松材线虫病研究进展 J.中国森林病虫,2022,41(3):110.YeJR,WuXQ.ResearchprogressofpinewiltdiseaseJ.ForestPestandDisease,2022,41(3):110.2Duncan L W.Current options for nematode managementJ.AnnualReviewofPhytopathology,1991,29(1):469490.3张弘弢,赵宇,李晓岩,等.生防细菌杀松材线虫的作用机制及应用 J.中国森林病虫,2021,40(4):2633.ZhangHT,ZhaoY,LiXY,etal.Mechanismandapplicationofbiocontrol bacteria against pine wood nematodeJ.Forest PestandDisease,2021,40(4):2633.4金娜,刘倩,简恒.植物寄生线虫生物防治研究新进展 J.中国生物防治学报,2015,31(5):789800.JinN,LiuQ,JianH.Advancesonbiologicalcontrolofplant-parasitic nematodesJ.Chinese Journal of Biological Control,2015,31(5):789800.5黄冰纷,陈俊梅,李文鹏,等.松材线虫生防放线菌的筛选、鉴定及其毒性因子初步研究 J.北京林业大学学报,2019,41(4):99106.HuangBF,ChenJM,LiWP,etal.Screeningandidentificationof actinomycetes for biological control of Bursaphelenchusxylophilus and preliminary study on their toxicity factorsJ.JournalofBeijingForestryUniversity,2019,41(4):99106.6HuangXW,TianBY,NiuQH,etal.Anextracellularproteasefrom Brevibacillus laterosporus G4 without parasporal crystalscan serve as a pathogenic factor in infection of nematodesJ.ResearchinMicrobiology,2005,156(56):719727.7Huang X W,Zhao N H,Zhang K Q.Extracellular enzymesservingasvirulencefactorsinnematophagousfungiinvolvedininfectionofthehostJ.ResearchinMicrobiology,2004,155(10):811816.8NiuQH,HuangXW,ZhangLQ,etal.Functionalidentification9第4期孙玉凤等：蜡样芽孢杆菌 NJSZ-13 中蛋白酶 ATP-与 ClpX 的杀线虫活性研究89of the gene bace16 from nematophagous bacterium BacillusnematocidaJ.AppliedMicrobiologyandBiotechnology,2007,75(1):141148.NiuQH,HuangXW,TianBY,etal.BacillusspB16killsnematodes with a serine protease identified as a pathogenicfactorJ.AppliedMicrobiologyandBiotechnology,2006,69(6):722730.10余子全,周燚,孙明,等.苏云金芽胞杆菌防治植物寄生线虫的研究进展 J.植物保护学报,2004,31(4):418424.YuZQ,ZhouY,SunM,etal.Progressofresearchesonactivityof Bacillus thuringiensis against plant-parasitic nematodesJ.JournalofPlantProtection,2004,31(4):418424.11李亮亮,谈家金,陈凤毛.两株松材线虫拮抗细菌的筛选和鉴定 J.南京林业大学学报(自然科学版),2017,41(4):3741.LiLL,TanJJ,ChenFM.ThescreeningandidentificationoftwobacterialstrainswithnematicidalactivityagainstBursaphelenchus xylophilusJ.Journal of Nanjing ForestryUniversity(NaturalSciencesEdition),2017,41(4):3741.12牛秋红,黄晓玮,徐进,等.细菌在线虫生防中应用的研究进展 J.生物技术,2006(1):9094.Ni