脂肪因子Chemerin调节结肠癌细胞系迁移及侵袭能力的机制研究.pdf

基金项目：蚌埠医学院自然科学重点项目（）通讯作者：王彬【基础医学】脂肪因子 调节结肠癌细胞系迁移及侵袭能力的机制研究王彬，曹登义，王远鹏，李乃树，崔皖晋（蚌埠医学院第二附属医院，安徽 蚌埠 ）摘要 目的：探讨 对结肠癌细胞侵袭与迁移能力的影响及作用机制。方法：采用不同浓度的 （、）处理结肠癌细胞系 、，通过 法检测细胞的侵袭与迁移能力；以 、细胞为材料进一步研究，分为 组，阴性对照组（）、阴性对照组（）、组与 组，转染后检测各组细胞的侵袭与迁移能力，采用 检测上皮细胞钙黏蛋白（，）、神经钙黏附蛋白（，）和波形蛋白（）水平，采用 法检测 、和 蛋白表达水平。结果：外源性 可提升结肠癌细胞 、侵袭率与迁移数（），且存在剂量依赖性，细胞迁移数与侵袭率 组 组、组 组（）；与蛋白表达水平 组 组、组 组（）；和 与蛋白表达水平 组 组、组 组（）。结论：可能通过调控上皮间充质转化促进结肠癌细胞侵袭与迁移。关键词 结直肠癌；趋化素；侵袭；迁移；上皮间充质转化 ：，（，）：（，），：（），（），年第 卷第 期 （），（），：（），（），（），（）：；结直肠癌（，）是常见的消化道恶性肿瘤。年 发布的对全球 个国家 地区估计数据显示，新发例数与死亡例数分别居第 位与第 位，结肠癌与直肠癌新发例数分别占 与 。明确发病机制、开发敏感的标志物辅助早期诊断与治疗是近年恶性肿瘤研究的重要方向。高脂饮食、肥胖是 的重要危险因素 。脂肪组织是人体最大的内分泌器官，可通过分泌多种蛋白质参与代谢调控，这类蛋白质即为脂肪因子。近年研究显示，脂肪因子及其受体异常可 能 是 肥 胖 诱 导 发 生、进 展 的 关 联 因子 。是近年脂肪因子研究的热点之一，主要由肝脏与脂肪组织合成，在凝血与炎症相关丝氨酸蛋白酶将 末端裂解后被激活，与其受体趋化 素 样 受 体（，）结合后发挥生物学效应 。近年有研究显示，在 中可能扮演着重要角色，患者循环系统中 表达水平显著上升，且与临床病理特征、预后相关 。但 对 发生与进展作用机制尚不明确。本研究通过细胞 学 实 验，探 讨 对 结 肠 癌 细 胞 系 、迁移与侵袭能力的影响，初步分析其可能的作用机制，现将结果总结如下。材料与方法 细胞来源与培养人结肠癌细胞系 、购自 公司，采用含 胎牛血清的 培养基进行培养，置于 、含 的细胞培养箱中。细胞融合度达到 时采用 胰蛋白酶消化传代，采用对数生长期的 细胞系进行后续实验。主要仪器与试剂脂肪因子 购自 公司，缓冲液、培养基购自美国 ，试剂盒与 试剂购自美国 。反转录试剂盒、试剂盒购自美国 ，胰蛋白酶 消化液购自美国 ，上皮细胞钙黏蛋白（，）、神经钙黏附蛋白（，）和波形蛋白（）与 一抗与二抗购自美国 ，基质胶购自北京尼康。小室购自美国 公司。仪（美国 ），细胞培养箱（美国 ），倒置荧光显微镜（日本 ）。方法 细胞处理取对数生长期细胞，采用不同浓度的 溶液处理，即 、，培养 后进行细胞迁移实验，后进行细胞侵袭实验。细胞转染人工合成 全长 插入 载体，构建 高表达细胞，采用 构建低表达 细胞。每种细胞设置以下组：阴性对照组（）、阴性对照（）、组与 组。取对数 年第 卷第 期 生长期细胞，采用 试剂进行转染，转染浓度为 。培养 后进行细胞迁移实验，后进行细胞侵袭实验。细胞迁移实验将转染后 的细胞制成细胞悬液，将细胞密度调整为 ，于 小室下层加入 含有 的 培养基，于上层每孔加入 细胞悬液。将 板置入培养箱中（、含 ）培养 ，甲醛固定，风干小室，结晶紫染色，显微镜观察，选择 个 倍视野进行拍照并计数，计算平均数。实验重复 次。细胞侵袭实验将 胶于 静置 使其变为液态，采用不含血清的预冷培养基按 比例稀释 胶，取 均匀涂抹于 小室上室的聚碳酸酯膜表面，室温下静置 后聚合为凝胶。取各组细胞制成密度为 的细胞悬液。于 孔板加入含 的培养基，将小室置于 孔板，于上室加入 细胞悬液，置于培养箱培养（、含 ）。取出小室，湿棉签擦拭上层细胞与 。甲醛固定，结晶紫染色，洗 次。选择 个 倍视野进行拍照并计数，计算平均值。侵袭率 （实验组侵袭细胞数 对照组侵袭细胞数）。对照组为 组或 组。实验重复 次。实时荧光定量 检测采用 法检测结肠癌细胞系 （）、（）和 水平。用 清洗处理后的细胞，重复 次，完成后置于冰上。加入 裂解液，于冰上静置，依据试剂盒说明书进行总 提取，通过反转录试剂盒反转录为 ，以后者为模板进行 。反应体系 ：，上 游 引 物 ，下游引物 。内参为 （上游引 物：，下 游 引 物：）。上游引物：，下游引物 ；上 游 引 物：，下 游 引 物 ；上游引物：；下 游 引 物：。采 用 相 对 定量法（）计算相对表达量。重复 次。实验通过 法检测 、和 蛋白水平。收集转染后 细胞，用含蛋白酶抑制剂的 裂解液进行蛋白提取，于 凝胶上分离各组细胞蛋白质，完成后转移至 膜。采用 脱脂牛奶进行封闭，行一抗与二抗孵育，采用 化学发光试剂盒进行发光信号检测。统计分析方法 采用 与 软件进行数据处理。定量指标采用均数 标准差进行描述，结果服从正态分布。两组之间比较采用 检验，三组及以上之间比较采用单因素方差分析进行组间比较，两两比较采用 法。为差异有统计学意义。结果 不同浓度 溶液对结肠癌细胞迁移的影响与 组相比，显著增加了 与 细胞迁移数（），且随 浓 度 上 升 呈 增 加 趋 势，但 、组两两比较差异无统计学意义（），其余两两比较差异有统计学意义（）。见图 。图 不同 浓度处理 细胞与 细胞迁移实验结果注：为 ，为 不同浓度 溶液对结肠癌细胞侵袭的影响与 组相比，显著增加了 年第 卷第 期 与 细胞侵袭率（），且随 浓度上升呈升高趋势，而 细胞 、组侵袭率两两比较差异无统计学意义（），其余两两比较差异有统计学意义（）；细胞 、组侵袭率差异无统计学意义（），其余两两比较差异有统计学意义（）。见图 。图 不同 浓度处理 细胞与 细胞侵袭实验结果注：为 ，为 表达对结肠癌细胞迁移与侵袭的影响 过表达的 与 细胞迁移与侵袭能力显著上升，高于 组（）；组细胞迁移与侵袭能力显著下降，低于 组（）。见图 。图 表达对 细胞与 细胞迁移与侵袭能力的影响注：细胞迁移实验结果，细胞迁移实验结果，细胞侵袭实验结果，细胞侵袭实验结果；为 表达对上皮 间质转化（，）标志物表达的影响 和 检测结果显示，与 组 相 比，过 表 达 的 与 细胞，和蛋白表达水平显著下降（），与 和蛋白表达水平显著上升（）；与 组相比，组 和蛋白表达水平增加（），与 和蛋白表达下降（），见图 、图 。图 对 、和 基因表达的影响注：细胞 表达水平，细胞 表达水平，细胞 表达水平，细胞 表达水平，细胞 表达水平，细胞 表达水平；年第 卷第 期 图 实验检测 、和 蛋白表达结果注：细胞 、和 蛋白表达水平，细胞 、和 蛋白表达水平；讨论脂肪因子 编码基因定位在人染色体的 ，包括 个氨基酸序列。与 在早期脂肪细胞的扩增中发挥着重要作用，可通过与 的相互作用调节成熟脂肪细胞生长与代谢 。在肥胖、胰岛素抵抗（，）人群中表达水平显著上升，在肥胖相关疾病的病理生理过程中发挥着重要作用 。近年研究显示，不仅参与脂肪生成、胰岛素代谢与炎症反应等生理过程，也可作用于某些信号通路调控肿瘤的发生与进展，已被证实与肝癌、乳腺癌等恶性肿瘤相关。等 对 例乳腺癌患者的研究显示，患者血清 水平显著高于健康对照，免疫组化检测结果显示乳腺癌组织中 呈高表达，受体 表达水平上升，且 表达水平与 表达、表达、淋巴结转移、远处转移、临床预后相关。近期针对 的相关研究也得出了类似的结果。等 的研究显示，患者血清中 水平显著高于健康对照，且 水平与炎症标志物如血沉、反应蛋白（，）相关。等 的研究进 一 步 验 证 了 上 述 结 果，患 者 循 环 中 水平与肿瘤临床病理参数相关，随着肿瘤恶性程度上升，循环中 表达水平升高。等 通过一项大样本前瞻性队列研究发现，循环中 水平是 的独立危险因素，其与 的发病风险呈线性相关，最高四分位数者较最低四分位数者罹患 风险显著上升（，：）。上述研究提示循环中 可作为 肿瘤标志物，用以辅助早期诊断与预后预测。本研究从细胞学层面探讨了 对结肠癌细胞系生物学行为的影响，结果显示外源性给予 处理可提升结肠癌细胞侵袭与迁移活性，促进恶性生物学行为，高表达的细胞侵袭与迁移活性也显著提升，而抑制 表达可降低迁移与侵袭水平。上述结果提示 在 中表现为促癌效应，可促进肿瘤发展，可作为 的肿瘤标志物。目前认为 可通过多种机制调控肿瘤的生长。表达改变可促进代谢异常，引发肿瘤发生并促进其进展 。具备促血管生成效应，而新生血管大量形成是肿瘤进展的基础。近期一项针对人脐静脉内皮细胞的研究显示，可通过与该类细胞 结合诱导 、磷酸化提升其增殖活性，促进其向毛细血管样结构分化 。提示 可通过诱导新生血管形成来促进肿瘤的发展。等 针对 的研究进一步证实了这个观点，可通过刺激 表达促进肿瘤向正常组织浸润，促进血管生成并介导肿瘤微环境形成，从而加快肿瘤进展。此外，具备较强的促炎效应，可加强肿瘤相关炎症反应，从而影响细胞增殖、侵袭与迁移活性，进一步提升新生血管形成活性 。上皮 间质转化（，）是肿瘤发展的重要生物学过程。过程中上皮细胞黏附能力下降，并获得侵袭与迁移表型 。等 对多形性胶质母细胞瘤（，）的研究显示，可增强肿瘤相关巨噬细胞（，）间充质表型，并通过 轴促进 极化，进一步加强 的间充质特征。上述 年第 卷第 期 结果提示 可促进并维持细胞的间充质特征。但肝癌相关研究得出了否定的结论。等 对肝细胞癌的研究显示，标志物 等与 水平不存在统计学相关，可能并不通过 影响肝细胞癌的进展。本研究探讨了 对结肠癌细胞系 的影响，结果显示，表达水平与 相关，过表达可抑制上皮标志物上皮细胞钙黏蛋白（）表达，并提升神经钙黏附蛋白（）与波形蛋白（）表达，抑制 则可出现相反的效果。上述结果提示，可能通过诱导 的进展与细胞间充质特征维持促进 发展，但具体调控机制还有待进一步研究。综上所述，可提升 细胞侵袭与迁移活性，作用机制可能与 调控相关。可能是 诊断、预后评估潜在标志物，可通过进一步研究探讨其对 细胞的调控机制。参考文献 ，：，（）：，：，（）：，：，（）：，（）：，：，（）：桂敬萍，丁百静，杨勇 脂肪因子在结直肠癌发生发展中作用的研究进展 山东医药，（）：，：，（）：，：，（），（）：，（）：，（），：，（）：，（）：，（）：豆秋彦，冯文，李春霖脂肪因子 在女性常见恶性肿瘤中的作用研究进展 新乡医学院学报，（）：，（）：，（）：，（）：，（）：（收稿日期：）年第 卷第 期