（高清正版）DB32_T3771-2020渔业养殖用水中喹诺酮类抗生素测定液相色谱-串联质谱法.pdf

ICS 65.150 B 51 DB32 江苏地方标准 DB32/T 37712020 渔业养殖用水中喹诺酮类抗生素测定 液相色谱-串联质谱法 Determination of quinolones in aquaculture water by LC-MS/MS 2020-04-08 发布 2020-05-15 实施 江苏省市场监督管理局 发 布 DB32/T 37712020 I 前 言 本标准按照GB/T 1.12009给出的规则起草。本标准由江苏省农业农村厅提出。本标准由江苏省渔业标准化技术委员会归口。本标准起草单位：江苏省淡水水产研究所、江苏省水产质量检测中心。本标准主要起草人：孟勇、沈美芳、朱晓华、杨洪生、王静、张美琴、谭秀慧、刘崇万、王凯、朱凛。DB32/T 37712020 1 渔业养殖用水中喹诺酮类抗生素测定 液相色谱-串联质谱法 1 范围 本标准规定了渔业养殖用水中16种喹诺酮类抗生素残留量的前处理和液相色谱-串联质谱测定方法。本标准适用于渔业养殖用水中恩诺沙星、诺氟沙星、培氟沙星、环丙沙星、氧氟沙星、沙拉沙星、依诺沙星、洛美沙星、萘啶酸、恶喹酸、氟甲喹、丹诺沙星、双氟沙星、奥比沙星、司帕沙星、氟罗沙星16种抗生素残留量的测定。2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其有效版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法。3 原理 水样用混合纤维素滤膜过滤后，喹诺酮类抗生素经固相萃取柱富集、洗脱和净化后，供液相色谱-串联质谱仪测定，内标法定量。4 试剂和材料 4.1 甲醇（CH3OH）。4.2 乙腈（CH3CN）。4.3 甲酸（HCOOH）。4.4 乙酸铵（CH3COONH4）。4.5 氨水（NH3 H2O）：优级纯。4.6 5 mmol/L 乙酸铵缓冲液：称取 0.1925 g 乙酸铵（4.4），溶于 500 mL 水中。用甲酸（4.3）调节pH 为 3 0.05。4.7 5%氨水甲醇溶液：量取5 mL氨水（4.5），用甲醇稀释并定容至100 mL。4.8 0.1%甲酸水溶液：量取 1 mL 甲酸（4.3），用水稀释至 1000 mL。4.9 0.1%甲酸水-乙腈：（9+1，体积比），量取 90mL0.1%甲酸水溶液（4.8）和 10mL 乙腈（4.2）混合。4.10 标准物质：恩诺沙星（Enrofloxacin）、诺氟沙星（Norfloxacin）、培氟沙星（Pefloxacin）、环丙沙星（Ciprofloxacin）、氧氟沙星（Ofloxacin）、沙拉沙星（Sarafloxacin）、依诺沙星（Enoxacin）、洛美沙星（Lomefloxacin）、萘啶酸（Nalidixic acid）、恶喹酸（Oxolinic acid）、氟甲喹（Flumequine）、丹诺沙星（Danafloxacin）、双氟沙星（Difloxacin）、奥比沙星（Orbifloxacin）、司帕沙星（Sparfloxacin）、氟罗沙星（Fleroxacin），纯度97.0%。DB32/T XXXX2020 2 4.11 内标物质：氘代诺氟沙星，氘代环丙沙星、氘代恩诺沙星，纯度97.0%。4.12 喹诺酮类标准储备溶液：分别称取适量喹诺酮类标准品（4.10），用甲醇(4.1)溶解并定容至 10 mL，使各种喹诺酮的浓度均为 1.0 mg/mL。-18以下避光保存，有效期 6 个月。4.13 内标标准储备溶液：分别称取适量内标标准品（4.11），用甲醇(4.1)溶解并定容至 10 mL，使各种内标浓度均为 1.0 mg/mL。-18以下避光保存，有效期 6 个月。4.14 混合标准中间溶液：分别量取适量标准储备溶液(4.12)于 100 mL 棕色容量瓶中，用甲醇稀释配制成浓度为 1 g/mL 的混合标准中间溶液。-18以下避光保存，有效期 3 个月。4.15 混合标准工作溶液：根据需要用0.1%甲酸水-乙腈（4.9）由混合标准中间液（4.14）稀释成合适的混合标准工作溶液，现配现用。4.16 混合内标标准工作溶液：分别量取适量标准储备溶液(4.13)于100 mL棕色容量瓶中，用甲醇稀释配制成浓度为1 g/mL的混合内标标准工作溶液。-18以下避光保存，有效期3个月。注：除另有说明外，以下所用的试剂均为色谱纯，试验用水为GB/T 6682 规定的一级水。5 仪器和设备 5.1 液相色谱-串联四极杆质谱仪，配电喷雾离子源(ESI)。5.2 天平：感量 0.01 g。5.3 分析天平：感量 0.00001 g。5.4 涡旋混合器。5.5 氮吹仪。5.6 pH计：测量精度 0.05。5.7 刻度玻璃离心管：10 mL。5.8 混合纤维素滤膜：0.45 m。5.9 水系滤膜：0.22 m。5.10 固相萃取柱：HLB 固相萃取柱：500 mg，6 mL，或性能相当者。5.11 固相萃取装置。6 样品制备与保存 采集的渔业养殖水样经0.45 m混合纤维素滤膜过滤。如水样较浑浊，可更换滤膜或过滤2次。过滤后的水样于4密封保存，24 h内进行检测。取过滤后的供试样品，作为供试试料。取过滤后的空白样品，作为空白试料。取过滤后的空白样品，添加适宜浓度的标准工作液，作为空白添加试料。7 测定步骤 7.1 提取和净化 依次用6 mL甲醇，6 mL超纯水，6 mL 5 mmol/L乙酸铵缓冲液（4.6）活化小柱（5.10）。量取200 mL过滤后的试样，加入适量甲酸调节水样pH为3.0 0.05，准确加入1g/mL混合内标标准工作液50 L（4.16）。然后以约35 mL/min流速通过固相萃取柱（5.10）。过柱后用6 mL超纯水淋洗，再将小柱于氮气保护下干燥20 min，最后用6 mL5%氨水甲醇溶液（4.7）分两次进行洗脱。洗脱液于40水浴用氮DB32/T 37712020 3 气吹至近干，用0.1%甲酸水-乙腈（4.9）定容至1 mL，涡旋混匀1 min，过0.22 m水系滤膜，供液相色谱-串联质谱仪测定。7.2 标准曲线的制备 精确量取适量混合标准中间溶液(4.14)和适量 1 g/mL 混合内标标准工作液（4.16），用 0.1%甲酸水-乙腈（4.9）配制成同位素内标浓度为 50 ng/mL 以及 16 种喹诺酮浓度为 1、5、10、20、50、100 和200 ng/mL 系列标准溶液。以被测组分和相应内标的峰面积比值为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线，计算回归方程和相关系数。7.3 测定 7.3.1 色谱参考条件 液相色谱参考条件如下：a)色谱柱：EC-C18柱，(2.1 mm x100 mm，2.7 m)，或性能相当者。b)流速：0.40 mL/min。c)柱温：30。d)进样量：10 L。e)A 为 0.1%甲酸水溶液(4.8)，B 为乙腈(4.2)；梯度洗脱程序见表 1。表 1 流动相梯度洗脱程序 时间/min A相/%B相/%0.00 95 5 2.00 85 15 10.00 45 55 12.00 10 90 13.00 95 5 15.00 95 5 7.3.2 质谱参考条件 质谱参考条件如下：a)离子化模式：电喷雾离子源(ESI)，正离子模式；b)喷雾电压：5500 v；c)气帘气流量：2 L/min；d)雾化气流量：8 L/min；e)辅助加热气流量：8 L/min；f)离子源温度：500；g)扫描模式：多反应监测(MRM)，扫描参数见附录 A；7.3.3 定性测定 在同样测试条件下，试样溶液中各抗生素的保留时间与标准物质保留时间相对偏差在 2.5%以内，且检测到的定性离子的相对丰度，应与浓度相当的标准溶液中定性离子的相对丰度一致。基峰与次强碎片离子丰度比应符合表 2 要求。各抗生素的保留时间参考附录 B。DB32/T XXXX2020 4 表 2 基峰与次强碎片离子丰度比要求 次强碎片离子相对丰度%50 2050 1020 10 允许相对偏差%20 25 30 50 7.3.4 定量测定 将标准工作液和试样溶液等体积进样测定，按内标法进行定量分析，在样品中加入回收率指示物，以此来保证整个样品前处理过程的回收率。诺氟沙星、依诺沙星以氘代诺氟沙星为内标，环丙沙星、洛美沙星以氘代环丙沙星为内标，恩诺沙星、氧氟沙星、培氟沙星、丹诺沙星、沙拉沙星、司帕沙星、双氟沙星、恶喹酸、氟甲喹、萘啶酸、氟罗沙星、奥比沙星以氘代恩诺沙星为内标。7.3.5 空白试验 除不加试样外，均按上述测定条件和步骤进行。8 结果计算 试样中喹诺酮类抗生素含量按公式(1)计算，计算结果需扣除空白值，结果保留三位有效数字。（1）式中：Xi 试样中喹诺酮类抗生素含量，单位为纳克每升(ng/L)；ci 试样溶液中喹诺酮类抗生素的浓度，单位为纳克每毫升(ng/mL)；V1 试样溶液最终体积，单位为毫升(mL)；m 试样体积，单位为升(L)。9 方法灵敏度、准确度和精密度 9.1 灵敏度 本方法的定量限为10 ng/L。9.2 准确度 本方法回收率范围为70%120%。9.3 精密度 本方法的批内变异系数15%，批间变异系数15%。mVcXii=DB32/T 37712020 5 附 录 A（资料性附录）扫描参数 表A.1 16种喹诺酮类抗生素及内标物的母离子、子离子和碰撞能量 序号 化合物 母离子/(m/z)子离子/(m/z)碰撞能量/V 1 恩诺沙星 360 245 38 316*26 2 诺氟沙星 320 233 35 276*26 3 培氟沙星 334 290 27 316*30 4 环丙沙星 332 245 32 288*26 5 氧氟沙星 362 261 26 318*38 6 沙拉沙星 386 299 36 342*26 7 依诺沙星 321 232 44 303*30 8 洛美沙星 352 265 33 308*28 9 萘啶酸 233.3 215.2 28 187.4*44 10 恶喹酸 262 216 39 244*26 11 氟甲喹 262 202 25 244*40 12 丹诺沙星 358 283 30 340*24 13 双氟沙星 400 299 38 356*30 14 奥比沙星 396 295 35 352*26 15 司帕沙星 393 292 35 349*27 16 氟罗沙星 370 269 37 326*27 17 氘代诺氟沙星 325 307 30 18 氘代环丙沙星 340 322 28 19 氘代恩诺沙星 365 321 29 注：*为定量离子 DB32/T XXXX2020 6 附 录 B（资料性附录）标准溶液液相色谱/串联质谱色谱图和参考保留时间 XIC of+MRM(35 pairs):370.000/326.000 Da ID:FLE1 from Sample 2(STD 20ng/mL)of 20180523.wiff(Turbo Spray)Max.6.7e5 cps.024681012141618202224Time,min0.001.00e52.00e53.00e54.00e55.00e56.00e57.00e58.00e59.00e51.00e61.10e61.20e61.29e6Intensity,cps3.76 图 B.1 16 种喹诺酮标准工作溶液液相色谱/串联质谱 XIC 色谱图 图 B.2 16 种喹诺酮标准工作溶液液相色谱/串联质谱 TIC 色谱图 DB32/T 37712020 7 表 B.1 16 种喹诺酮标准工作溶液参考保留时间 化合物名称 保留时间/min 化合物名称 保留时间/min 依诺沙星 3.51 恩诺沙星 4.14 诺氟沙星 3.71 奥比沙星 4.25 氧氟沙星 3.72 沙拉沙星 4.75 氟罗沙星 3.76 司帕沙星 4.77 培氟沙星 3.78 双氟沙星 4.84 环丙沙星 3.82 恶喹酸 5.85 丹诺沙星 3.93 萘啶酸 7.40 洛美沙星 3.96 氟甲喹 7.99 _