维生素E对半滑舌鳎垂体α-生育酚转移蛋白基因表达的影响.pdf

第 45 卷 第 1 期 渔 业 科 学 进 展 Vol.45,No.1 2 0 2 4 年2 月 PROGRESS IN FISHERY SCIENCES Feb.,2024 *国家自然科学基金面上项目(31872578)和国家海水鱼产业技术体系(CARS-47)共同资助。霍欢欢，E-mail: 通信作者：王蔚芳，副研究员，E-mail: 收稿日期:2022-09-22,收修改稿日期:2022-10-31 DOI:10.19663/j.issn2095-9869.20220922002 http:/ E 对半滑舌鳎垂体-生育酚转移蛋白基因表达的影响.渔业科学进展,2024,45(1):6069 HUO H H,LI H T,WANG W F,LIU B L,ZANG T.Effects of vitamin E on-tocopherol transfer protein expression in the pituitary of Cynoglossus semilaevis.Progress in Fishery Sciences,2024,45(1):6069 维生素 E 对半滑舌鳎垂体-生育酚 转移蛋白基因表达的影响*霍欢欢1 李会涛2 王蔚芳3 刘宝良3 臧 涛4(1.江西农业大学动物科学技术学院 江西 南昌 330045；2.青岛蔚蓝福邦生物科技有限公司 山东 青岛 266600；3.中国水产科学研究院黄海水产研究所 山东 青岛 266071；4.济南市农业技术推广服务中心 山东 济南 250004)摘要 -生育酚转移蛋白(-tocopherol transfer protein,-TTP)是一种可以结合维生素 E 的蛋白，在协助机体转运和调控维生素 E 含量等方面起到重要作用。维生素 E 能够影响鱼类垂体中生长和繁殖相关激素的分泌，这是否与-TTP 有关，值得进一步探讨。本实验旨在探究维生素 E 对半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)垂体-TTP 基因表达的影响。在基础饲料中分别添加维生素 E(DL-生育酚乙酸酯)0、200、400、800 和 1 600 mg/kg，对半滑舌鳎成鱼(464.02.6)g 进行持续 60 d 的养殖实验；另外，在 L-15 培养基中添加 0、18 和 54 mol/L 的维生素 E，对半滑舌鳎垂体细胞进行为期 3 d 的体外原代培养实验。分别取垂体组织和垂体原代细胞，克隆-TTP 基因，并通过实时荧光定量 PCR 分析-TTP 基因相对表达量。结果显示，-TTP 基因全长 3 964 bp，编码 293 个氨基酸；-TTP 基因在半滑舌鳎各组织均有表达，其中，在脾脏中表达最高，其次是肾脏，在胃中表达量最低；-TTP 基因表达量随着饲料中维生素 E 含量的增加而呈先升高后下降的变化趋势，400 mg/kg组显著高于其他各组(P 5.65 mg/L。每天早上清除粪便和多余的饲料以保持良好的水质条件。1.2.2 实验取样 养殖结束后，所有鱼饥饿 24 h，丁香油(10 mg/L)麻醉后准确称重，记录终末体重；每个养殖桶随机取 3 尾鱼，无菌取出垂体用于后续实验。1.3 垂体原代细胞培养 1.3.1 细胞培养基配制 称取 4.76 g HEPES 和9.6 g L-15 培养基，充分混溶于水，4 h 后用 NaOH 将pH 调至 7.4，抽滤(除菌)，分装，即制成 L-15 基础培养基。在 L-15 基础培养中加入胎牛血清(终体积为5%)、青霉素(终浓度为 100 U/mL)、链霉素(终质量浓度为 100 g/mL)，即制成完全培养基，4 保存。所有操作在细胞培养室进行，有专用橱柜和冰箱放置物品，所有解剖工具、器皿等均经高压消毒后使用，实验用水、磷酸缓冲液(PBS)等为无菌型商品。1.3.2 细胞分离 在细胞培养室的准备室内，用75%酒精浸泡鱼头后，无菌条件下，取 20 条成鱼垂体组织，移入超净工作台内后更换培养液和培养皿，保证无菌操作。随后垂体组织剪成 1 mm3小块，用PBS 冲洗，加入 0.25%的胰蛋白酶，用量约为组织块的 10 倍，放入 18 水浴锅中 45 min。水浴后用 2 mL PBS 吹打组织块，倒入 200 目的尼龙网过滤，取滤液以 100 g 速度离心 10 min，除去上清液，并重悬沉淀，分装至六孔板，1 mL/孔，置于 24 培养箱中进行培养。参考王蔚芳等(2020)的方法进行操作。1.3.3 细胞培养 细胞培养液中维生素 E(DL-生育酚乙酸酯,Sigma)浓度参照大菱鲆(Scophthalmus maximus)的相关研究设置(Huang et al,2019)，实验分为 3 组，每组 3 个重复，维生素 E 添加量分别为 0、18 和 54 mol/L。将维生素 E 预先溶解在无水乙醇中，然后加入到 L-15 完全培养基中(无水乙醇的终浓度为0.1%，v/v)，于 24 培养箱中培养 3 d(黄滨等,2017)。1.4 RNA 的提取与 cDNA 文库的构建 养殖实验结束后，分别在每个养殖桶随机取 3 尾鱼，无菌取出垂体组织并置于无菌 1.5 mL 离心管中；细胞实验结束后，将每孔垂体细胞转移至 15 mL 离心管中，以 100 g 转速离心 10 min 之后取细胞沉淀，并置于 1.5 mL 无菌离心管中。加入 1 mL TRIzol(Invitrogen,美国)，按照程序提取总 RNA，使用NanoDrop 2000 定量并调整至相同浓度备用，并取适量 RNA 进行琼脂糖凝胶电泳，检测 RNA 完整度，取质量较好的 RNA 作为 cDNA 文库构建的模板。以总RNA模板构建cDNA文库，选用PrimeScript RT regent kit with gDNA eraser(TaKaRa,日本)进行反转录实验，操作流程参照该使用说明书进行，制成的 cDNA文库保存于20 冰柜中。1.5 RACE 扩增-TTP 基因 根 据 GenBank 半 滑 舌 鳎-TTP 预 测 基 因(XM_008335042.3)编码序列(Coding sequence,CDS)信息设计引物(表 2)，使用 cDNA 末端快速扩增法(Rapid-amplification of cDNA ends,RACE)进行扩增，具体步骤如下：1.5.1 3端扩增 -TTP基因的3端序列的获得利用两步法，先利用F1和3Outer Primer进行首轮扩增，然后使用首轮扩增的 PCR 产物为模板，F2 和 3Inner Primer 为引物进行第 2 轮扩增。反应体系为 50 L，反应条件：94 1 min 预热，然后 98 10 s、55 15 s、68 1 min，30 个循环。反应结束后，1%琼脂糖凝胶电泳，使用 TaKaRa Mini BEST agarose gel DNA extraction kit V4.0 切胶回收纯化；将纯化产物使用 DNA A-Tailing kit 处理后，使用 TaKaRa DNA ligation kit V2.1 中的连接酶，将产物与 T-Vector pMDTM 20连接后，热转化至E.coli感受态细胞JM109中，涂布平板，37 过夜培养。挑选阳性单克隆，使用通用引物 M13-47、RV-M 进行测序。1.5.2 5端扩增 -TTP基因的5端序列的获得同样利用两步法，先用 R3 和 5Outer Primer 进行首轮扩增，然后利用首轮扩增的 PCR 产物为模板，以 R4和 5Inner Primer 为引物进行第 2 轮扩增。反应体系为 50 L，反应条件：94 2 min 预热，然后 98 10 s、55 30 s、72 1 min，30 个循环，反应结束后，1%琼脂糖凝胶电泳，切胶回收纯化，连接转化，挑选阳性单克隆测序。1.5.3 基因验证 最后，将扩增的序列组合在一起并设计引物 F-TTTTCCATCAGTGGTGTAGCCGGGT C，R-GTGCCCCCTGATGGACATGACAAG 对产物进行验证。反应体系为 50 L，反应条件：94 1 min预热，然后，98 10 s、55 15s、68 1 min，30 个循环，反应结束后，1%琼脂糖凝胶电泳并测序。1.6 定量 PCR 分析 根据半滑舌鳎-TTP 基因序列，通过 Primer Premier 5 软件进行引物设计，由生工生物工程(上海)股份有限公司进行合成，引物浓度为 10 mol/L。应用实时荧光定量 PCR(qRT-PCR)分析不同水平维生素 E 处理下垂体-TTP 基因的表达情况。以 20cDNA 第 1 期 霍欢欢等:维生素 E 对半滑舌鳎垂体-生育酚转移蛋白基因表达的影响 63 稀释液为模板进行 qRT-PCR 扩增，参照 TB Green Premix Ex TaqTM (Tli RNaseH Plus)(RR820A)试剂盒说明书，扩增体系为 20 L，包括 10 L TB Green 试剂、0.8 L PCR 正向引物、0.8 L PCR 反向引物、1 L cDNA 模板和 7.4 L RNase-free dH2O。为减小实验误差，每个样品均设置 3 个重复，18S 核糖体 RNA基因作为内参引物，与目的基因在相同条件下进行扩增，引物序列见表 2。反应按 95 10 min，95 10 s，58.4 15 s，72 20 s,再依次按照 95 15 s、60 15 s、95 15 s 绘制熔解曲线。实验中，PCR 产物通过溶解曲线确定扩增准确性及特异性，使用 2Ct法计算 mRNA 相对表达水平。1.7 生物学信息与数据统计分析 扩增全长序列在 NCBI 数据库中进行 BLAST 比对和同源性分析，利用 SignalP(http:/www.cbs.dtu.dk/services/SignalP-4.1/)推断其开放阅读框和编码氨基酸序列；利用 ClastalX 结合 MEGA 4.0 软件构建系统进化树；利用 ProtParam 工具(https:/web.expasy.org/protparam/)分析 a-TTP 蛋白质的基本理化性质。所有实验均设置 3 个平行处理，所得数据均以平均值标准误(MeanSE)表示，并通过 SPSS 19 软件进行单因素方差分析(one-way ANOVA)分析及基于LSD 最小显著差异法的多重比较。当 P0.05 时，认为具有显著差异。表 2 本研究所用引物的序列 Tab.2 The primer sequence used in the present study 引物 Primer 序列 Sequence(53)用途 Usage 大小 Size/bp F1 GCCTTCCAGGTCTTTAGGGTCA 22 F2 CTTCGACCTGAGTGGGTGGAGC 3端扩增 cDNA-3 terminal qRT-PCR 22 R3 AACTTTATTTTCCCCACAGACTCA 24 R4 CAGAGACACCAGAGCCGGCCTTCA 5端扩增 cDNA-5 terminal qRT-PCR 24 F TTTTCCATCAGTGGTGTAGCCGGGTC 26 R GTGCCCCCTGATGGACATGACAAG 验证 Verification 24 M13-47 CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC 24 RV-M AGCGGATAACAATTTCACACAGGA 测序 Sequencing 24-TTP-F GACCAATCACCTGCTCCAGTC 21-TTP-R CTTCCTGTGTCCCGTCCAA 荧光定量 PCR qRT-PCR 19 18S-F GGTCTGTGATGCCCTTAGATGTC 23 18S-R AGTGGGGTTCAGCGGGTTAC 内参 Reference gene 20 2 结果与分析 2.1 半滑舌鳎-TTP 基因的获得 经过 RACE 扩增，拼接后获得一个全长为 3 964 bp的序列(图1)，经NCBI比对发现，其与半滑舌鳎-TTP预测基因(XM_008335042.3)有 99%的相似性。半滑舌鳎-TTP 基因编码 293 个氨基酸，大小约为 33 kDa，等电点为 6.21，为不稳定蛋白(稳定系数为 63.56)，具有亲水性(总平均亲水性为0.263)。进一步进化树比对显示，所扩基因(标记为 sequence)与半滑舌鳎聚为一支，与其他鱼类相距较远，再次说明所扩基因为半滑舌鳎-TTP 基因(图 2)。2.2 -TTP 基因在各组织中的表达情况 经 qRT-PCR 检测发现，-TTP 基因在半滑舌鳎11 个不同组织中均有表达，但表达量存在很大差异，在脾脏中相对表达量最高，其次是肾脏，在胃中相对表达量最低，具体表达情况见图 3。2.3 维生素 E 对垂体-TTP 表达量的影响 在养殖实验中，垂体中-TTP 的表达量随饲料中维生素 E 含量的增加而呈先升高后降低的趋势，并在维生素 E 达到 400 mg/kg 时，其表达量显著高于其他4 组(P0.05)，比对照组高 7.11 倍，比其他组高 34 倍，而其他 4 组之间-TTP 表达量无显著差异(图 4)；在体外细胞实验中，-TTP 表达量随维生素 E 含量的持续升高而升高，并在 54 mol/L 组达到最高，显著高于对照组，是对照组的 1.37 倍(P0.05)(图 5)。2.4 维生素 E 对半滑舌鳎生长的影响 经过 60 d 的养殖实验，生长数据表明饲料中维 64 渔 业 科 学 进 展 第 45 卷 图 1 半滑舌鳎-TTP 基因序列 Fig.1 The sequence of C.semilaevis-TTP gene 划横线部分为 CDS 区，大写字母为对应的编码氨基酸，*为终止密码子。The underlined part is the CDS region,the capital letter is the corresponding coded amino acid,and an asterisk represents the termination codon.图 2 半滑舌鳎-TTP 基因进化树 Fig.2 The-TTP gene evolutionary tree of C.semilaevis 第 1 期 霍欢欢等:维生素 E 对半滑舌鳎垂体-生育酚转移蛋白基因表达的影响 65 图 3 -TTP 基因在半滑舌鳎各组织中的相对表达情况 Fig.3 Relative expression of-TTP gene in tissues of C.semilaevis 图 4 饲料中维生素 E 含量对半滑舌鳎垂体组织-TTP 基因表达的影响 Fig.4 Effects of dietary vitamin E content on-TTP expression in pituitary tissue of C.semilaevis 不同字母表示差异显著(P0.05),下同 Different letters indicate significant difference(P0.05)，但其终末体重随着维生素 E 的添加呈先升高后降低的趋势，并在维生素 E 添加 400 mg/kg 时最高(图 6)。图 6 饲料中维生素 E 含量对半滑舌鳎生长的影响 Fig.6 Effects of dietary vitamin E content on growth of C.semilaevis 3 讨论 维生素 E 是具有保护细胞膜免受过氧化损害的抗氧化剂，-生育酚转移蛋白(-TTP)是调控机体维生素 E 含量的重要因子。目前，关于-TTP 的研究主要集中在哺乳动物上，有关鱼类-TTP 的研究还较少。本研究通过 RACE 法克隆了半滑舌鳎的-TTP基因，其编码 293 个氨基酸，分子质量约为 33 kDa，这与哺乳动物中-生育酚转移蛋白的大小几乎相一致，但其 3 964 bp 的基因全长远大于绵羊的 1 098 bp(左兆云,2014)。半滑舌鳎-TTP 基因在全身各组织广泛表达，这与哺乳动物-TTP 表达情况类似(Hosomi et al,1998;Kaempf-Rotzoll et al,2002;Shichiri et al,2012)，但哺乳动物-TTP 主要在肝脏组织中表达(Yoshida et al,1992;Sato et al,1993;Arita et al,1995)，而半滑舌鳎-TTP 在脾脏和肾脏中表达量最 高，这 可 能 是 由 种 属 差 异 导 致 的。-TTP 能够特异识别-生育酚(维生素 E)侧链结构(Chow et al,2015)，因此，-TTP 的突变也会相应引发维生素 E 缺乏症，但-TTP 的表达量是否受维生素 E 摄入水平的影响尚不明确。近年来，研究人员针对维生素E对-TTP表达水平的影响进行了广泛的研究，但研究结果并不尽一致，有的甚至相互矛盾。Thakur 等(2010)在人肝癌细胞的研究中发现，添加维生素 E 后显著提高了-TTP 的表达水平；刘昆等(2014)在滩羊饲料中添加高水平的维生素 E 显著提高了滩羊肝脏中-TTP 的蛋白含量。本研究中，无论是养殖实验还是体外细胞实验，添加维生素 E 均可以显著提高垂体-TTP 基因的表达水平。然而，在小鼠(Chen et al,2012)、猪(Lauridsen et al,2013)和斑马鱼(Watt 66 渔 业 科 学 进 展 第 45 卷 et al,2021)的研究中发现，饲料中添加维生素 E 对其肝脏-TTP 基因表达水平均未产生显著影响。据此，有学者认为，由于肝脏中-TTP 的含量充足，因此，不会随着维生素 E 含量的变化而发生明显的改变(Bella et al,2006)。但 Thakur 等(2010)研究发现，维生素 E 可以同-TTP 结合并改变其构象，然后降低其降解速率，提高-TTP 的表达水平。维生素 E 对-TTP 表达的调节机制十分复杂，研究结果存在差异，其分子机制尚有待进一步的研究。垂体在鱼类的生长和繁殖过程中发挥重要的作用(林浩然,2011)。垂体在接收脑部传来的信号后合成生长激素、促性腺激素等，并通过轴突将激素释放到血液中，进而通过血液运送到靶细胞(组织或器官)，发挥激素的生理功能。由于垂体组织很小，其大小接近半个米粒，因此，很难检测组织中营养素(如维生素 E)的含量，限制了营养素对垂体影响的评估，因此，有必要寻找一个可替代评价的敏感指标。鉴于-TTP 与维生素 E 的密切关系，以及维生素 E 与生长激素、促性腺激素等之间的关联已被证实(Huang et al,2019;王蔚芳等,2020)，本研究也试图探讨-TTP 成为评价维生素 E 影响鱼类生长和繁殖的一个潜在指标的可行性。本研究结果表明，维生素 E 参与了垂体-TTP 基因的表达，其表达量受维生素 E 剂量影响。在养殖实验中，垂体-TTP 基因表达量随着饲料中维生素 E 添加量的增加呈先升高后下降的趋势，并在添加量为 400 mg/kg 时表达量最高，且显著高于其他各组(P0.05)，其结果也与本研究中半滑舌鳎的生长趋势吻合，生长指标也在添加 400 mg/kg 维生素 E 时表现最优异。张志强等(2017)和覃希等(2014)的研究也指出，饲料中维生素 E 的缺乏或过量能够影响鱼的生长，其影响模式与本研究中-TTP 基因变化趋势相符。然而，高剂量的维生素 E(1 200 mg/kg)却有效提升了半滑舌鳎亲鱼的繁殖性能(肖登元等,2015)。在亲鱼垂体中-TTP 基因表达量是如何响应饲料中维生素 E 含量的变化，值得进一步探索。另一方面，体外细胞实验结果显示，没有出现-TTP 基因表达量下调的现象，今后可进一步增加其浓度梯度开展实验；但体外实验进一步证实了垂体中-TTP 基因受到维生素 E 浓度的影响。本研究结果表明，垂体-TTP基因的表达响应了饲料中维生素 E 含量的变化，可成为指示垂体中评价维生素 E 影响鱼类生长和繁殖的潜在评价指标，在日后的相关研究中可以进一步考虑二者之间的关联性并加以验证。4 结论 本研究克隆了半滑舌鳎-生育酚转移蛋白基因-TTP，其在半滑舌鳎各组织均有表达，并在脾脏中表达最高，其次是肾脏，在胃中表达量最低。饲料中添加 400 mg/kg 的维生素 E 时，其垂体中-TTP 基因表达量最高，饲料中维生素 E 含量不足或过量都会降低其表达。参 考 文 献 ARAI H,KONO N.-Tocopherol transfer protein(-TTP).Free Radical Biology and Medicine,2021,176:162175 ARITA M Y,SATO Y,MIYATA A,et al.Human alpha-tocopherol transfer protein:cDNA cloning,expression and chromosomal localization.Biochemical Journal,1995,306(Pt2):437443 ARITA M,NOMURA K,ARAI H.-Tocopherol transfer protein stimulates the secretion of-tocopherol from a cultured liver cell 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which-TTP regulates vitamin E supplementation.Related studies have been mainly focused o