弧菌DS32褐藻胶裂解酶基因vralg1的异源表达和酶学性质研究.pdf

第 卷 第 期应 用 海 洋 学 学 报，年 月 ，弧菌 褐藻胶裂解酶基因 的异源表达和酶学性质研究李慧敏，邵宗泽，路 瑶，杨江科，周梅先 收稿日期：资助项目：国家自然科学基金（）；中国大洋协会项目（）；自然资源部第三海洋研究所基本科研业务费（海三科）作者简介：李慧敏（），女，硕士研究生；：通讯作者：周梅先（），女，博士，副研究员；：；杨江科（），男，博士，教授；：（武汉轻工大学生命科学与技术学院，湖北 武汉；自然资源部第三海洋研究所、自然资源部海洋生物遗传资源重点实验室，福建 厦门）摘要：对从福建省东山湾沉积物样品中筛选到的菌株 的褐藻胶裂解酶基因 进行克隆和异源表达，并对其酶学性质进行评估。以 基因组为模板，克隆褐藻胶裂解酶基因，构建了 重组表达载体，并在大肠杆菌中实现了异源表达，对重组酶 的酶学性质、底物特异性和完全降解产物等进行了测定。结果表明：重组酶 最适温度为，在 范围内相对酶活力达到 以上，最适 为，在 为 范围内保温 后相对酶活力在 以上；重组酶 最大反应速率为 （），米氏常数为 ，最适条件下比活力为 ；、咪唑和乙醇对酶活性影响较小，或 浓度下相对酶活力保持 以上，对酶的抑制作用明显，浓度下可使酶完全失活；重组酶 对海藻酸钠和聚古罗糖醛酸具有较高的降解活性，分析显示产物主要为单糖、二糖和三糖混合物，结合底物特异性分析，推测重组酶 是具有明显聚古罗糖醛酸偏好性的内切型双功能褐藻胶裂解酶。本研究成功克隆了弧菌 中褐藻胶裂解酶基因并实现了其在大肠杆菌中的异源表达，所得重组酶 具有优良的海藻酸钠降解活性和明显的聚古罗糖醛酸偏好性，可以用于制备低聚合度的褐藻寡糖。关键词：海洋生物学；褐藻胶裂解酶；褐藻寡糖；克隆表达；酶学性质；聚古罗糖醛酸偏好性：中图分类号：文献标识码：文章编号：（）褐藻广泛分布于北太平洋西部地区，后逐渐由日本传到我国沿岸海域。褐藻植物产量大，种类繁多，常见有海带（）、昆布（）、巨藻（）、裙带菜（）等。市面上的海藻酸盐（）大多提取自褐藻植物细胞，通常被称为海藻胶，是一种碳水化合物类生物聚合物。它是由不同比例的 古罗糖醛酸（，）和 甘露糖醛酸（，）以，糖苷键随机连接形成的线性酸性多糖。不同来源的褐藻胶中所含甘露糖醛酸和古罗糖醛酸的比值（）不同，如来自极北海带（）的褐藻胶约含有 的甘露糖醛酸和 的古罗糖醛酸，来自昆布的褐藻胶含有 的甘露糖醛酸和 的古罗糖醛酸，两种单体的不同分配和构象也影响着褐藻胶的特性。褐藻胶原料充足、价格低廉，提取方法比较成熟，在医药工业、食品工业、纺织工业及农业生产等领域有广泛应用。褐藻寡糖是褐藻胶经褐藻胶裂解酶或物理化学方法解聚的产物，聚合度为 之间。与褐藻胶相比，褐藻寡糖分子量小，具有粘度低、易溶于水、易吸收、安全无毒的特点，在抑菌、抗炎、降血糖、抗肿瘤、提高植物抗逆性等方面表现出更优良的生物活性，褐藻寡糖 应 用 海 洋 学 学 报 卷的制备和应用延长了褐藻工业生产链，提高了褐藻产业的附加值。在常见的制备褐藻寡糖的方法中，生物酶解法相对于传统的辐照法、酸水解、氧化水解等物理化学降解法，具有特异性高、反应条件温和、能耗少、对环境更友好等多种明显优势而成为研究热点。降解褐藻胶的酶称为褐藻胶裂解酶，属于多糖裂解酶（，）家族，通过 消除反应断裂糖苷键催化褐藻胶的降解，得到在非还原端带有双键的不饱和寡糖和糖醛酸单体。根据底物特异性可以将其分为聚古罗糖醛酸（）特异性裂解酶、聚甘露糖醛酸（）特异性裂解酶和对两种底物均有降解活性的双功能裂解酶。该酶来源丰富多样，已从藻类、海洋软体动物、海洋和土 壤 微 生 物、真 菌 以 及 一 些 病 毒 中 分 离 得到。目前已经克隆表达了多种褐藻胶裂解酶，但大多具有聚甘露糖醛酸偏好性，而随着对褐藻寡糖生理活性的深入研究，有研究发现古罗糖醛酸寡糖具有比甘露糖醛酸寡糖更强的抗病毒活性，可以有效抑制烟草花叶病毒的活性，且抑制效果与古罗糖醛酸含量成正比。古罗糖醛酸寡糖具有优良的抗病毒活性，分子量小，容易被机体吸收，有潜力将其作为有效的抗病毒化合物用于医学领域。目前报道的 偏好性裂解酶较少，古罗糖醛酸寡糖的制备缺乏性质优良的工具酶，因此，获得更多性质更好的 偏好性裂解酶，对于特异性降解 制备古罗糖醛酸寡糖具有重要意义。本研究利用分子克隆技术，从弧菌（）基因组中表征出一种有明显 偏好性的褐藻胶裂解酶，并对其酶学性质进行了分析，所得重组酶对海藻酸钠和 都具有较高的降解活性，可为褐藻工业尤其古罗糖醛酸寡糖的制备和应用提供一种新的工具酶。材料与方法 材料 实验材料实验所用产褐藻胶裂解酶菌株 从福建省东山湾沉积物样品中分离得到，现保存于中国海洋微生物菌种保藏管理中心，保藏号：，大肠杆菌（）、（）菌株、表达载体（）均为本实验室保管。试剂赛百盛细菌基因组 提取试剂盒购自厦门浩禾生物科技有限公司；无缝克隆试剂盒及 反应相关试剂购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司；质粒小提试剂盒、通用型 纯化回收试剂盒购自天根生物科技（北京）有限公司；购自 公司；（）、和卡那霉素（）购自北京全式金生物技术有限公司；限制性内切酶购自 公司；购自厦门泰京生物技术有限公司；核酸电泳琼脂糖购自 公司；海藻酸钠购自上海国药集团；、褐藻胶单糖及寡糖标准品购自青岛博智汇力生物科技有限公司；研究所用 引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成；培养基组分等其他常规试剂均为国产分析纯试剂。仪器 仪购自德国 公司；台式冷冻离心机购自德国 公司；超声波细胞破碎仪购自南京舜玛仪器设备有限公司；振荡培养箱购自上海知楚仪器有限公司；多功能酶标仪购自美国 公司；凝胶成像系统购自上海天能科技有限公司；高压蒸汽灭菌锅购自华粤行医疗科技有限公司。培养基 培养基（）：，酵母提取物，胰蛋白胨 ，固体培养基加入 琼脂粉。方法 褐藻胶裂解酶基因 克隆以提取的菌株 基因组作为模板，设 计 正 向 引 物 （）和反向引物（）进行 扩增，正反向引物中分别引入 和 酶切位点，得到不含信号肽的褐藻胶裂解酶基因。反应体系（）：基因组 ，（），补足至。反应条件：预变性 ；变性 ，退火 ，延伸 ，循环 次；最后 延伸 。产物用琼脂糖凝胶电泳实验进行验证，条带与目的基因片段大小相符，切胶回收后存于 冰箱。重组表达载体的构建用 和 双酶切表达载体 期李慧敏，等：弧菌 褐藻胶裂解酶基因 的异源表达和酶学性质研究（），切胶回收，使用无缝克隆试剂盒将目的基因扩增产物连接到载体上。无缝克隆体系（）：片段 ，线性载体 ，缓冲液，。连接 ，利用热激法（，）将重组质粒（）转化至 感受态细胞中进行高拷贝复制，挑取单菌落进行菌落 验证，利用质粒小提试剂盒提取质粒，进行 和 双酶切验证，筛选得到阳性克隆子。将验证无误的重组质粒通过同样的方法转入 （）感受态细胞中，涂布在含 卡那霉素的 培养基上，过夜培养后，进行菌落 验证。重组酶的诱导表达及纯化将含有重组质粒的工程菌以 接种量接种到 含 卡那霉素的 培养基中，于、过夜培养，转接到 含 卡那霉素的 培养基中，、培养至 约 左右，加入终浓度为 的异丙基硫代半乳糖苷（，），、条件下诱导 ，收集菌液。将收集到的菌液在 、条件下离心 ，收集沉淀菌体，用 缓冲液重悬，功率超声破碎 ，工作 间隙时间为 。破碎后离心收集上清，即粗酶液，用 亲和层析柱对粗酶液进行纯化，用 电泳跑胶验证纯化效果，使用 蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白浓度。酶活力的测定及动力学分析纯化后酶液采用，二硝基水杨酸（，）法测定酶活力。取 酶液加入 浓度为 的海藻酸钠底物（，）中，对照组加入煮沸至失活的酶液，在最适温度 反应 ，加入 终止反应，显色，冷却离心后在波长 处读取 值。本研究所有酶活力测定实验中，实验组和对照组各设置 组平行实验。将最适条件下每分钟催化产生 还原糖所需的酶量定义为一个酶活力单位，根据产生的还原糖量（以葡萄糖计）计算酶活力。配制不同浓度的海藻酸钠底物（、），按上述反应体系在最适条件下测定该重组酶 的酶促动力学参数，根据 作图法，以 和 分别为横、纵坐标绘制双倒数曲线，求得最大酶促反应速率（）和米氏常数（）值。酶学性质评价最适温度及温度稳定性测定。在 条件下以 （）缓冲液配制浓度为 的海藻酸钠为底物反应测定酶活力，以最大值为 分别计算各个温度下的相对酶活力，确定重组酶 的最适温度。酶液在不同温度（）条件下保温 后与上述底物反应测定酶活力，以未经保温的酶液与底物反应所测酶活力为，计算保温后的相对酶活力，可反映该重组酶的温度稳定性。最适 及 稳定性测定。酶液与不同 缓冲液（醋酸钠缓冲液，为；磷 酸 盐 缓 冲 液，为 ；缓冲液，为 ；甘氨酸氢氧化钠缓冲液，为）配制的浓度为 的海藻酸钠反应测定酶活力，以最大值为 分别计算各个 下的相对酶活力，确定重组酶 的最适。将酶液加入上述不同 缓冲液中于 孵育，在最适条件下测定酶活力，以未经孵育的酶液与底物反应所测酶活力为，计算孵育后的相对酶活力，得到该重组酶的 稳定性。金属离子及有机溶剂的影响。在上述重组酶酶活力测定体系中加入不同金属离子、金属离子螯合剂、有机试剂等，空白对照组加入相同体积的超纯水，在最适温度及 条件下测定酶活力，以空白对照组所测酶活力为，确定常见金属离子及有机试剂对重组酶 的影响。实验所加试剂的终浓度设置低浓度（或 ）和高浓度（或 ）两个梯度进行对比。底物特异性分析。配制浓度为 的海藻酸钠、底物，在重组酶 最适条件下反应 ，以海藻酸钠底物所测酶活力为，探究该重组酶的底物特异性。降解产物分析本实验采用薄层色谱法（，）确定重组酶 最终降解产物的组分。将 稀释后酶液分别加入 最适 缓冲液配制的浓度为 的海藻酸钠、中，设置 组对照，反应时间分别为、及过夜，煮沸 ，条件下离心 应 用 海 洋 学 学 报 卷。取 点样，在层析缸中展开至距上边缘 处，晾干，将显色剂均匀喷洒在层析板上，等待 后用吹风机吹干，置于石墨加热板上 显色。展层剂为 正丁醇 甲酸 水 ，显色剂为 的硫酸乙醇。结果与分析 褐藻胶裂解酶 蛋白序列分析从前期实验室筛选所得产酶菌株 基因组注释信息中挖掘到褐藻胶裂解酶基因，序列全长 ，编码 个氨基酸，经过 预测信号肽切割位点在第 和第 个氨基酸之间。将氨基酸序列提交到 预测蛋白分子量为 ，理论等电点为。利用 将氨基酸序列与已发表的褐藻胶裂解酶进行比对，发现 与来源于噬藻弧菌（）的褐藻胶裂解酶（）同源性最高，利用 软件邻接法（，）构建系统进化树（图），发现该酶属于 家族。图 褐藻胶裂解酶 的系统进化树 褐藻胶裂解酶基因的克隆及重组质粒的酶切验证以产酶菌株 基因组为模板，扩增得到褐藻胶裂解酶基因，用 琼脂糖凝胶电泳实验进行验证，条带与目的基因片段大小相符图（）。将目的基因与表达载体（）连接，转化至 （）感受态细胞。提取工程菌质粒，用 和 进行双酶切，酶切产物用琼脂糖凝胶电泳检验，双酶切产物电泳显示两条带图（），分别对应表达载体与目的片段，表明重组质粒（）构建成功。重组酶的诱导表达及纯化含重组表达质粒的工程菌经 低温诱导后，成功表达出重组蛋白。收集菌体破碎，纯化，取 纯 化 前 后 酶 液 进 行 电 泳 分 析（图），在 附近可以看到诱导后产生的蛋白条带，预期的分子量约为 ，受组氨酸标签和纯化时带入的盐离子影响，条带位置与重组酶 大小相符，表明产酶基因成功实现了异源表达。图 的克隆和重组质粒的酶切验证 为 ，为 扩增产物，为（）双酶切产物。重组酶的比活力及动力学参数按照 说明书方法配制系列稀释牛血清蛋白标准品与工作液反应，得到 标准曲线 （），测 得 纯 化 后 酶 液 蛋 白 浓 度 为 期李慧敏，等：弧菌 褐藻胶裂解酶基因 的异源表达和酶学性质研究 图 重组褐藻胶裂解酶的 凝胶电泳图 为蛋白，为纯化前，为纯化后。，根据酶活定义求得重组酶的比活力为 。根据 作图法，以海藻酸钠底物浓度的倒数 为横坐标，反应速率的倒数 为纵坐标绘制双倒数曲线（图），求得 为 （），米氏常数 为 。图 重组酶 双倒数曲线 单位为 ，单位为 （）。重组酶的酶学性质分析 重组酶最适反应温度及温度稳定性在不同温度（）下测定酶活力图（），发现该重组酶 最适反应温度为，在 范围内相对酶活力达 以上，范围内有 以上相对酶活力，当反应温度超过，酶活性迅速下降。将酶液在不同温度下保温 图（），发现在 范围内酶活性非常稳定，相对酶活力达到 以上，保温后相对酶活力还能保持 左右，保温后酶基本失活。图 重组酶的最适温度及温度稳定性 重组酶最适反应 及 稳定性在不同 条件下测定酶活力图（），发现重组酶 最适反应 为 （缓冲液）。在 为 范围内相对酶活力保持在左右，为 和 为 范围内相对酶活力在 以上。为 范围内均具有活性，范围较广。此外，实验发现 在磷酸盐缓冲液中酶活性表现较 缓冲液好。将酶液在不同 缓冲液中保温 后于最适条件下测定酶活力图（），发现 在 为 范围内保温后相对酶活力保持在以上，在 为 范围内保温后相对酶活力保持在 以上，在 为 的碱性条件下保温后相对酶活力达到，为 的酸性条件下保温后相对酶活力为，说明该重组酶 稳定性良好。金属离子及有机试剂的影响在反应体系中加入不同金属离子、金属离子螯合剂、有机试剂等，测定对重组酶 的影响 应 用 海 洋 学 学 报 卷（图），发现在低浓度（或 ）条件下，金属离子、及有机溶剂咪唑、乙醇、异丙醇和 对酶活性基本无影响，相对酶活力仍保持 以上；、尿素、对酶活性的影响较小，相对酶活力在 以上；、对酶活性的抑制作用比较明显，相对酶活力在 左右；重组酶 在 甘油影响下相对酶活力为；金属离子螯合剂 对酶的抑制作用最为明显，在 浓度下使酶完全失活。当加入的金属离子及有机试剂浓度升高至 或 时，、咪唑和乙醇对酶活性仍基本无影响，相对酶活力保持在 以上；、浓度升高至 ，相对酶活力在 左右；在尿素、异丙醇影响下相对酶活力在 以上，其余金属离子和有机试剂影响下相对酶活力降至 以下。图 重组酶的最适 及 稳定性 图 金属离子及有机试剂对重组酶的影响 为对照组，为，为，为，为，为，为，为，为，为，为，为，为，为，为，为，为，为，为 ，为乙醇，为异丙醇，为甘油，为尿素，为咪唑。其中，、乙醇、异丙醇、甘油浓度单位为 ，其余试剂浓度单位为 。底物特异性分析以海藻酸钠、和 为底物，在最适反应条件下探究该重组褐藻胶裂解酶的底物特异性（图），发现重组酶 对 种底物均有降解活性，其中对海藻酸钠降解活性最高，其次是，重组酶 对 的相对酶活力达到 以上，对 降解活性最低，对 的降解活性约为 降解活性的 倍，期李慧敏，等：弧菌 褐藻胶裂解酶基因 的异源表达和酶学性质研究 是一种明显具有 偏好性的双功能褐藻胶裂解酶。图 重组酶底物特异性分析 重组酶的降解产物分析利用薄层层析法对重组酶 降解产物的组分进行分析，以相同浓度的海藻酸钠、和 种底物为对照，反应组加入等量酶液，控制反应时间，可以看到重组酶 在不同时间的降解产物变化（图）。由图 可以看出随着反应时间从 延长至 ，多糖首先被降解为聚合度较高的寡糖混合物，过夜反应后被完全降解，推测该酶为内切型褐藻胶裂解酶，所得褐藻寡糖主要是单糖、二糖和三糖的混合物。对比相同时间内不同底物降解情况来看，反应 时，种底物降解都不明显；反应 时重组酶 降解海藻酸钠和 产物中已出现单糖、二糖（图 中、点样孔），此时 主要降解产物为聚合度大于等于 的混合物（图 中 点样孔），点样处剩余样品较多，证明仍有部分 底物未被降解，由此可知在较短反应时间内，重组酶 对 降解速率比 快，对 底物表现出明显的偏好性，因此可以利用重组酶 通过控制反应时间获得丰度较高的古罗糖醛酸寡糖。图 重组酶的降解产物分析 为褐藻寡糖标品，为海藻酸钠，为海藻酸钠反应 降解产物，为海藻酸钠反应 降解产物，为海藻酸钠过夜反应降解产物，为，为 反应 降解产物，为 反应 降解产物，为 过夜反应降解产物，为，为 反应 降解产物，为 反应 降解产物，为 过夜反应降解产物。讨论褐藻寡糖由褐藻胶降解而来，分子量小，克服了限制海藻酸盐聚合物应用范围的凝胶型强、溶解性差等缺点，能穿过机体各种生物屏障和细胞膜的限制，具有多种生理活性，在医疗、食品、化工等领域发挥着重要的作用，而寡糖的分子量和 是影响其功能的重要因素。前人研究发现古罗糖醛酸含量高的褐藻胶寡糖可减少细菌脂多糖刺激引起的炎症反应，表现出良好的抗氧化、抗炎的能力。较低的褐藻胶寡糖表现出较高的大豆抗毒素诱导活性。近年来，随着褐藻寡糖结构与功能之间相关性的研究不断深入，调控寡糖产物聚合度，定向生产所需褐藻寡糖成为重要的研究方向。作为制备寡糖的生物催化剂，具有高底物特异性的褐藻胶裂解酶是生产特定结构寡糖所必需的工具，对开发高附加值褐藻寡糖产品，提高廉价褐藻原料的经济价值，实现褐藻资源有效利用具有重要意义。虽然越来越多的褐藻胶裂解酶基因随着基因工程技术的发展逐渐被鉴定、克隆，实现异源表达，但现已报道的重组褐藻胶裂解酶大都具有 偏好性，如 年，等从菌株 中克 应 用 海 洋 学 学 报 卷隆表达出 特异性的褐藻胶裂解酶，该酶可完全降解，对 底物相对酶活力仅有；年，李云涛等克隆所得褐藻胶裂解酶 对 具有显著的底物特异性，对 底物的相对酶活力仅有。目前已报道的 偏好性裂解酶仅有十余种，主要分布于弧菌属、微泡菌属（）、假交替单胞菌属（）等，但其中性质优良的 偏好性裂解酶仍比较稀缺（表），仍需大量挖掘和表征具有 偏好性的褐藻胶裂解酶用于制备古罗糖醛酸寡糖。年，等从灿烂弧菌（）中鉴定，纯化和表达了 个 家族褐藻胶裂解酶、，其中、和 对 偏好性高于，但是 种 偏好性重组酶均体现出较强的盐浓度依赖性，在 条件下活性最高，在低盐条件下酶活性明显降低，给工业大量制备褐藻寡糖的后续纯化除盐带来较大的困难。年，等从海洋弧菌菌株（）中表达出 家族双功能褐藻胶裂解酶，该重组酶对 种底物都有较高的降解活力，但其 偏好性不明显且易受、等金属离子影响，在添加 条件下相对酶活力仅为。相比较而言，重组酶 在同一浓度常见金属离子影响下相对酶活力能达到以上，浓度升高至 条件下，相对酶活力仍达到 以上，具有明显优势。年，等从弧菌菌株（）中鉴定并异源表达了 家族褐藻胶裂解酶、和，个重组酶中，只有 对 具有底物偏好性，但 仅在 为 的弱碱性环境中具有较高酶活性，在 小于 的酸性环境中，相对酶活力不到，而重组酶 在 为 条件下相对酶活力为，为 时相对酶活力更高，达到 以上，具有更广泛的 范围，更适合用于工业生产的复杂环境。后续实验可以采用电离喷雾质谱（）对重组酶 降解产物各组分分子质量进行测定验证其聚合度，结合核磁共振氢谱分析方法确定生成寡糖的分子结构，进一步验证重组酶 的 偏好性，为褐藻寡糖尤其是古罗糖醛酸寡糖的工业制备挖掘更多的工具酶。表 海洋弧菌来源的褐藻胶裂解酶 名称最适温度 最适 酶学性质底物特异性产物聚合度来源 保温 后失活；为 保温 相对酶活力为 海藻酸钠 低温酶，以上时，相对酶活力为以下；、等抑制作用明显海藻酸钠 反应体系加入 条件下酶活力最高，条件下相对酶活力为 左右海藻酸钠反应体系中加入 浓度达到 时酶活力最高，条件下相对酶活力为 左右海藻酸钠 以下热稳定性良好，保温 相对酶活力为；、抑制作用明显海藻酸钠 种酶均在温度 、为 范围内催化活性最高海藻酸钠海藻酸钠，无 活性海藻酸钠 期李慧敏，等：弧菌 褐藻胶裂解酶基因 的异源表达和酶学性质研究 续表名称最适温度 最适 酶学性质底物特异性产物聚合度来源 保温 ，相对酶活力为；、条件下酶活性上升，、抑制作用明显海藻酸钠 有酶活性，保温 酶活性完全丧失；稳定范围为；抑制作用明显海藻酸钠 结论本研究以筛选到的产褐藻胶裂解酶菌株 基因组为模板，通过基因工程手段扩增得到其褐藻胶裂解酶基因，构建重组工程菌株 （）（），成功实现了在大肠杆菌中的异源表达，获得 家族重组褐藻胶裂解酶。该酶在最适条件下的比活力为 ，为 （），为 。重组酶 的最适反应温度为，在 范围内相对酶活力达到 以上，最适 为，酶液在 为 的范围内均具有活性，在 为 缓冲液中保温 相对酶活力在 以上，范围广且稳定性良好。所得褐藻胶裂解酶具有良好的常见金属离子和有机溶剂耐受性，可以适应工业生产的复杂环境，具有较好的应用潜力。该重组酶对 和 均具有降解能力，属于双功能酶，偏好性明显；分析其主要降解产物为单糖、二糖和三糖的混合物，是一种具有明显 偏好性的内切型双功能褐藻胶裂解酶，在褐藻寡糖定向制备方面具有较大的应用潜力。参考文献：，（）：曾斌芬，时瑞，吴曼铃，等 褐藻胶寡糖的功能特性研究进展 食品研究与开发，（）：，（）：，（）：，（）：，（）：，：，（）：范素琴，陈鑫炳，代增英，等 褐藻胶低聚糖的生物活性及其在水产制品中的应用研究进展 肉类工业，（）：，（）：，（）：，（）：李佳琪，汤洁，李明月，等 不同分子量的褐藻寡糖对黄瓜幼苗光合作用及生长的影响 中国农业大学学报，（）：，（）：余劲聪，何舒雅，林克明 海洋寡糖诱导植物抗逆性的研究进展 中国农业科技导报，（）：，（）：，：，应 用 海 洋 学 学 报 卷，：，：，（）：，：，（）：陈琳，邵宗泽，易恩，等 鲍肠道弧菌 褐藻胶裂解酶基因 的表达及酶学性质研究 生物技术，（）：，（）：陈春琳，秦松，宋宛霖，等 褐藻寡糖生物法制备研究进展 中国生物工程杂志，（）：，（）：，（）：，：，（）：，：高荣，郑志国，鲍时翔，等 产褐藻胶裂解酶菌株筛选与高产酶菌株的 诱变选育 中国酿造，（）：，（）：，：，（）：王浩贤 聚甘露糖醛酸和聚古罗糖醛酸纯化及降解产物活性研究 青岛：中国海洋大学，：，（）：王宇 聚甘露糖醛酸和聚古罗糖醛酸跨 细胞单层的转运机制 济南：山东大学，：，：（），：，（）：，（），（）：，（）：，（）：，：，（），（）：，：，（）：，：，（）：，：，（）：李云涛，张齐，汪立平，等 海洋弧菌中褐藻胶裂解酶 的克隆表达及酶学性质 山东农业大学学报（自然科学版），（）：，（），（）：，（）：期李慧敏，等：弧菌 褐藻胶裂解酶基因 的异源表达和酶学性质研究 ，：，（）：，：高洁，李益民，杜聪，等 褐藻胶裂解酶基因的克隆表达与酶学性质 生物工程学报，（）：，（）：，（）：，（，；，）：，（），（），：；：（：，：）（责任编辑：王 静）