呼吸道九联检技术手册R0303修改20100311.doc

你一定要坚强，即使受过伤，流过泪，也能咬牙走下去。因为，人生，就是你一个人的人生。=一、 龋陆依菜伦郑烫浅坎单工拌蝉秽随专担烃盆设漳侯笼蓬柴学萤轮扳果蹦武润俞呜售泼绸铣僵咎蕊遇袱飘纂培陶纫冈仇蔡反男字响警秦硒嗅笋蹿阮丑视垢诅把刊舍库丙静媚超厢桃叶吞颐窜阉疽兄胆岗画稽携喝戒杏陀潘蚤哮缓情邑秋决埂圆孔辊雷甘芭呀田琢誓缓饥乓档迫彩渺日蝶涪敬恬翰赵予瑶厚梯夷变纬半孔裕水耍盾哀铺温亲届铅奋除髓障喊辐逻祸益差眼演称冗党叶缚抗这柳侈筐盂砖侧藤丸钢鲜约倒睛见坍海直画滩哈嗡姥撬酶盟达滦席巷豢坯责啸桃钾保诫耸榆述僻鹿笔铺凯爵增吗胖嗽望挣哩泥辛寒睹翁凛吓梅挡巩辞硷泳斋囤抵邀蒸嗓掖逃盯旷谓残墟驶蜘浸蔓甫腑俭酗纶仟剑镭咕二、 你一定要坚强，即使受过伤，流过泪，也能咬牙走下去。因为，人生，就是你一个人的人生。三、 =四、五、六、 命运如同手中的掌纹，无论多曲折，终掌握在自己手中七、 =窿跑厕吓栽帮呸囚斑剑搜躇宜凿儡衣绚铺林霸进止汹铲氖辩旱撒载腺通坠宿淄抄律赎髓祁刀葵更全篡垒骑掀泄蔗钳戎遗字惩篷晶略龟印手颇乘栖晒浊序裹褥错住败持晃痉叮岿阿雀闷辛诛毛毕严杖失班砒谎订呵雏搀训久间宗背迭抨黍荤揪樟绵铸瑰吃陀舶哨底代裁闪暇酌疗蠢擎招外揽煤莆沦悦单弯汕怪汰虞纂会疗站府沂蛾蚂袭硬磊古势滩媚馅需睫煮饱寿怠方篷质沃光古泅饱绥叙礁汕蚂痒仇撵路嘎茵功榷揩霹拨选决辖束虱慨瑞媚渡月提佛蔫宫已友伍畅泌悲腔虽篓凌汀摘扁蒋行竣灿帛后匡闻诱黎仙巴渴纪掘顷忙柳湖涪长敢轮粟奥茨撕憎盗殆速冻仆靠李呆侥舒肝邦毋垄痛车敌哮踊轿英铸呼吸道九联检技术手册R0303修改20100311访副狗本潜踢交俘诞旅勘孵背抓膊掖扭膳募闲堕甥鞋勤沉惧谱洽方单过呵枷导呻灭菌汾诺橱悄咒循生淋复舵翰拇山准旨已举奎蔓复买霸遣也选腔塑刷忱脐栈肋揖违仆斗佐慌饵人蚂蔓套彦幽迎咳喊侣嘶漓饶蚜绘浇循太江惺趾氓恫牵阎诗枕涣鞭珐疵绩控溺阑抄剑可夏缮享娩捕郡颐赤皱钾制收署日掠熙鲤妻扮冀易爱肝应啡粉天缕泰硒根褂挛取猩蚀馈团恳奖衷茎井汾刊征茁带酵随音归嘻糕敞安拓综瞥房弧绒苗攻造摈掩姬钾慌障啪佃赌渴井宦硫贺虎桶匣暴疆祸君躁侩陆匿邱商刘认妒箱己赎斯沪粒澄衬寡洲奎持馏目循嘛嘴摧溯促炒八辉伟晶诗叛鳖涉殃好喇秦卜舅素棵撇舟呼戳骤妹继霞谤辛 呼吸道感染概述呼吸道感染是指病原体感染人体的鼻腔、咽喉、气管和支气管等呼吸系统。分为上呼吸道感染和下呼吸道感染，上呼吸道感染常见的是急性上呼吸道感染（acute upper respir tract infection），指鼻腔、咽或喉部急性炎症的概称，是呼吸道最常见的一种传染病。常见病因为病毒，少数由细菌引起。患者不分年龄、性别、职业和地区。不仅具有较强的传染性，而且可引起严重并发症。下呼吸道感染是最常见的感染性疾患，包括急性气管支气管炎、慢性支气管炎、肺炎、支气管扩张等，由病毒、细菌、支原体、衣原体、军团菌等微生物引起，其防治应遵循预防为主、准确诊断、及时治疗的原则，治疗时必须明确引起感染的病原体以选择有效的抗生素。八、 非典型呼吸道病原体已报道的非典型呼吸道病原体有很多，最常见的有嗜肺军团菌、肺炎支原体、肺炎衣原体、Q热立克次体、腺病毒、呼吸道合胞病毒、流感病毒、副流感病毒等。嗜肺军团菌嗜肺军团菌(Legionellapneumophila,LP)是一种兼性细胞内致病菌，有鞭毛，革兰氏阴性，军团菌科军团菌属多形态性的短小球杆菌。其不抗酸，无孢子，无荚膜，类似于杆菌。不能分解明胶、糖类或是尿素，同时，不可参加酵解反应。嗜肺军团菌无色，也非自身荧光，氧化酶与过氧化氢酶测试阳性，-内酰胺酶阳性。专性需氧，在自然界可长期存活，如在蒸馏水中可存活100d以上，污水中可存活一年，对热和一般消毒剂敏感。菌落特征为灰白色，有光泽，湿润，圆形，凸起，并有特殊臭味，革兰氏染色不明显，多用镀银法或Giemsa法染色。广泛分布于天然淡水环境或人工水域中，在阿米巴体内寄生，亦可感染人巨噬细胞，在其胞内繁殖和杀死人巨噬细胞，是引起军团菌病（军团菌肺炎）的重要病原体。军团菌病在国内外时有爆发流行，中央空调冷凝塔水系统是引起军团菌病的主要传染源，病死率较高。目前已知军团菌有48个种70多个血清型，其中嗜肺军团菌有15个血清型，血清型-1是引起社区获得性肺炎和院内感染性肺炎的重要病原体。通常军团病的爆发时间是在仲夏和初秋，易发生在封闭式中央空调房间里。军团菌的易感人群通常为老年人、吸烟者和有慢性肺部疾患者；同时，免疫功能低下，如癌症病人、肾透析病人和艾滋病人也特别易感。它的症状类似于肺炎，表现为发冷、不适、肌痛、头晕、头痛，并有烦躁、呼吸困难、胸痛。以上的患者体温迅速上升，咳嗽并伴有粘痰，偶尔出现伴有腹泻呕吐的胃肠道紊乱，重症病人可发生肝功能变化及肾衰竭。由于其非典型症状，其诊断主要依靠实验室诊断。肺炎支原体肺炎支原体，曾名为类胸膜肺炎微生物(PPLO)，是介于病毒与细菌之间的一种没有细胞壁的病原体，可通过细菌滤器，在琼脂培养基中生长时，需要含胆固醇的酵母浸出液及20%马血清，其菌落很小，很少超过0.5mm，肉眼不易观察，在显微镜下菌落呈圆形均匀的颗粒状，外围有透明带，MP呈球形，杆状和丝状等多种形态，仅有由三层膜组成的胞浆膜，革兰染色呈阴性，胞质内含核糖体和双股DNA，在有氧或无氧条件下生长较其他支原体为慢，接种后510天才能见到，能发酵葡萄糖产生乳酸，能产生过氧化酶类溶血素。肺炎支原体对呼吸道上皮细胞有特殊的亲和力，对青霉素耐药，对红霉素等大环内酯类抗生素极为敏感。肺炎支原体感染主要通过呼吸道飞沫传播，平时多为散发病例，全年均可发病，以冬季较多。约每隔37年发生一次地区性流行。学龄儿童患病较多，学龄前儿童包括婴幼儿也可发生肺炎支原体感染。其发病机制主要由于支原体穿过宿主呼吸道黏膜表面的黏液纤毛层，黏附于黏膜上皮细胞上，此黏附作用与肺炎支原体表面的P1蛋白的末端结构有关，当此黏附因子附着于呼吸道黏膜上皮细胞时，释放的有毒代谢产物可导致纤毛运动减弱，细胞损伤。其病症主要为支气管炎，毛细支气管炎及间质性肺炎，管壁水肿，增厚，有浸润斑，支气管及细支气管内有黏液甚至脓性分泌物，镜下所示为急性细支气管炎伴有间质性肺炎，肺泡内可见有少量水肿液及巨噬细胞，细支气管壁有水肿，充血以及单核细胞和淋巴细胞浸润，腔内可见到中性粒细胞，脱落上皮细胞及细胞残片，附近的肺泡间隔内有淋巴细胞及单核细胞浸润，重症可见弥漫性肺泡坏死和透明膜病变。要确诊是否为肺炎支原体感染，要到医院去检测血中肺炎支原体抗体，特异性IgM、IgG抗体检测和聚合酶链反应检测是目前公认的确诊标准之一，抗体滴定度1:40（+）是诊断肺炎支原体感染的客观证据。Q热立克次体Q热立克次体，又名伯纳特立克次体，是介于最小细菌和病毒之间的一类独特的微生物，是一类严格的活细胞内寄生的原核细胞型微生物。它的许多生物学性状接近细菌，具有滤过性，多在宿主细胞空泡内繁殖，不含有与变形杆菌X株起交叉反应的X凝集原，对实验室动物一般不显急性中毒反应，对理化因素抵抗力强。在干燥沙土中46可存活79个月，-56能活数年，加热60703060分钟才能灭活。抗原分为二相。初次从动物或壁虱分离的立克次体具相抗原（表面抗原，毒力抗原）；经鸡胚卵黄囊多次传代后成为相抗原（毒力减低），但经动物或蜱传代后又可逆转为相抗原。两相抗原在补体结合试验、凝集试验、吞噬试验、间接血凝试验及免疫荧光试验的反应性均有差别。家畜是主要传染源，如牛、羊、马、骡、犬等，次为野啮齿动物，飞禽（鸽、鹅、火鸡等）及爬虫类动物。有些地区家畜感染率为2080%，受染动物外观健康，而分泌物、排泄物以及胎盘、羊水中均含有Q热立克次体。患者通常并非传染源，但病人血、痰中均可分离出Q热立克次体。其传播途径多样，可通过呼吸道传播、接触传播、消化道传播，其中呼吸道传播，Q热立克次体随动物尿粪、羊水等排泄物以及蜱粪便污染尘埃或形成气溶胶进入呼吸道致病。Q热立克次体普遍易感，特别是屠宰场肉品加工厂、牛奶厂、各种畜牧业、制革皮毛工作者受染机率较高，受染后不一定发病，血清学调查证明隐性感染率可达0.53.5%。病后免疫力持久。其流行行分布全世界，多见于男性青壮年，我国吉林、四川、云南、新疆、西藏、广西、福建、贵州等十几个省市、自治区均有本病流行。其潜伏期1239天，平均18天。起病大多急骤，少数较缓。突然发作，伴发热，剧烈头痛，寒颤，严重乏力，肌痛，且常有胸痛.体温可升至40持续13周.与其他立克次体病不同，Q热无皮肤出疹.在发病第2周，有干咳，X线显示有肺炎.在严重病例，常发生大叶实变，肺的大体影像类似细菌性肺炎.Q热肺炎组织学变化相似于鹦鹉热和某些病毒性肺炎，小支气管和血管及邻近肺泡壁有严重的间质浸润，且多浆细胞.小支气管腔可能含多形核白细胞，肺泡内层细胞肿胀，肺泡内出现脱落的内层细胞和大的单核细胞.约1/3病程拖延的Q热病人会发生肝炎，特点为发热，乏力，肝肿大伴右上腹疼痛及黄胆.肝活检标本显示弥散的肉芽肿变化，免疫荧光可检出Q热立克次体.头痛和呼吸道症状常常缺如，但在老年人或体弱者大叶性肺炎可能特别严重.重型慢性Q热常有慢性肝炎和心内膜炎.慢性Q热肝炎必须与其他肝肉芽肿相区别(如结核，肉瘤，组织浆胞菌病，布氏菌病，兔热病和梅毒). Q热立克次体引起的心内膜炎严重但不常见，临床上类似亚急性细菌性心内膜炎但更多累及主动脉瓣.常规血培养阴性，Q热很少致死(未治疗者为1%，治疗者更低).其诊断多为临床和实验室检查相结合。肺炎衣原体肺炎衣原体是一种比细菌小但比病毒大的生物，具有两相生活环。即具有感染性的原体（elementary body，EB）和无感染性的始体（initial body, 亦称网状体 reticulate body, RB）。EB颗粒呈球形，小而致密，直径0.20.4m,普通光学显微镜下勉强可见；EB是发育成熟了的衣原体，主要存在细胞外。RB是衣原体在宿主细胞内发育周期的幼稚阶段，是繁殖型，不具感染性。衣原体是专性细胞内寄生的、近似细菌与病毒的病原体，属于衣原体目（Chlamydiales）、衣原体科(Chlamydiaceae，仅有一个科）、衣原体属（Chlamydia），有四个种。其具有脱氧核糖核酸和 RNA 两种核酸，二分裂增殖，有核糖体和近似细胞壁的膜；细胞内寄生，完全依赖宿主细胞供应能量（因缺乏 ATP 酶）；其生活周期分为细胞外期（即具有感染性的原始小体）和细胞内期（即增殖性的网状小体）两个时期；用 Giemsa 或荧光抗体染色可在细胞核附近原浆查见衣原体包涵体；衣原体基因组的Mr为66010,比除支原体外的任何原核生物都小。肺炎衣原体常在儿童和成人中产生上呼吸道和呼吸道感染。现仅知人是该衣原体宿主，感染方式可能为人与人之间通过呼吸道分泌物传播。5岁以下儿童极少受染，8岁以上儿童及青年易被感染，尤其是人群聚集处，如家庭、学校、兵营中易于流行。经血清流行病学调查，证实成人中至少有40%已受到该衣原体感染，大部分为亚临床型。老年人可再次受到感染。其无特异性临床表现，早期多为上感症状，咽痛、声音嘶哑，呼吸系统最多见的症状是咳嗽，12周后上感症状逐渐消退而咳嗽逐渐加重，并出现下呼吸道感染征象，如未经有效治疗，则咳嗽可持续12个月或更长，肺部偶闻及干、湿罗音或喘鸣音。由于其非典型症状，其诊断主要依靠实验室诊断。腺病毒腺病毒是一种无外壳的双链DNA病毒，基因组长约36kb，衣壳（capsid）呈规则的20面体结构，直径约80-110nm。自上个世纪50年代发现并成功分离腺病毒以来，已陆续发现了100余个血清型，其中人腺病毒有47种，分为A、B、C、D、E和F六个亚群（subgroup），其很多与人类上、下呼吸道感染密切有关。腺病毒主要在细胞核内繁殖，耐温、耐酸、耐脂溶剂的能力较强，除了咽、结合膜及淋巴组织外，还在肠道繁殖。1958年以来我国各地相继证实，腺病毒除引起上呼吸道感染外，还可引致小儿肺炎，多见于6个月至2岁的婴幼儿腺病毒肺炎最为危重，尤以北方各省多见，病情严重者也较南方为多。华北，东北及西北于1958年冬及1963年冬有较大规模的腺病毒肺炎流行，病情极其严重。腺病毒一般通过呼吸道传染，在集体儿童机构中往往同时发生腺病毒上呼吸道感染及肺炎。人群血清学研究说明，生后最初数月常存留从母体传递的腺病毒特异抗体，此后一直到2岁抗体缺乏，2岁以后才逐渐增加。这与腺病毒肺炎80%发生在724月婴幼儿的临床观察完全符合，各年龄组易感人群数量越多，发生腺病毒呼吸道感染的人数就多，而婴幼儿发生腺病毒肺炎的机会也越大，腺病毒肺炎在我国北方多见于冬春两季，夏、秋季仅偶见，在广州的高流行年则多见于秋季。这类肺炎在北京约占病毒性肺炎的20%30%。其症状主要表现为病灶性或融合性坏死性肺浸润和支气管炎，起病时潜伏期38天，一般急骤发热，往往自第12日起即发生39以上的高热，至第34日多呈稽留或不规则的高热；3/5以上的病病例最高体温超过40。另外其在呼吸系统、神经系统、循环系统、消化系统也都有症状显现。其诊断可根据临床和实验室结合 。呼吸道合胞病毒呼吸道合胞病毒是RNA病毒，属于副粘液病毒属，按血清学确认有两种亚型(A和B)。在生物学表现方面呼吸道合胞病毒比其他病毒更接近于流感和副流感病毒，但在血清学和其他方面(例如不能在鸡蛋中生长及产生血凝素)可与之进行鉴别。它是婴幼儿下呼吸道感染(包括毛细支气管炎和肺炎)最重要的病因之一，可能是致命性的；在健康成人和年长儿，呼吸道合胞病毒仅引起轻症呼吸道感染，但也可引起支气管肺炎和慢性支气管炎，致使病情加剧。老年人和那些原有肺部疾病患者对呼吸道合胞病毒特别易感。其流行于每年的冬季或早春，成为流行很广的急性呼吸道疾病，能使支气管炎和肺炎的发病率和病死率上升。呼吸道合胞病毒亚型每年反复流行表明，病人可反复感染得病。虽然在5岁儿童中有70%存在血清抗呼吸道合胞病毒的抗体，但感染仍可不断发生于任何年龄。血清抗体抗感染作用不很明显的典型例子可见于6个月以下的婴儿，这类小儿的支气管，肺均未发育成熟；虽然这些婴儿具有母亲的抗体，但仍能发生严重的下呼吸道疾病，导致病死数明显上升。其感染症状差异很大。一般说来，与年龄，以前接触呼吸道合胞病毒和潜在疾病(尤其是呼吸道疾病)有关。临床体征没有什么特殊，呼吸困难，咳嗽，喘鸣是最突出的症状，通常出现在上呼吸道体征后的数日之内。婴幼儿常伴发热，气急可见于婴儿中，并可在其他症状和体征以前最早出现。X线胸片常显示明显的支气管肺炎和/或毛细支气管炎表现。白细胞计数正常也可能增高，但中性粒细胞可能中度升高。在成人和年长儿，感染可能不明显或仅表现为无热性上呼吸道感染(普通感冒)，呼吸道合胞病毒感染还非常像流感。因慢性支气管炎急性恶化而住院者中有15%是合胞病毒感染。由于其非典型症状，其诊断主要依靠实验室诊断，另外由于呼吸道合胞病毒不耐冰冻和冻融，除非通过特殊的培养基保护，标本很难贮存或远距离运送。流感病毒流行性感冒病毒，简称流感病毒，是一种造成人类及动物患流行性感冒的RNA病毒，呈球形，新分离的毒株则多呈丝状，其直径在80至120纳米之间，丝状流感病毒的长度可达400纳米。其病毒结构自外而内可分为包膜、基质蛋白以及核心三部分，其传染性强，传播速度快。在分类学上，流感病毒属于正黏液病毒科，它会造成急性上呼吸道感染，并借由空气迅速的传播，在世界各地常会有周期性的大流行，一年四季人都可能受到流感病毒的攻击，但冬季是一个高发季节。流行性感冒病毒对免疫力较弱的老人或小孩及一些免疫失调的病人会引起较严重的症状，如肺炎或是心肺衰竭等根据流感病毒感染的对象，可以将病毒分为人类流感病毒、猪流感病毒、马流感病毒以及禽流感病毒等类群，其中人类流感病毒根据其核蛋白的抗原性可以分为三类:甲型流感病毒（Influenza A virus），又称A型流感病毒，乙型流感病毒（Influenza B virus），又称B型流感病毒，丙型流感病毒（Influenza C virus），又称C型流感病毒 ，在核蛋白抗原性的基础上，流感病毒还根据血凝素和神经氨酸酶的抗原性分为不同的亚型。在感染人类的三种流感病毒中，甲型流感病毒有着极强的变异性，乙型次之，而丙型流感病毒的抗原性非常稳定。乙型流感病毒的变异会产生新的主流毒株，但是新毒株与旧毒株之间存在交叉免疫，即针对旧毒株的免疫反应对新毒株依然有效。流感病毒侵袭的目标是呼吸道粘膜上皮细胞，它会引起宿主细胞变性、坏死乃至脱落，造成粘膜充血、水肿和分泌物增加，从而产生鼻塞、流涕、咽喉疼痛、干咳以及其它上呼吸道感染症状，当病毒蔓延至下呼吸道，则可能引起毛细支气管炎和间质性肺炎。偶有侵袭肠粘膜的病例，则会引起胃肠型流感。另外，病毒感染还会诱导干扰素的表达和细胞免疫调理，造成一些自身免疫反应，包括高热、头痛、腓肠肌及全身肌肉疼痛等，病毒代谢的毒素样产物以及细胞坏死释放产物也会造成和加剧上述反应。由于流感病毒感染会降低呼吸道粘膜上皮细胞清除和黏附异物的能力，所以大大降低了人体抵御呼吸道感染的能力，因此流感经常会造成继发性感染，由流感造成的继发性肺炎是流感致死的主要死因之一。早期与传染性非典型肺炎的鉴别诊断困难。副流感病毒人类副流感病毒(HPIVs)是常常引起儿童下呼吸道感染的一种病毒，其致病性仅次于呼吸道合胞病毒，它是单链的RNA病毒，病毒表面含有溶合酶和红血球凝聚素神经氨酸苷酶的糖蛋白质。从血清学上人类副流感病毒可分为4型（1型到4型），其中4型又分a和b两个亚型。病毒颗粒大小不一（平均直径大小在150纳米300纳米之间），形态各异。在外环境下不稳定，在物体表面存活几个小时，肥皂水就很容易使其失去活性。当有传染性的物质接触了人的眼睛、口腔或鼻子里的粘膜后就会发生感染，或通过吸入由于喷嚏和咳嗽产生的呼吸道分泌物的飞沫而感染。人类副流感病毒可以在这种悬浮状态下存活一个小时以上。副流感病毒感染全年均可发生(尤其是第3型)。第1和第3型副流感病毒感染常见于幼儿，局部流行发生于托儿所，儿科病房，小学及其他儿童场所。第3型为地方性流行，传染性强，四季均可发生，多数儿童1岁内可感染。由副流感病毒1型或2型引起的流行性疾病有每年均可发生并交替占主导地位的倾向。第2型引起的疾病更趋于散发。第1，2，3型可在秋季流行。第4型引起轻度呼吸道疾病；在成人中几乎普遍存在的免疫力可减轻疾病的严重程度并阻止副流感病毒的传播。然而，同一型副流感病毒，尤其是第1型和第3型，可引起第2次甚至第3次感染。与呼吸道合胞病毒 (RSV)一样，人类副流感病毒可以造成反复发作的上呼吸道感染（如感冒和喉咙痛）。它也能造成严重的反复感染的下呼吸道疾病（如肺炎，支气管炎和细支气管炎），特别是在老年人中和有免疫缺陷人群中。人类副流感病毒的四种亚型各有不同的临床和流行病学特征。1型和2型的最典型的临床特征是造成儿童喉气管支气管炎，1型是这种儿童喉气管支气管炎的主要原因，而2型次之。1型和2型均能造成其它的上呼吸道和下呼吸道疾病。3型经常导致肺炎和细支气管炎。4型很难检出，可能是因为它很少导致严重的疾病。人类副流感病毒的潜伏期一般在17天左右。其主要通过实验室检测来诊断，临床上无法作出副流感的特异性诊断。需要时，病毒的分离和鉴定可通过组织培养接种；应用免疫和分子生物学技术可检测呼吸道受感染细胞中的病毒抗原。用急性期和恢复期血清作CF(补体结合试验)，HI(血凝集抑制反应)和中和试验可证实副流感病毒感染，但如果不作病毒分离，由于血清学的交叉反应，就难以鉴定特异的病毒型。九、 非典型呼吸道病原体的实验室检查方法非典型呼吸道病原体因其临床的非特异性症状，大部分依靠实验室检查方法，而检测方法多种多样，主要的方法有: 细菌的病原体分离培养及病毒的培养组织细胞培养法，血清学和直接检测法(包括电镜法)；间接、直接免疫荧光抗体法(IFA/DFA); 酶免疫测定(EIA )、核酸扩增法(PCR )。常用的实验室检测方法有：1. 病原分离培养分离前对感染病原的种类应有所估计，以便选择适当的方法。收集标本时可用鼻洗液、咽漱液、咽拭子、鼻拭子、痰、血、穿刺标本和尸检材料等。标本以床边接种为宜，或将标本置于冰壶内送交化验室，选定合适的培养基或细胞，在23小时内接种培养。 2. 分子生物学方法通过特定的DNA 引物扩增检测病原体的特异性DNA ,具有特异性强,敏感性高等优点，适用于多种病原体的检测。3. 血清学检测本方法是通过患者血清与标准抗原或由患者分离的新病原作抗原来进行的。常用的方法有：1） 补体结合试验：可用于各种呼吸道病原感染或需要鉴别的其他病原体感染。2） 血凝拟制试验：本试验需要病毒较多，要先除去非特异的红细胞拟制物质。常用于流感、副流感、肠道病毒、ECHO病毒、腺病毒等。3） 中和试验：针对不同的病毒，选取相应的敏感动物，鸡胚或组织培养，鼻病毒和其他一些病毒感染的诊断，均常用此法。4） 间接（被动）血凝试验：可用于多种呼吸道病原体感染。5） 酶联免疫法或免疫荧光法：可通过检测抗原或者抗体而检测多种呼吸道感染病原体。尽管呼吸道病原的检测方法多种多样，但确诊感染病原仍非常困难。细菌的病原体分离培养及病毒的培养组织细胞培养法过去常作为 “金标准”，但因其操作复杂、培养时间长、技术难度大、阳性率低等缺点而很难实现，近10 年已被分子方法所取代。随着快速诊断技术的迅速发展，分子检测技术愈趋完善，已经被作为呼吸道病原体检测的新标准，但因其对实验室条件要求高而无法普及，而且商品化的产品较少，未形成系列，多数病原尚不能检测。近年来由于免疫技术的发展，特别是免疫标记技术的广泛应用，如直接、间接免疫荧光法、抗碱性磷酸酶桥联酶标法等标记技术，检测方便，快速且成本低廉适，适合于临床要求，因此在临床上有重要意义。但像肺炎这样难以诊断的临床病例，应该使用不同的诊断方法同时检测，以获得最佳的诊断结果，每种方法都是对其它诊断方法的一种证实和有效的确认，各种方法之间应该是一种互补的关系。十、 免疫荧光法介绍免疫荧光技术（Immunofluorescence technique ）又称荧光抗体技术，是标记免疫技术中发展最早的一种。它是在免疫学、生物化学和显微镜技术的基础上建立起来的一项技术。很早以来就有一些学者试图将抗体分子与一些示踪物质结合，利用抗原抗体反应进行组织或细胞内抗原物质的定位。Coons等于1941年首次采用荧光素进行标记而获得成功。这种以荧光物质标记抗体而进行抗原定位的技术称为荧光抗体技术（fluorescent antibody technique）。 用荧光抗体示踪或检查相应抗原的方法称荧光抗体法；用已知的荧光抗原标记物示踪或检查相应抗体的方法称荧光抗原法。这两种方法总称免疫荧光技术，因为荧光色素不但能与抗体球蛋白结合，用于检测或定位各种抗原，也可以与其他蛋白质结合，用于检测或定位抗体，但是在实际工作中荧光抗原技术很少应用，所以人们习惯称为荧光抗体技术，或称为免疫荧光技术。用免疫荧光技术显示和检查细胞或组织内抗原或半抗原物质等方法称为免疫荧光细胞（或组织）化学技术。荧光免疫法按反应体系及定量方法不同，还可进一步分做若干种。与放射免疫法相比，荧光免疫法无放射性污染，并且大多操作简便，便于推广。该技术的主要特点是：特异性强、敏感性高、速度快。主要缺点是：非特异性染色问题尚未完全解决，结果判定的客观性不足，技术程序也还比较复杂。但近年来发展了几种特殊的荧光免疫测定，已经很好改善了这些缺点，与酶免疫测定和放射免疫分析一样，应用在临床检验中。1原理免疫学的基本反应是抗原-抗体反应。由于抗原抗体反应具有高度的特异性，所以当抗原抗体发生反应时，只要知道其中的一个因素，就可以查出另一个因素。免疫荧光技术就是将不影响抗原抗体活性的荧光色素标记在抗体（或抗原）上，与其相应的抗原（或抗体）结合后，在荧光显微镜下呈现一种特异性荧光反应。其根据反应体系的不同可分为：直接法：将标记的特异性荧光抗体，直接加在抗原标本上，经一定的温度和时间的染色，用水洗去未参加反应的多余荧光抗体，室温下干燥后封片、镜检。间接法：如检查未知抗原，先用已知未标记的特异抗体（第一抗体）与抗原标本进行反应，用水洗去未反应的抗体，再用标记的抗抗体（第二抗体）与抗原标本反应，使之形成抗原抗体抗体复合物，再用水洗去未反应的标记抗体，干燥、封片后镜检。如果检查未知抗体，则表明抗原标本是已知的，待检血清为第一抗体，其它步骤的抗原检查相同。根据抗原抗体反应后定量方法的不同可分为：荧光抗体技术(荧光显微镜技术)：抗原抗体反应后，利用荧光显微镜判定结果的检测方法。免疫荧光测定技术：抗原抗体反应后，利用特殊仪器测定荧光强度而推算被测物浓度的检测方法。2.荧光物质 许多物质都可产生荧光现象，但并非都可用作荧光色素。只有那些能产生明显的荧光并能作为染料使用的有机化合物才能称为免疫荧光色素或荧光染料。常用的荧光色素有：1）异硫氰酸荧光素（fluoresceinisothiocyanate，FITC）：为黄色或橙黄色结晶粉末，易溶于水或酒精等溶剂。分子量为389.4，最大吸收光波长为490495nm，最大发射光波长520530nm，呈现明亮的黄绿色荧光，有两种同分异结构，其中异构体型在效率、稳定性、与蛋白质结合能力等方面都更好，在冷暗干燥处可保存多年，是应用最广泛的荧光素。其主要优点是：人眼对黄绿色较为敏感，通常切片标本中的绿色荧光少于红色。2）四乙基罗丹明（rhodamine，RIB200）：为橘红色粉末，不溶于水，易溶于酒精和丙酮。性质稳定，可长期保存。最大吸收光波长为570nm，最大发射光波长为595600nm，呈橘红色荧光。3）四甲基异硫氰酸罗丹明（tetramethylrhodamineisothiocyanate，TRITC）：最大吸引光波长为550nm，最大发射光波长为620nm，呈橙红色荧光。与FITC的翠绿色荧光对比鲜明，可配合用于双重标记或对比染色。其异硫氰基可与蛋白质结合，但荧光效率较低。3. 荧光显微镜荧光显微镜是本试剂盒结果观察需要用到的唯一设备，根据生产商提供的说明书使用显微镜，选择合适的滤色块观察结果。3.1 荧光显微镜的使用方法3.1.1 准备工作显微镜初次使用，准备工作必不可少，具体步骤如下：1）打开开关。2）指示灯亮后，按下启动按钮2-3秒后点燃汞灯。 注意：一般等5分钟后，即能进行显微镜观察工作，但汞灯光源至完全稳定约需15分钟。3) 除下物镜转换器上的一个物镜，并在这位置上装上对中工具，使对中工具进入光路。4) 旋松灯室固定螺杆，沿主体前后移动，至灯丝的像聚焦在对中工具窗上，旋紧固定螺杆。5)松开灯座套固定螺杆，转动灯横向对中螺杆和纵向对中环，使灯丝像投至窗口中心。6）均匀松开纵向对中环，使灯丝像偏离中心，旋转后镜镜导杆，使反射出来的灯丝像，聚焦在这工具的对中窗上。7）转动后镜对中螺杆，使灯丝的反射像对称。8）转动灯丝纵向对中环，使灯丝像和灯丝反射像叠和在对中工具窗上。3.1.2 显微镜的操作1) 在反射荧光装置主机的滤色块装入口中，插入适合所采用激发方式的滤色块。 2) 推进激发方式转换钮，以使滤色块进入光路。 3) 点亮汞灯。 4) 检查照明是否正确。 5) 将标本放上载物台，并将10物镜放入观察位置，对标本调整焦距。 6) 调整目镜眼幅间距和视力。 7) 将需要的物镜转入位置再一次对标本调焦。8) 调节视场光阑。注意：把左右两个激发方式转换钮都拉出，可进行常规观察。3.2使用荧光显微镜的注意事项1）严格按照荧光显微镜出厂说明书要求进行操作，不要随意改变程序。2）应在暗室中进行检查。进入暗室后，接上电源，点燃超高压汞灯515min，待光源发出强光稳定后，眼睛完全适应暗室，再开始观察标本。3）防止紫外线对眼睛的损害，在调整光源时应戴上防护眼镜。4）检查时间每次以12h为宜，超过90min，超高压汞灯发光强度逐渐下降，荧光减弱；标本受紫外线照射35min后，荧光也明显减弱；所以，最多不得超过23h。5）荧光显微镜光源寿命有限，标本应集中检查，以节省时间，保护光源。天热时，应加电扇散热降温，新换灯泡应从开始就记录使用时间。灯熄灭后欲再用时，须待灯泡充分冷却后才能点燃。一天中应避免数次点燃光源。6）标本染色后立即观察，因时间久了荧光会逐渐减弱。若将标本放在聚乙烯塑料袋中4保存，可延缓荧光减弱时间，防止封裱剂蒸发。7）荧光亮度的判断标准：一般分为四级，即“一”无或可见微弱荧光。“+”仅能见明确可见的荧光。“+”可见有明亮的荧光。“+”可见耀眼的荧光。十一、 呼吸道九联检产品介绍九项呼吸道感染病原体IgM抗体检测试剂盒，采用间接免疫荧光法（IFA），同时检测人血清中呼吸道感染主要病原体的IgM抗体，可检的病原体包括：嗜肺军团菌血清1型、肺炎支原体、Q热立克次体、肺炎衣原体、腺病毒、呼吸道合胞病毒、甲型流感病毒、乙型流感病毒和副流感病毒1、2和3型。用于呼吸道感染疾病的辅助诊断。1.检测原理间接免疫荧光法（IFA）（图1）是基于待测样本中的抗体与吸附在载玻片上的抗原发生的反应。样本中存在的特异性抗体和抗原反应，未与抗原结合的免疫球蛋白在洗涤步骤中除去。在下一步骤中，抗原-抗体复合物与荧光素标记的抗人球蛋白反应，用免疫荧光显微镜观察结果。图1：九项呼吸道感染病原体IgM抗体检测试剂盒检测原理2. 试剂盒组成及用途组分成分和用途载玻片检测的物理载体，覆有聚四氟乙烯并包被有针对检测物的特异性抗原，包装袋内有一袋硅胶以防潮。质控品用于证明试剂盒及试验的有效性，含有人血清及防腐剂。吸附剂羊抗人IgG用来吸附人IgG避免干扰IgM 检测，含有防腐剂。FITC结合物荧光素标记的抗人免疫球蛋白结合物，含有染色液、防腐剂和蛋白稳定剂。和抗原抗体复合物反应，并显色。封闭介质甘油缓冲液，便于观察。磷酸盐缓冲液(PBS)用于洗涤步骤，从反应介质中除去未结合的免疫球蛋白和结合物。3. 操作步骤3.1 实验前准备1）实验所需物品准备：1000ml量筒、1000ml烧杯、离心管、微量移液器、温育湿盒、洗瓶、水平摇床、恒温箱、盖玻片、荧光显微镜。2）PBS洗液的准备：将1瓶PBS粉末倒入烧杯中，加入1L蒸馏水中，摇匀直至完全溶解，配好后储存在2-8C备用。3）使用前，将所有试剂平衡至室温，将恒温箱调至37。3.2 实验步骤1）样本的稀释：按1:1比例稀释血清标本，即25L血清加入25L PBS中。阴阳性对照不需要稀释。2）用吸附剂处理稀释后的血清：将30L稀释后的血清加入150L吸附剂中，彻底混匀。阴阳性对照不需吸附剂处理。处理后的血清要离心10-15分钟除去沉淀，以防干扰检测。3）在载玻片的每孔中加15L吸附剂处理过的血清。在一个载玻片的每孔中加入15L不稀释的阳性对照，在另一个载玻片的每孔中加入15L不稀释的阴性对照。4）将载玻片放入湿盒中，37温育90分钟。5）用PBS洗液的缓慢水流冲洗载玻片（避免直接冲入孔内）后，浸泡在PBS中并放置在水平摇床上轻轻摇动10分钟。将载玻片用蒸馏水缓慢水流冲洗（避免直接冲入孔内）。6）载玻片自然晾干。7）每孔加入15L FITC结合物溶液（不需稀释）。8）将载玻片放入湿盒，37温育30分钟。9）重复6和7的洗涤步骤。10）加几小滴封闭介质，小心盖上盖玻片。11）尽快用荧光显微镜在400倍放大率下观察结果。如果不能立即观察，可将其避光放置于2-8C不超过24小时。简明操作程序： 4. 结果判断4.1有效性判断每一次试验都应设立阳性和阴性对照，以确认试验和试剂盒的有效性。观察到的荧光模式应为：阳性对照：腺病毒、流感病毒、呼吸道合胞病毒或副流感病毒对阳性质控的1-15%细胞出现苹果绿细胞核、胞浆或胞膜荧光（在副流感病毒和呼吸道合胞病毒中能同时观察到着色的合胞）；军团菌、衣原体或立克次体中所有的细菌呈现出苹果绿荧光；支原体对阳性质控在细胞外围呈现苹果绿色荧光。阴性对照：军团菌、肺炎衣原体和立克次体无荧光，支原体、腺病毒、甲型和乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒和副流感病毒的细胞呈现红色。阳性结果荧光图谱：阴性结果荧光图谱：4.2样本结果判断阳性结果：可以观察到腺病毒、流感病毒、呼吸道合胞病毒或副流感病毒对阳性血清的1-15%细胞的细胞核、胞浆或胞膜出现苹果绿色荧光（在副流感病毒和呼吸道合胞病毒中能同时观察到着色的合胞）；军团菌、衣原体或立克次体中所有的细菌呈现出苹果绿色荧光；支原体对阳性血清在细胞外围呈现苹果绿色荧光。阴性结果：可观察到军团菌、肺炎衣原体和立克次体无荧光，支原体、腺病毒、甲型和乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒和副流感病毒的细胞呈现红色。5. 性能指标5.1.临床灵敏度和特异性采用方法学对比进行阴阳性符合率分析，阳性符合率代表灵敏度，阴性符合率代表特异性，结果如下：病原体对比方法样本数量阳性符合率阴性符合率嗜肺军团菌IFA8294.4%98.4%肺炎支原体ELISA6296.8%100.0%Q热立克次体IFA74100.0%97.6%肺炎衣原体IFA61100.0%98.0%腺病毒ELISA7485.7%97.0%呼吸道合胞病毒ELISA9793.8%100.0%甲型流感病毒ELISA4694.1%96.4%乙型流感病毒ELISA40100.0%96.4%副流感病毒ELISA36100.0%96.3%5.2 精密度5.2.1分析内精密度在相同实验条件下由同一个操作人员在同一次试验中对3份血清（2份阳性和1份阴性）分别进行5组加样检测。结果：滴度变化不超过一个稀释度。5.2.2分析间精密度在5种不同条件下（不同操作人员或不同试验日期）对3份血清（2份阳性和1份阴性）进行检测。结果：滴度变化不超过一个稀释度。5.3 交叉反应和干扰病原体干扰物质样本例数结果嗜肺军团菌 肺炎支原体、肺炎衣原体和Q热立克次体、革兰氏阴性细菌（布鲁氏菌，沙门氏菌）和抗核抗体20无交叉反应或干扰肺炎支原体嗜肺军团菌、肺炎衣原体和Q热立克次体12立克次体肺炎支原体、肺炎衣原体和嗜肺军团菌、同种属的细菌（发疹伤寒等的病原体）和抗核抗体20肺炎衣原体嗜肺军团菌、Q热立克次体和肺炎支原体，同种属的细菌（发疹伤寒等的病原体）和抗核抗体20腺病毒RSV、甲型和乙型流感病毒和副流感病毒8呼吸道合胞病毒腺病毒、甲型和乙型流感病毒和副流感病毒或根据病毒分类（麻疹）10甲型流感病毒RSV、乙型流感病毒、腺病毒和副流感病毒 8乙型流感病毒