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GFP的简介和应用【摘要】源于多管水母属等海洋无脊椎动物的绿色荧光蛋白（GFP），是一种极具应用潜力的标记物，有着极其广泛的应用前景。本文就GFP的理化性质、荧光特性、改进以及它在科学研究中发挥的作用进行了综述。【关键词】绿色荧光蛋白（GFP）、标记物、荧光特性、进展、改进、应用、干细胞移植【正文】一、GFP的简介1. GFP的理化性质，荧光特性及其改进1.1 GFP的理化性质从水母体内分离到的GFP基因，长达2.6kD，由3个外显子组成，分别编码69、98和71个氨基酸。GFP本身是一种酸性，球状，可溶性天然荧光蛋白。Aequoria GFP分子量约27103，一级结构为一个由238 个氨基酸残基组成的单链多肽；而Renilla GFP是分子量为54kD的同型二聚体。两种GFP有不同的激发光谱，Aequoria GFP在395 nm具有最高光吸收峰，肩峰为473 nm；Renilla GFP在498 nm具有强烈的光吸收，肩峰为470 nm。两种GFP含有相同的生色团，发射光谱基本相同（max= 508 509 nm）。GFP性质极其稳定，易耐受高温处理，甲醛固定和石蜡包埋不影响其荧光性质。其变性需在90或pH12.0的条件下用6mol/L盐酸胍处理，一旦恢复中性环境，或去除变性剂，虽然变性的蛋白质并不能完全复性，但是复性蛋白质同天然蛋白质对温度、pH变化的耐受性、抗胰蛋白酶消解的能力是相同的。更重要的是，它们在很大的pH范围内的吸收、发射光谱也是相同的。Renilla GFP的稳定性就更为显著。它在上述一系列的变性条件下都很稳定，不易变性。根据Sheen等的研究，GFP在受体内表达时，其稳定性并不亚于CAT 蛋白，因而可以得到持续时间较长的荧光。1.2 GFP的荧光原理GFP的性质和发射光谱的稳定性是同其生色团结构的稳定性密不可分的。GFP表达后折叠， 在氧存在的条件下，使66位氨基酸残基的、键间脱氢。由65 67位的氨基酸残基（Ser- Tyr Gly）环化为稳定的对羟基苯咪唑啉酮（4- p- hydroxybene- 5- imidazolinone），形成生色团（基于组成生色团的元件不同，可将已知的GFP及其变种分为7种，每一种都有一组不同的荧光激发和发射波长)。GFP无需再加任何底物和辅助因子，在紫外或蓝光激发下就能发荧光，在450 490nm蓝光激发下，GFP荧光至少能保持10min以上，不像其他荧光素，荧光容易淬灭。其中，GFP的一个引人注目的特点，其生色团的形成没有物种的特异性。可以在翻译后2 4h通过自动催化作用来合成。Cubitt 等认为生色团自身环化的驱动力来自蛋白质三维结构的形成，由此Kolb等提出一个假说， 即环化在新合成的多肽的折叠过程中进行。1.3 GFP的荧光性质及应用优点GFP的荧光性质比较特殊，具有诸多优点而备受关注。（1）易于检测，灵敏度高。GFP荧光反应不需要外加底物和辅助因子，只需紫外光或蓝光激发，即可发出绿色荧光，用荧光显微镜甚至肉眼就可以观察到。其次， 即便是未经纯化的GFP发射的绿光也是相当强的，在正常室内光线下仍清晰可辨。对于单细胞水平的表达也可识别。（2）荧光性质稳定。GFP对光漂白（一种荧光衰减现象）有较强的耐受性，能耐受长时间的光照，从而延长了可探测时间； GFP在pH7 12范围内也能正常发光，对高温（70 ）、碱性、除垢剂、盐、有机溶剂和大多数普通酶都有较强抗性。（3）对细胞无毒害。从目前的研究结果来看，GFP对生活的细胞基本无毒害，与目的基因融合后，对目的基因的结构功能没有影响，转化后细胞仍可连续传代。（4）构建载体方便。由于编码GFP的基因序列很短，所以很方便地同其它序列一起构建多种质粒，而不至于使质粒过大影响转化频率。（5）可直接用于活细胞测定。GFP 是能在异源细胞内表达后，能自发产生荧光的蛋白，并且GFP的分子量较小，N-端和C-端都能忍受蛋白的融合，是理想的标记物，可进行活细胞实时定位观察，更能接近自然真实的状态。如在活细胞中直接观察蛋白向细胞核、内质网运动的状态，还可实时观察到外界信号刺激下，目的蛋白的变化过程，借助荧光显微镜观察，使研究更为方便。使用激光共聚焦显微镜，其图像效果更佳，结合现代的计算机软件，可进行三维显示。（6）不受假阳性干扰。由于其他生物本身不含有GFP，因此不会出现假阳性结果，GFP作为分子探针可以代替荧光染料，避免由于染料扩散造成的定位不准，使结果真实可靠。（7）广谱性。表现在GFP的表达几乎不受种属范围的限制，在微生物、植物、动物中都获得了成功的表达，其次是GFP没有细胞种类和位置上的限制，在各个部位都可以表达发出荧光。（8）易于得到突变体。如GFP中氨基酸的替换可产生不同光谱特性的突变体，且增强了荧光强度，适合在不同物种中专性表达。1.4 GFP的改进尽管GFP作为报告基因或分子探针有许多无可比拟的优点，但是野生型GFP（wtGFP）具有一定的缺点：如GFP有两个激发峰影响了其特异性，并且长波激发峰强度较小，不易观察；GFP合成及折叠产生荧光的过程慢，蛋白质折叠受温度影响大，表达量较低；而且在某些植物细胞中并不表达。这些都限制了进一步的应用，所以，一些研究人员运用定点突变、DNA- shuffling 等技术对GFP进行了改进，获得了荧光光谱、量子产率、溶解性、密码子嗜性、温度敏感性等改变的多种突变体，扩大了GFP的应用范围。2. GFP的应用GFP的应用主要集中在利用其荧光性质的基础上作为一种标记物。2.1 GFP在分子生物学上的应用2.1.1 GFP作为报告基因报告基因是一种编码可被检测的蛋白质或酶的DNA，如传统的荧光素酶（LUX）基因和-葡萄糖苷酶（GUS）基因。GFP作为基因报告可用来检测转基因效率，把GFP基因连接到目的基因的启动子之后，通过测定GFP的荧光强度就可以对该基因的表达水平进行检测。目前，此方法无论在农杆菌介导或基因枪介导的植物遗传转化中还是在活细胞、转基因胚胎和动物中都已得到非常广泛的应用，特别是在活细胞基因表达的时空成像方面。2.1.2 GFP作为融合标签GFP最成功的一类应用就是把GFP作为标签融合到主体蛋白中来检测蛋白质分子的定位、迁移、构象变化以及分子间的相互作用，或者靶向标记某些细胞器。在多数情况下，GFP基因在N-或C-末端与异源基因用常规的分子生物学手段就可以接合构成编码融合蛋白的嵌合基因，其表达产物既保持了外源蛋白的生物活性，又表现出与天然GFP相似的荧光特性。GFP的这种特性为蛋白质提供了一种荧光标记，不仅可以检测蛋白质分子的定位、迁移，还可以研究蛋白质分子的相互作用以及蛋白质构象变化，并依靠荧光共振能量转移即FRET 来进行检测。2.2 作为生物传感器2.2.1 检测pH野生型GFP和其许多突变体都具有依赖于pH的荧光变化，因而可以被用来检测活细胞内的pH。人们通常称它们为Phluprin。分为两类：比率Phluorin和盈缺Phluorin。当pH降低时，比率Phluorin的最大激发波长从395 nm到475 nm迁移，利用两个最大波长处的荧光强度的比率可以测量pH；当pH值小于6时，盈缺Phluorin在475nm处没有荧光。当pH回复到中性时，两类Phluorin都会在20 ms内复原。Hanson等在2002年就设计了一系列GFP突变体deGFP，作为双波长比率测量的pH探针，用于细胞内检测。2.2.2 检测卤素离子YFP（H148Q）变体不但对pH敏感而且对不同离子也同样敏感，故可以用来检测亚细胞结构中卤素离子的浓度和传递。2.2.3 其他检测应用另外，GFP可以应用于检测电位、氧化还原水平以及在信号转导中作为Ca2+指示剂。2.3 GFP在细胞生物学上的应用GFP具有同宿主蛋白构成融合子的性质，利用这一性质，可以将GFP定位到特定的细胞器和膜系统中，进行细胞生理过程、细胞动力学等的实时观测，或直接应用于定量分析。目前，GFP已经被成功地用于靶向标记包括细胞核、线粒体、质体、内质网等在内的细胞器。用GFP进行亚细胞定位，避免了提纯蛋白、标记异硫氰酸荧光素等荧光染料、经显微注射或其他方式导入细胞的复杂方法，从而使研究蛋白在活细胞的准确定位变得简单易行。2.4 GFP在筛选方面的应用2.4.1 GFP用于细胞的筛选基于GFP的荧光特性，并且荧光稳定以及检测方法快速、方便，GFP在细胞筛选上得到应用广泛。Yuk等使用GFP作为标记能快速筛选出在生长抑制环境下，仍能保持重组蛋白大量表达的CHO细胞。2.4.2 GFP用于药物的筛选利用GFP对目的物进行标记，追踪GFP，分析目的物在细胞中的变化情况，如酶分子分布状态、生物活性、受体、离子通道等变化，从而筛选出与体内信号分子功能相似的化合物。二、GFP的应用绿色荧光蛋白标记在干细胞移植中的应用绿色荧光蛋白标记具有很多优点，因而被广泛应用于干细胞移植的研究领域。目前，常用的绿色荧光蛋白标记干细胞的方式有3 种：质粒载体转染、病毒载体转染和绿色荧光蛋白转基因动物。绿色荧光蛋白质粒转染具有操作简便、对干细胞的免疫源性和毒性小等优点，但不十分稳定，容易丢失；病毒载体的优势是表达高效稳定，但存在免疫反应和致癌性等安全隐患；从绿色荧光蛋白转基因动物分离得到的干细胞标记稳定，无上述缺点，是最为理想的选择。目前，绿色荧光蛋白转基因在小动物中较为成熟，如绿色荧光蛋白转基因小鼠，而在大鼠等稍大动物中不十分成熟。绿色荧光蛋白标记的干细胞移植后在体内的分布情况可在荧光显微镜下直接观察到，结合使用定量聚合酶链反应、激光共聚焦和荧光激活细胞分类计数等技术方法，还可监测移植干细胞在体内的分化增生情况以及其在各组织的含量等。分别简述如下：1.1 监测移植干细胞在体内的分布情况关云谦等用质粒pEGFP-N1转染小鼠胚胎干细胞后，移植入活体大鼠纹状体内。直至移植后21 d，大鼠脑内可见大量绿色荧光蛋白阳性的移植细胞，表明绿色荧光蛋白质粒转化胚胎干细胞是移植示踪的较好方法；而Zhou等将pEGFP-N1质粒标记神经干细胞后移植到PD大鼠的纹状体，结果发现移植的神经干细胞可存活，并向致伤的脑组织定向迁移和集聚。Asano 等人用免疫缺陷病毒载体将绿色荧光蛋白基因转染到猕猴胚胎干细胞，然后将干细胞移植到发育中的猕猴胚胎中。移植后1个月和3个月，采用针对绿色荧光蛋白的定量聚合酶链反应和原位聚合酶链反应，发现移植的胚胎细胞广泛地分布在猕猴胚胎各组织内。Yagi等从绿色荧光蛋白转基因小鼠分离培养了造血干细胞，然后将其移植到Twither小鼠（一种脑部脱髓鞘损伤动物模型）脑部。移植后一定时间，荧光显微镜下可有效地监测移植细胞的分布情况， 他们发现移植的细胞遍布整个脑部，但在脱髓鞘区较多。类似的，Hill 等将从绿色荧光蛋白转基因小鼠分离的骨髓移植到大脑中动脉闭塞的小鼠脑内后，可发现在缺血的脑组织区域有大量的绿色荧光蛋白阳性细胞集聚。1.2 定量移植干细胞在体内各组织的含量Devine等将绿色荧光蛋白反转录病毒载体转染的骨髓间充质干细胞经静脉移植到亚致死剂量射线照射的狒狒和正常狒狒体内，联合使用荧光激活细胞分类计数法、针对绿色荧光蛋白序列的定量聚合酶链反应等方法，他们发现移植的骨髓间充质干细胞可广泛地分布到各组织； 但和正常狒狒相比，移植到放射损伤狒狒体内的细胞可相对较多地分布到骨髓和胃肠道等放射敏感器官。基质细胞源性细胞因子-1与其受体CXCR4之间的相互关系在造血干细胞归巢和动员入血中发挥重要作用，Kahn等构建了人CXCR4-绿色荧光蛋白的融合蛋白慢病毒表达载体，然后采用针对绿色荧光进行荧光激活细胞分类计数定量分析转染此载体的造血干细胞移植后在骨髓和脾脏中的含量。结果表明，转染此载体的造血干细胞在骨髓和脾脏中的含量明显高于没有转染的造血干细胞。1.3 检测移植干细胞在体内的分化情况通常是通过荧光组织化学辅以激光共聚焦显微镜观察，或结合使用非荧光免疫组织化学和荧光显微镜观察实现。采用这种方法，人们发现，移植的骨髓细胞或骨髓间充质干细胞可分化为肝细胞、肺脏上皮细胞、纤维成肌细胞和肾小管上皮细胞、肾小球细胞和肾小球系膜细胞，参与损伤组织的修复；而移植的神经干细胞可分化为神经元和神经胶质细胞，从而促进损伤的神经功能恢复。1.4 分析干细胞移植后的基因和蛋白表达变化激光捕获显微切割技术是1996年由美国国立卫生研究院提出的在显微镜下从组织切片中分离、纯化单一类型细胞群或单个细胞的技术，其工作的基本原理和过程是：在高倍显微镜下，观察520m厚的组织切片，并依据细胞或组织形态学特征、免疫组化表型，来选择感兴趣的细胞，然后按压与显微镜相连的激光器按纽，激光源发出一束激光被激光对应部分的透明乙烯乙酸乙烯酯膜吸收，温度迅速升至90 左右并融化，并在激光脉冲结束200ms内瞬间冷却，与靶细胞结合，其结合力比靶细胞与载玻片间结合力更强；此时移动转运臂可使靶细胞从组织切片中分离出来。在捕获足够的细胞后，依据不同的研究目的分析其基因和蛋白表达的变化。绿色荧光蛋白标记的干细胞在移植后可通过激光捕获显微切割技术得以分离，结合使用基因芯片、抑制消减杂交和定量反转录聚合酶链反应等技术，人们可分析移植干细胞在和局部微环境相互作用后发生的变化，从而明确干细胞移植后生物学变化的机制，并根据机制研究的结果寻找提高干细胞移植疗效的方法。【参考文献】绿色荧光蛋白GFP 的研究进展及应用吴沛桥、巴晓革、胡海、赵静绿色荧光蛋白标记在干细胞移植中的应用宗兆文、程天民 （注：专业文档是经验性极强的领域，无法思考和涵盖全面，素材和资料部分来自网络，供参考。可复制、编制，期待你的好评与关注）