荧光分光光度法测定维生素B2的含量.doc

华南师范大学实验报告
课程名称： 仪器分析实验 实验项目：荧光分光光度法测定维生素B2
的含量
荧光分光光度法测定维生素B2的含量
一、实验目的
    1．掌握荧光物质的标准曲线法定量测量含量的操作方法和原理；
    2．了解分子荧光光谱定量分析与定性分析的特点及区别；
    3．熟悉荧光光度计定量法测量软件的数据处理。

二、实验原理
含有荧光基团的化学物质，其分子吸收了辐射能成为激发态分子，再从激发态返回基态时发射光的波长比吸收的入射光波长更长，分子荧光就是发光方式中较常见的光致发光。在一定频率和一定强度的激发光照射下，当溶液的浓度很小同时光被吸收的分数也不太大时，稀溶液体系将符合朗伯-比尔定律，该溶液所产生的荧光强度与溶液中这种荧光物质的浓度呈线性关系，可用公式表示：
IF=2.3K'kbcI0
当入射光强度I0一定时 IF=Kc 
以上两式中 K'为荧光量子效率； K为荧光分子的摩尔吸光系数；b为液槽厚度；c以为荧光物质的浓度。
分子荧光标准曲线法是取一定已知量的标准物质与待分析试样溶液经过相同的处理后，配制成一系列的标准溶液，测定其荧光强度，并以荧光强度为纵坐标，以标准溶液浓度为横坐标绘制其工作曲线，再由所测获的试样溶液的荧光强度对工作曲线作图从而求出试样溶液中该被分析检测物质的实际浓度含量。此法适用于痕量分析，并且标准溶液和试样溶液的荧光强度必须是在荧光仪已扣除空白溶液的荧光强度的读数。

维生素B2，又称核黄素。分子式C17H20N4O6。它是人体必需的13种维生素之一，作为维生素B族的成员之一，微溶于水，可溶于氯化钠溶液，易溶于稀的氢氧化钠溶液。
可以用荧光光度法测维生素B2的含量的原因:维生素B2溶液在430～440 nm蓝光的照射下，发出绿色荧光，荧光峰在535 nm。维生素B2在pH=6～7的溶液中荧光强度最大，在pH=11的碱性溶液中荧光消失，所以可以用荧光光度法测维生素B2的含量。
该实验的控制条件:维生素B2在碱性溶液中经光线照射会发生分解而转化为光黄素，光黄素的荧光比核黄素的荧光强的多，故测维生素B2的荧光时溶液要控制在酸性范围内，且在避光条件下进行。
荧光光谱法定量分析的理论依据: 常温下，处于基态的分子吸收一定的紫外可见光的辐射能成为激发态分子，激发态分子通过无辐射跃迁至第一激发态的最低振动能级，再以辐射跃迁的形式回到基态，发出比吸收光波长长的光而产生荧光。
三、仪器和试剂
（1）仪器 荧光光度计（FL-2500）、四面通石英比色皿一个：1cm 、1和2 mL刻度移液管各一支、吸耳球、洗瓶、镜头纸。
 （2）试剂 10.0μg/ml维生素B2标准溶液、二次蒸馏水
四、实验步骤
（1）. 打开氙灯，再打开主机，然后打开计算机启动工作站并初始化仪器，预热30min
（2） 仪器初始化完毕后，在工作界面上选择测量项目，设置适当的仪器参数：

设置发射波长为540 nm，在200~500范围内扫描，纪录荧光发射强度和激发波长的关系曲线，便得到激发光谱。从激发光谱图上可以找出其最大激发波长为440nm 
（3）标准溶液及样品的荧光测定
将激发波长固定在440nm，荧光发射波长为540nm。测量上述系列标准维生素Bz溶液的荧光发射强度。以溶液的荧光发射强度为纵坐标，标准溶液浓度为横坐标，制作标准曲线。
在同样条件下测定未知溶液的荧光强度，并由标准曲线确定未知试样中维生素Bz的浓度，计算药片中的维生素Bz的含量。
（4）退出主程序，关闭计算机，先关主机，最后关氙灯。

五 数据记录和结果分析（见最后一页）
1.用标准系列溶液的荧光强度绘制标准工作曲线。
Y = A + B * X
A=7.664 B=134.89
2、未知样品浓度的测定     
根据待测液的荧光强度，从标准工作曲线上求得其浓度，计算出试样中含量。 C样品=0.576%

 六、思考题：
1. 试解释荧光光度法较吸收光度法灵敏度高的原因。
答：荧光光度法：
对于以给定物质，当激发光波长和强度一定时，荧光强度只与溶液浓度有关：I=Kc 。由于自猝灭或者自吸效应，此线性关系只在极稀的溶液中成立。本次实验溶液较稀，负效应小。荧光光度法是垂直检测，有效避免了激发光源的干扰。
吸光光度法：

吸光度与溶液浓度的关系符合朗伯比尔定律：I=εbc,其光强度还与吸收池的厚度有关。而且测定过程中无法避免激发光源的影响。                              
综上所述，荧光光度法较吸收光度法灵敏度高。

2.维生素B2在pH＝6～7荧光最强，本实验为何在酸性溶液中测定？
答：因为维生素B2在碱性溶液中经光线照射，会发生分解而转化为光黄素，后者的荧光比核黄素的荧光强的多。因此，测量时溶液要控制在酸性范围内，且必 须在避光条件下进行。

3． 如何减小实验误差？
答：1. 为了测量的准确性，在进行标准溶液荧光强度的测定时一定要从稀到浓测定。
2.为了减少误差，配溶液应由一人操作。
3.每次测量前应用待测溶液润洗比色皿3次再装入待测溶液，拿比色皿应拿棱面。

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