医学分子生物学笔记.doc

医学分子生物学（medical molecular biology ）：医学分子生物学重要从分子水平研究人体在正常和疾病状态下的生命活动及其规律的一门学科；重要研究人体生物大分子的结构、功能、互相作用及其同疾病发生、发展的关系。第一章 基因（gene）的概念及其发展1、基因的物质载体是染色体2、基因的生化作用本质是控制酶的合成3、DNA是重要的遗传物质4、基因的概念：基因(gene)是核酸分子中储存遗传信息的遗传单位，是指储存有功能的蛋白质多肽链或RNA序列信息及表达这些信息所必需的所有核苷酸序列.第二节 基因的结构1、原核生物：类核2、真核生物：染色质，基本结构单位核小体第三节 基因的功能1、功能：运用四种碱基（A、T、 G 、C）不同排列负荷遗传信息； 通过复制将遗传信息传递给子代细胞； 作为基因表达模板2、 结构基因：概念：结构基因（structural gene）是指可以编码特定RNA分子或蛋白质分子的遗传单位。具有编码序列和非编码序列（与转录后加工、修饰及翻译过程相关）特点：原核生物结构基因编码序列连续真核生物结构基因编码序列是不连续的，称为断裂基因（split gene）。通常需要进行转录后剪接加工病毒结构基因编码序列取决于侵袭的宿主外显子（exon）和内含子（intron）：可以在成熟 RNA分子中保存的序列称为外显子（exon），而不能在成熟RNA分子中保存的序列称为内含子（intron）内含子数目=外显子-1（组蛋白编码基因无内含子）3、 调控序列：概念：与结构基因转录表达调控相关的非编码序列称为调控序列（regulating sequence），或调控基因（regulating gene）原核生物：启动子（promoter）：指位于结构基因上游，并与RNA聚合酶辨认、结合和启动转录有关的一段特殊DNA序列（启动子序列不出现于RNA产物中）。转录起始辨认部位+核心启动子（核心启动子=Pribnow盒+转录起始部位）终止子（terminater ）：指位于结构基因下游的一段富含GC的具有回文特性的特殊DNA序列，该序列转录生成的RNA可以形成特殊的发卡结构并导致RNA聚合酶从DNA模板上脱离，促使转录过程终止。操纵元件（operator ）：指位于结构基因上游的一段DNA序列，该序列可以被阻遏蛋白辨认并结合，从而阻止结构基因的转录。正调控蛋白结合位点：指常出现于弱启动子附近的一段特殊的DNA序列，能与某些具有转录激活作用的正调控蛋白辨认结合，从而加快转录的启动真核生物：启动子（promoter ）：类启动子、聚合酶、rRNA； 类启动子、聚合酶、mRNA和miRNA； 类启动子、聚合酶、5S rRNA、tRNA、snRNA增强子（enhancer ）：是位于结构基因上游（-100 -300bp）、基因之外或内含子中的特殊DNA序列，该序列能被蛋白因子辨认结合，促进邻近基因的转录表达。沉默子(silencer) ：负性调节元件，当其结合特异蛋白因子时，对基因转录起阻遏作用poly(A )信号：位于结构基因下游的加尾信号，其保守序列为AATAAA。该序列也参与RNA转录终止。第二章 基因组的结构与功能1、 基因组：细胞或者生物体一套完整的单倍体遗传物质的总和。2、 基因组的结构：不同的基因功能区域在核酸分子中的分布与排列情况；基因组的功能：贮存和表达遗传信息3、 原核生物基因组的结构与功能：原核生物基因组的特点：基因组相对较小，由DNA组成，涉及染色体DNA和质粒DNA两种DNA分子，均为环状双链。染色体DNA为单拷贝。每个DNA分子（染色体DNA和质粒DNA）只有一个复制起始点。结构基因通常为连续基因（无内含子），很少重叠基因，非编码序列和编码序列各占50%含可转移的序列（插入序列、转座子？）：引起插入突变基因，携带标志基因使受体增添新基因A、转座（transposition）：转座因子在基因组不同位置间的移动。B、转座因子（transposable element）：可以在一个DNA分子内部或两个DNA分子之间移动的DNA片段。功能相关的基因经常组织形成操纵子结构，操纵子结构是原核基因组的一个突出的结构特点：A、操纵子：功能上相关的若干结构基因串联在一起，由一套调控序列控制其转录表达，构成基本转录单位，称为操纵子（operon ）。（即调控序列+结构基因）（区别操纵元件）B、多顺反子 mRNA ( polycistronic mRNA):原核生物的一个 mRNA 分子带有几个结构基因的遗传信息，运用共同的启动子及终止信号，组成操纵子的基因表达调控单元。（相应于只有一个复制起始点）质粒（plasmid ） 是指存在于细菌中独立于染色体 DNA 外的双链环状小分子DNA，可进行自主复制。特点：在宿主细胞内可自主复制；所携带的遗传信息能赋予宿主特定的遗传性状；细胞分裂时恒定地传给子代；质粒可以转移4、 真核生物基因组的结构与功能（染色体DNA+线粒体DNA）：真核生物基因组的特点：1. 每一种真核生物都有一定的染色体数目；2. 远大于原核基因组，结构复杂，基因数庞大；3. 真核生物基因转录产物为单顺反子，无操纵子结构；4. 有大量反复序列;5. 真核基由于断裂基因;6. 非编码序列远远多于编码序列;7. 功能相关基因构成各种基因家族。 真核生物基因组都是由大分子双链线状DNA构成。染色体通常成对出现（双倍体）。 基因组非常庞大，结构非常复杂，有多个复制起始位点。基因组中存在大量的反复序列以及非编码序列。非编码序列占90%以上，是与细菌、病毒的重要区别，在一定限度上也是生物进化的标尺。真核生物基因组中也存在一些转座元件。反复序列分类：高度反复序列 highly repetitive sequences：A、 反向反复序列（inverted repeats）：是由两个相同顺序的互补拷贝在同一 DNA双链上反向排列而成。B、 卫星DNA（satellite DNA ）：有相同的核心序列,多为210 bp，成串排列。（大卫星DNA（macrosatellite DNA）染色体的着丝粒区；小卫星DNA（minisatellite DNA）常染色体；微卫星DNA（microsatellite DNA ）常染色体）C、 复杂反复序列（complex repeats）：这种高度反复序列的反复单位是较为复杂的核苷酸序列，多见于哺乳动物。功能：参与复制水平的调节；参与基因表达的调控；参与染色体配对（大卫星DNA位于着丝粒区）；参与转位作用；与进化有关；同一种属中不同个体的高度反复顺序的反复次数不同样，这可以作为每一个体的特性，即 DNA指纹。中度反复序列：一部分是编码 rRNA、tRNA、组蛋白及免疫球蛋白的结构基因，另一部分也许与基因调控有关。A、 短散在核元件（short interspersed nuclear elements ，SINEs）Alu反复序列家族B、 长散在核元件（long interspersed nuclear elements ，LINEs）Kpn反复序列家族低度反复序列（单拷贝序列）：在单倍体基因组中只出现一次或数次，结构基因重要是单拷贝序列。编码不同功能的蛋白质。多基因家族（multigenefamily）：概念：指DNA序列具有较高的同源性（通常大于50%），并且其编码产物具有相同或相似生理功能的一组结构基因。通常是由同一祖先基因经进化或变异而来。A、 基因家族成簇地分布在同一染色体上并同时进行转录，如组蛋白基因家族B、 基因家族成簇地分布于不同的染色体上并分别进行转录，且不同基因编码的蛋白质在功能上相关，如珠蛋白基因家族。假基因（pseudogene）：加工基因或非功能基因。:这类基因的核苷酸顺序虽然与正常的结构基因很相似，但基本上不能表达。因素：假基因是由于在进化过程中，某些 DNA片段发生了缺失、倒位或点突变，导致调控基因丢失；或无剪接加工信号；或编码区出现终止信号；或编码无功能或不完整的基因。线粒体DNA的结构：可独立编码存在于线粒体中的多肽链、 rRNA:或tRNA。编码 13种蛋白（呼吸链酶复合物的单位）、 22种tRNA和2种rRNA。5、 病毒基因组的特点：较小，但不同病毒基因组大小相差较大不同病毒基因组可以是不同结构的核酸除逆转录病毒外，通常为单倍体基因组有的病毒基因组存在节段病毒基因组基因有连续的和间断的（有内含子）功能相关基因可以转录成多顺反子mRNA基因重叠（Gene overlap）即同一段DNA片段可以以两种或两种以上的阅读方式进行阅读，因而可编码两种或两种以上的多肽第三章 基因的表达调控第一节 基因表达调控的基本规律1、 基因表达（gene expression）：是指在一定调节因素的作用下，生物基因组中的结构基因被激活并转录生成特定的RNA，或由此引起特异性蛋白质合成的过程 。本质基因转录或者翻译的过程。2、 基因表达调控 （gene expressionregulation）：是指生物体通过特定的蛋白质与DNA，蛋白质与蛋白质之间的互相作用来调控基因是否表达，或调节表达产物的多少以满足生物体的自身需求以及适应环境变化的过程。3、 基本规律：（1） 基因表达具有时空特异性：某一特定基因的表达严格按照特定的时间顺序发生。即空间分布差异，某一基因只在特定的细胞或组织中表达，或者不同的细胞或组织中的表达量不同（2） 诱导表达和阻遏表达是基因表达调控的普遍方式：组成性表达（constitutive gene expression ）：指个体发育的任一阶段都能在大多数细胞中连续进行表达的基因，不受环境的影响。管家基因：在一个生物体所有细胞中连续表达，且较少受环境因素的影响，这类基因通常被称为 管家基因（house-keepinggene）。如各种组蛋白基因可调控型表达（ adaptive expression）：A诱导：在特定环境因素刺激下，相应的基因被激活，从而使基因的表达产物增长的过程，称为诱导(induction) ，这类基因称为可诱导基因(inducible gene) 。可以诱导基因表达的分子称为诱导剂。B克制：在特定环境因素刺激下，基因被克制，从而使基因的表达产物减少的过程称为阻遏(repression)，这类基因称为可阻遏基因(repressible gene) 。可以阻遏基因表达的分子成为阻遏剂。C奢侈基因(luxury gene)：在特别细胞类型中大量表达并编码特殊功能产物的基因。这类基因指导合成组织特异性蛋白，对分化有重要影响。如肌肉细胞的肌动蛋白基因和肌球蛋白基因、红细胞的血红蛋白基因等。（3） 基因表达受顺式作用元件和反式作用因子共同调节：顺式作用元件为调控序列（基因），与结构基因位于同一DNA链上。反式作用因子为转录因子（蛋白质），辨认结合顺式作用元件而发挥作用。（4） 蛋白质-DNA以及蛋白质-蛋白质的互相作用是基因表达调控的分子基础（5） 基因表达调控是多层次的复杂调节：基因、转录、转录后、翻译、翻译后第二节 原核生物的基因表达调控1、原核生物基因表达的调控重要在转录水平，即对RNA合成的调控2、两种方式：起始调控，即启动子调控；终止调控，即衰减子调控3、转录起始的负调控：Lac操纵子的调控机制：阻遏蛋白的负调控机制CAP的正调控机制复合调控机制乳糖操纵子的基本结构体内生理诱导剂涉及乳糖及其代谢物别乳糖，体外实验诱导剂是人工合成底物异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）4、 转录终止的调控：色氨酸操纵子（trpoperon）色氨酸操纵子参与生物合成而不是降解，它不受葡萄糖或cAMP-CAP的调控。调控方式：通过阻遏蛋白的负调控；通过衰减子作用（attenuation ）色氨酸操纵子是通过转录衰减作用实现转录终止调控的典型例子转录衰减是一种将转录与翻译相偶联的调节机制。第三节 真核生物基因表达的调控1、 特点：多层次多水平；无操纵子和衰减子；个体发育复杂；需在特定的时间，特定的细胞中激活特定的基因，从而实现“预定”的、有序的、不可逆转的分化过程，并使生物的组织和器官保持正常的功能受环境影响小；正性调控占主导。2、 真核生物染色体水平的调控概述：染色体的转录基本单位核小体的改变：使基因组发生了改变A、 组蛋白修饰：如磷酸化、乙酰化、泛素化B、 DNA改变：基因丢失、扩增、重排和移位，可以消除或变换某些基因并改变其活性染色体自身结构的重构，调控真核生物的基因表达染色质的活化：活性染色质的核小体发生构象改变，具有疏松的染色质结构，从而便于转录调控因子与顺式调控元件结合和 RNA 聚合酶在转录模板上滑动活性染色质重要特性：A、活性染色质具有DNase I 超敏位点（DNase I hypersensitive site ）；B、活性染色质很少有组蛋白H1与其结合；C、活性染色质的组蛋白乙酰化限度高；D、活性染色质的核小体组蛋白H2B很少被磷酸化；E、活性染色质中核小体组蛋白H2A在许多物种很少有变异形式RNA聚合酶组合位点的上游和下游具有不同的超螺旋构象基因的甲基化修饰（DNA methylation）：A、 CpG岛的高甲基化促进染色质形成致密结构：甲基化限度高，基因表达水平减少；去甲基化限度高，基因表达增强。（CpG岛是位于基因5端富含CG碱基的调控序列，这些序列常位于启动子附近。在甲基转移酶的催化下， DNA的CG两个核苷酸的胞嘧啶被选择性地添加甲基，形成 5甲基胞嘧啶。）B、甲基化可以遗传形成，也可以后天获得且具有可逆性C、表观遗传：依靠亲本DNA链的甲基化位置催化子链DNA在相同位置发生甲基化的现象。表观遗传学（epigenetics）：重要研究不涉及DNA序列改变的可遗传的基因表达的改变。涉及：DNA甲基化、基因组印记、组蛋白修饰、染色质重塑和基因沉默。 染色质丢失基因扩增：单纯靠调节其表达活性局限性以满足需要基因重排（ gene rearrangement ）：免疫球蛋白的重排3、转录水平的调控 (转录速度决定RNA合成效率)（最重要）顺式作用元件与基因表达A、 顺式作用元件（cis-acting element ）：参与基因转录调控的DNA序列统称。B、 真核生物中涉及启动子（地中海贫血启动子区TATA盒）、增强子（无基因特异性；增强效应与位置和取向无关；可远距离发挥作用；有组织或细胞特异性，成环模型）、沉默子（沉默子、绝缘子是负调控元件，与反式作用因子互相结合而起作用。不受距离和方向的限制，可对异源基因的表达起作用。）、poly A信号等反式作用因子对基因表达的调控A、 反式作用因子（trans-acting factor ）：参与基因表达调控的蛋白质因子统称B、 涉及RNA聚合酶、转录因子C、 通用转录因子（general transcription factor ）：RNA聚合酶结合启动子所必需的一组蛋白因子，如 TFIIA、TFIIB、TFIID、TFIIE等。特异转录因子（special transcription factor ）：个别基因转录所必需的转录因子，如淋巴细胞中特异的 OCT-2.D、转录因子结构：蛋白质结合结构域、转录激活结构域（酸性激活域、谷氨酰胺富含域、脯氨酸富含域）、DNA结合结构域（锌指结构（zinc finger motif ）、螺旋-环-螺旋结构（helix-loop-helix，HLH）、螺旋-转折-螺旋结构（helix-turn-helix ，HLH）、亮氨酸拉链（leucine zipper）、碱性螺旋（alkaline -helix）a、 锌指（Zinc finger ）模体：b、 螺旋-环-螺旋（HLH）模体：2个螺旋和一个短肽段形成的环相连c、亮氨酸拉链（ leucine zipper ）模体：肽链上每隔 6个残基就有 1个疏水的Leu残基d、转录激活结构域：富含酸性氨基酸、富含Gln和富含Pro4、 转录后水平的调节也是基因表达调控的重要环节（控制 mRNA的结构与功能）mRNA前体的剪切：加帽、加尾、去除内含子选择性剪接（alternative splicing ）/ 可变剪接：mRNA前体可按不同方式剪接产生多种mRNA。真核基因内含子的存在是选择性剪接的分子基础5端非翻译区和3端非翻译区结构：5端非翻译区翻译克制蛋白，3端非翻译区AU丰富序列mRNA降解转录后基因沉默：RNA干扰作用引起特异性的mRNA模板的降解5、 翻译水平的调控决定蛋白质合成的速度磷酸化/脱磷酸化的调控mRNA损伤对翻译的影响第四节 基因表达调控异常与疾病1、 遗传性维生素D3抵抗性佝偻病：维生素D3受体基因上与DNA结合的部位发生点突变2、 HOH-Dream 综合症：转录因子TBX5基因的突变3、 原发性肿瘤：不适当的DNA共价修饰引发疾病，如低甲基化第七章 基因组学及相关组学第一节 基因组学1、基因组学（genomics）是指对整个基因组的结构、结构与功能的关系以及基因之间互相作用进行探索的一门科学2、人类基因组计划（human genome project，HGP）：测定出人类基因组DNA的所有碱基序列。（美国、英国、日本、法国、德国、中国）（遗传图、物理图、转录图、序列图）第三节 蛋白质组学1、蛋白质组学（Proteomics）：重要研究某种生物体、器官、组织、细胞或亚细胞结构在特定条件下所表达的所有蛋白质的种类和数量。2、三大技术：双向电泳分离技术、生物信息学解决技术、质谱技术第九章 细胞增殖分化的分子机制第一节 细胞增殖的分子基础1、细胞增殖( cell proliferation )：指细胞通过细胞生长（cell growth）和细胞分裂（cell division）使细胞数目增长 ,并使子细胞获得和母细胞相同遗传特性的过程，是个体生长发育的重要过程之一。2、 细胞增殖是生长的重要因素之一：细胞数目增多、细胞体积增大、细胞外基质合成3、 细胞周期是细胞分裂过程中的有序事件：细胞周期（cell cycle ）：指连续分裂细胞从一次有丝分裂结束到下一次有丝分裂结束所经历的整个过程。（M期, G1期, S期, G2期）4、 细胞周期蛋白调节细胞周期中不同时相的对的转换：细胞周期蛋白（cyclin）：一类随着细胞周期不同时相的转换，其浓度也随之发生变化的蛋白质，这些蛋白质通过与相应的蛋白激酶的结合对细胞周期进行调控。细胞周期蛋白依赖性激酶（cyclin-dependent kinase，CDK）：是一类cdc基因编码的蛋白的总称，只有与周期蛋白结合，并将周期蛋白作为其调节亚单位，进而才干表现出蛋白激酶活性。（调节亚单位Cyclin+催化亚单位CDK）Cyclin-CDK复合体的特点：A、 不同的CDK激酶所规定结合的周期蛋白不同，在细胞周期中执行的调节功能也不同B、Cyclin不总是与CDK结合在一起而是在细胞周期不同阶段有规律的降解使 CDK周期性失活。周期蛋白的泛素化降解：周期蛋白合成后其N端发生多泛素化（polyubiquitination ）细胞周期蛋白激酶的克制因子（CKI）：大部分CKI都是抑癌基因的编码产物。（INK4家族克制CDK4-cyclin D和CDK6-cyclin D）（CIP/KIP家族克制CDK2-cyclin A和CDK2-cyclin E）5、 细胞周期的调控：关卡（checkpoint）：A、G1关卡(G1-S) ：称start或R点。B、G2关卡(G2-M)：决定细胞一分为二的控制点。C、中期关卡(M后期-胞质分裂，纺锤体组装检查点)：任何一个着丝点没有对的连接到纺锤体上，都会引起细胞周期中断。细胞周期调控：A、 G1到S期转折-进入DNA合成期：a、 CyclinD与CDK结合使Rb释放结合的转录因子E2Fb、 启动DNA的复制，并防止组装新的复合体，保证S期中DNA仅复制一次B、G2M期转折-进入有丝分裂期：促有丝分裂因子（mitosis-promoting factor，MPF ），即CyclinB/ CDK1 蛋白复合体可促进细胞进入M期，激活APC，介导降解克制因子。a、细胞分裂后期促进复合体APC：APC介导CyclinB 多聚泛素化，CyclinB降解，使MPF失活。6、 生长因子（growth factor）：概念：是一类由细胞分泌的、类似于激素的信号分子，多数为肽类（含蛋白质）物质，具有调节细胞生长与分化的作用作用方式：旁分泌、自分泌、内分泌重要来自血管内皮细胞的生长因子是：ET重要来自胎盘或再生肝的生长因子是：HGF重要来自肿瘤等恶性转化细胞的生长因子是：TGF第二节 细胞分化的分子机制1、 细胞分化（cell differentiation ）：指胚胎细胞获得不同形态、结构和功能特性的过程。2、 细胞分化的特点：细胞分化贯穿生命的全过程:。细胞分化随着特异性基因的阶段性表达：A、 细胞分化的可逆性：在一定条件下，具有增生能力的组织中，已经分化的细胞可以逆转，并回复到胚性的状态（可分化状态），这种现象称为去分化。（细胞分化的稳定性是普遍的，可逆性是有条件的 ）B、 细胞分化的普遍性：细胞分化是一种普遍的生命现象，整个个体的生长中都有细胞分化，其中以胚胎期为主。细胞分化受到一系列信号分子的调控3、 胚胎干细胞分化的全能性：干细胞（stem cell ）：是具有自我更新、高度增殖和多向分化潜能的细胞群体A、 分类：a、全能干细胞（如胚胎干细胞、受精卵）b、多能干细胞（造血干细胞、神经干细胞、间充质干细胞、皮肤干细胞等 ）c、专能干细胞（如肠上皮干细胞 ）B、特点：a、终生保持未分化或低分化特性；b、在机体的中的数目、位置相对恒定；c、具有自我更新能力；d、能无限制的分裂增殖；e、具有多向分化潜能。胚胎干细胞 (Embryoucstem cell ，ES)：当受精卵分裂发育时，内层细胞团的细胞在体外通过培养即成为胚胎干细胞。胚胎干细胞是一种全能干细胞，它具有发育的全能性，能分化成人体的所有组织和器官。全能性（totipotency）：受精卵或者胚胎干细胞能分化形成生物个体内所有的不同类型细胞的能力称为全能性多能性（pluripotency）：多能干细胞能分化为体内大多数细胞类型的能力。造血干细胞细胞和间充质干细胞就属于多能干细胞单能性（unipotent）：只能分化为一种终末细胞的能力。如精原干细胞。4、 成体细胞的横向分化：横向分化或转分化（transdifferentiation ）：一种已经分化的细胞类型不可逆的转化为另一种正常分化的细胞类型。第十章 基因变异与疾病第一节 基因变异的基本概念1、基因变异（Gene Variation）：基因变异是指DNA的序列组成或结构在传递过程中发生了改变，也称基因突变（是人类遗传病产生的根源）生殖系突变：遗传病的本质所在体细胞突变：引发肿瘤的重要因素2、 基因变异涉及DNA多态性和致病突变：DNA多态性：某DNA序列的变异在人群中出现的频率1%，有的与疾病相关。致病突变：出现频率1%时称为拷贝数多态性STR：短串联反复序列，反复单位1-6bp，反复次数可变，反复总长度ssDNA(RNA) dsDNA DNA纯品：OD260/OD280=1.8 RNA纯品：OD260/OD280=2.0DNA的变性（denaturation）：定义：在某些理化性质作用下，DNA双链解开成两条单链过程。方法：强酸、强碱、加热、变性试剂如尿素、酰胺及乙醇、丙酮及高盐等。本质：本质是双链之间的氢键断裂4、 增色效应： DNA变性时其溶液OD260增高的现象。 减色效应：DNA复性时，其溶液OD260减少5、 Tm：变性是在一个相称窄的温度范围内完毕。在这一范围内，紫外线吸取值达成最高值的50%时的温度称为解链温度，或称为融解温度（melting temperature，Tm）。其大小与G+C含量成正比。6、 退火（annealing）：热变性的DNA经缓慢冷却后即可复性，这一过程称为退火7、 杂交（hybridization）：概念：指两条不同来源的互补核酸单链在一定条件下按碱基配对原则形成双链的过程。 原理：碱基互补、变性和复性杂交双链分别为待测的核酸序列和已知核酸序列，后者通常用同位素或非同位素示踪标记，称为探针（probe），杂交后形成的异源双链分子称为杂交子。8、 分子探针：探针是指一段已知序列的，能与目的基因互补配对的核苷酸序列9、 核酸分子杂交的基本类型：液相杂交：反映速度快，但不能简朴分离杂交体和游离核酸探针。固相杂交：A、 Southern印迹杂交（Southern blot hybridization）：指DNA-DNA杂交B、 Northern印迹杂交（Northern blot hybridization）：指DNA-RNA杂交，应用特异性基因探针分析基因的转录水平C、 原位杂交（in situ hybridization）：原位杂交可以用来拟定被测定序列在细胞内的空间位置。10、 Western免疫印迹（ Western Blot ）：11、 基因结构的分析与改造技术双脱氧末端终止法（分析DNA一级结构）：原理 核酸模板在核酸聚合酶、引物、四种单脱氧三磷酸核苷酸存在条件下复制或转录时，假如在四管反映系统中分别按比例引入四种双脱氧碱基，只要双脱氧碱基掺入链端，该链就停止延长，链端掺入单脱氧碱基的片段可继续延长。如此每管反映体系中便合成以共同引物为5端，以双脱氧碱基为3端的一系列长度不等的核酸片段。反映终止后，分四个泳道进行电泳。以分离长短不一的核酸片段(长度相邻者仅差一个碱基)，根据片段3端的双脱氧碱基，便可依次阅读合成片段的碱基排列顺序。 基因定点突变（site-directed mutagenesis)：定义：改变基因序列中的特定碱基称为基因定点突变。第二节 基因的获取1、PCR是一种体外快速扩增特定基因或DNA序列的方法，故又称基因的体外扩增法。2、反映体系：模板DNA：长度不宜大于10kb的单、双链均可两种引物：35引物，53引物。引物决定了PCR扩增产物的大小及其特异性耐热Taq-DNA聚合酶（Taq酶）四种脱氧核糖核苷酸3、反映原理：是一种在体外模拟天然DNA复制过程的核酸扩增技术，反映体系较为简朴。以拟扩增的DNA分子为模板，以一对分别与模板互补的寡核苷酸片段为引物，在DNA聚合酶作用下，按照半保存复制的机制沿着模板链延伸直至完毕新的DNA合成。不断反复这一过程，可使目的DNA片段得到扩增。因新合成的DNA也可以作为模板，因而PCR可使DNA的合成呈指数增长。 4、反映过程：变性（95解链）-复性（55引物结合）-延伸（72dNTP结合）三步循环反映。5、逆转录PCR（reverse transcription PCR，RT-PCR）：提取组织或细胞中的总RNA，以其中的mRNA为模板，采用Oligo（dT）或随机引物，运用逆