医学分子生物学复习重点.doc

分子生物学需要掌握的重点一、 DNA、RNA、蛋白质、质粒、基因、端粒、聚合酶、密码子、突变、变性的概念或结构、性质及特点；二、 复制、转录、逆转录、翻译、加工修饰、靶向输送的主要过程及特点；三、 癌基因的概念、原癌基因产物的类型及细胞定位、癌基因活化致癌的主要机制；四、 常用分子生物学技术的原理、主要步骤、酶学及特点；五、 基因表及其调控的原理、主要过程或步骤，乳糖操纵子的正、负调节机制；六、 常用的基因诊断及基因治疗技术；七、 基因克隆、基因诊断、基因治疗、管家基因、抑癌基因、Klenow片段、核蛋白体、限制性内切核酸酶、人类基因组计划、原位杂交的概念；八、 双脱氧末端终止法DNA测序、重组DNA技术的主要步骤；九、 结构基因、顺式作用元件、启动子、遗传密码、反式作用因子、氨基酰-tRNA、基因组文库、DNA多态性、转位因子、探针、Tm值、DNA微阵列、DNA甲基化的概念、性质；十、 核酸分子杂交的主要类型、PCR的主要步骤及引物设计；十一、 DNA、RNA及多肽链的合成方向；十二、 真核细胞转染的基本方法；十三、 细胞周期的主要调控点；十四、 DNA损伤及修复的主要类型和机制；十五、 基因文库筛选的主要方法及原理。名词解释l 质粒是细菌细胞内携带的染色体外的DNA分子，是共价闭合的环状DNA分子，能独立进行复制。质粒只有在宿主细胞内才能够完成自己的复制。l 基因指贮存有功能的蛋白质多肽链或RNA序列及表达这些信息所需的全部核苷酸序列，是核酸分子中贮存遗传信息的遗传单位。l 癌基因是细胞内控制细胞生长和分化的基因，具有潜在的诱导细胞恶性转化的特性，它的结构异常或表达异常，可以引起细胞癌变。l 基因克隆是指把一个生物体的遗传信息（基因片段）转入另一个生物体内进行无性繁殖，得到一群完全相同的基因片段，又称DNA克隆。l 抑癌基因是指存在于正常细胞内的一大类可抑制细胞生长并具有潜在抑癌作用的基因，当这类基因在发生突变、缺失或失活时可引起细胞恶性转化而导致肿瘤发生。l 基因诊断是以DNA和RNA为诊断材料，通过检查基因的存在、缺陷或表达异常，对人体状态和疾病作出诊断的方法和过程。l 管家基因是在生命过程都是必需的，是在一个生物个体的几乎所有细胞中持续表达的基因，它较少受环境因素的影响，其表达方式为组成性基因表达。l klenow片段亦称DNA聚合酶1大片段，为DNA聚合酶I经枯草杆菌蛋白酶裂解后产生的大片段，它除了保留53聚合酶活性及35外切酶活性外，失去了53外切酶活性，它具有的35外切酶活性能保证DNA复制的准确性，把DNA合成过程中错误配对的碱基去除，再把正确的核苷酸接上去。l 核蛋白体系tRNA与蛋白质结合生成的一种复合体，是蛋白质生物合成的场所。l 限制性内切核酸酶能识别DNA的特异序列，并在识别位点或其附近切割双链DNA的一类内切核酸酶，是基因克隆中最重要的工具酶，通常所说的限制酶是指2型酶。主要从原核细胞中提取，大多数限制性内切酶是错位切割双链DNA，产生粘性末端，部分酶则沿对称轴切割DNA而产生平端。l Tm值DNA变性是在一个相当窄的温度范围内完成的，在这一范围内，紫外吸收值达到最大值的50%时的温度称为DNA的解链温度，又称融解温度（Tm），其大小与G+C含量成正比。或:双链DNA变性一半所需要的温度叫DNA的融解温度. l DNA的甲基化是指DNA的一级结构中，有一些碱基可以通过加上一个甲基而被修饰，其作用是对自身DNA产生保护作用。l 原位杂交是核酸保持在细胞或组织切片中，经适当方法处理细胞或组织后，将标记的核酸探针与细胞或组织中的核酸进行杂交的方法。l DNA微陈列系直接将大量DNA探针以显微打印的方式有序地固化于支持物表面所组成的微陈列（基因芯片）称为DNA微陈列。. l 顺序作用元件是指那些与结构基因表达调控相关，能被基因调控蛋白异性识别和结合的DNA序列,抱括启动子.上游启动子元件.增强子.加尾信号和一些反应元件。l 转位因子是指能够在一个DNA分子内或2个DNA分子之间移动的DNA片段。l 基因治疗-是指通过在特定靶细胞中表达该细胞本来不表达的基因，或采用特定方式关闭和抑制异常表达基因，达到治疗疾病目的的治疗方法。综合内容DNA的结构、性质及特点一级结构是指DNA分子中核苷酸的排列顺序，二级结构是指两条DNA单链形成的双螺旋结构、三股螺旋结构和四股螺旋结构；三级结构是指双链DNA进一步扭曲盘旋形成的超螺旋结构。DNA一级结构的基本特点：4种脱氧核糖核苷酸以3，5磷酸二酯键相连，形成长链，链中的脱氧核糖和磷酸都是相同的。组成DNA的碱基有腺嘌呤（A）、鸟嘌呤（G）、胞嘧啶（C）和胸腺嘧啶（T）。DNA是由两条单链结合在一起形成的双链分子，两条单链都是由A、T、G、C以千变万化的排列组合而形成的。大多数生物的遗传信息都是储存在DNA分子中。DNA分子主要携带两类遗传信息，即有功能活性的DNA序列所携带的信息和调控信息。DNA二级结构是指DNA的双螺旋结构，其特点为：脱氧核糖与磷酸交替排列构成了DNA主链；两条脱氧核苷酸链是反向平行排列，一条是53方向，另一条为35方向；以右手方向盘绕成双螺旋构型；A配T，G配C。生物体的闭环DNA都以超螺旋形式存在，如细菌质粒、一些病毒、线粒体的DNA等。RNA的结构、功能、特点由4种基本的核苷酸以3，5-磷酸二酯键连接而成的长链，碱基中没有T，而为尿嘧啶（U）。分为mRNA（信使RNA），tRNA（转RNA，转运氨基酸）和核蛋白体RNA（rRNA）。mRNA结构特点：不稳定、代谢活跃，更新迅速，寿命短。原核生物mRNA具有操纵子结构，主要是多顺反子，mRNA5端无帽子结构，3端一般无多聚A尾巴，没有修饰碱基；真核mRNA5端有帽子结构、3端大多有多聚腺苷酸尾巴、分子中可能有修饰碱基，主要有甲基化、有编码区和非编码区。tRNA的结构特点及作用：作用：在蛋白质合成过程转运氨基酸，参与蛋白质的翻译。一级结构含有稀有碱基如DHU，3端为3个同样的核苷酸序列（CCA）序列，此序列是tRNA结合和转运安基酸而生成氨酰tRNA所必需的。5端为G、具有TC；二级结构为三叶草形，三级结构为倒L形； C、rRNA即核蛋白体RNA：为细胞内含量最丰富的RNA，约占细胞总RNA的80%以上,参与组成核蛋白体，作为蛋白质生物合成的场所。原核生物核糖体的沉降系数为70S，由50S和30S两个大小亚基组成，30S小亚基含16SrRNA和21种蛋白质,50S大亚基含23S和5SrRNA以及34种蛋白质；真核生物细胞核糖体的沉降系数为80S，由大小亚基组成，40S小亚基含18SrRNA及30多种蛋白质，60S大亚基含3种rRNA(28S.5.8S.5S)以及大约45种蛋白质。hnRNA即核内不均-RNA，为真核生物转录生成的mRNA前体。SnRNA即小分子核内RNA，不单独存在，常与多种特异的蛋白质结合在一起，形成小分子核内核蛋白颗粒，在mRNA的剪接中起重要作用。反义RNA，又称调节RNA，主要封闭RNA。参与蛋白质合成的氨基酸在特异的氨基酰tRNA合成酶催化下，与其相应的tRNA结合成氨基酰tRNA。真核生物起始tRNA结合的氨基酸为蛋氨酸，结合形成Met-tRNAimet，翻译起始时首先与40S核糖体小亚基结合形成复合物。原核生物的起始氨基酸为甲酰化蛋氨酸，结合形成fMet-tRNAffmet。导致DNA变性的常用方法有热变性、碱变性和化学试剂变性。DNA变性的结果：粘性降低，密度增加，A260紫外吸收值增加。蛋白质的结构、功能特点蛋白质又称为“功能分子”，根据功能分为结构蛋白、活性蛋白和信息蛋白。蛋白质的一级结构是指蛋白质多肽链中氨基酸排列的顺序。蛋白质一级结构发生改变，可以使蛋白质的功能发生改变，严重时可导致疾病的发生。因基因突变而导致的蛋白质一级结构改变后表现出生理功能的异常，使机体出现病态现象，称为分子病。蛋白质的二级结构单元（形式）有a-螺旋、-折叠、-转角、无规则卷曲。一级结构的化学键是肽键及二硫键；二级结构主要化学键为氢键；三级结构的主要靠疏水作用、离子键、氢键和范得华力等；四级结构的结合力主要是疏水作用、氢键和离子键。端粒的主要特点和功能：特点为：位于真核生物染色体末端、端粒酶催化端粒DNA延长、在决定细胞寿命中起重要作用、含短的高度重复序列。其主要功能有：保护线性DNA的完整复制、保护染色体末端、决定细胞的寿命。DNA聚合酶（DNApol）作用是催化DNA合成，其活性需要Mg2+的存在。大肠杆菌DNA聚合酶有I-II、II3种（即原核生物DNA聚合酶）。DNApolI的功能有：a、聚合作用，使DNA链沿53方向延伸，b、35外切酶活性，即能从DNA链3端开始沿35进行水解反应，产生5单核苷酸，纠正复制过程中的错误，保证DNA复制的正确性，因而具有校对功能；C、53外切酶活性，参与RNA生物的切除、填补冈崎片段间的空隙以及DNA损伤的修复。DNApolII：具有53DNA聚合酶活性及35外切核酸酶活性，可能参与DNA损伤的应急状态修复。DNApolII：亚基具有催化合成DNA的功能；亚基具有35外切酶活性及编辑和校对功能，则为装配所必需，是原核生物复制延长中真正起催化作用的酶。DNA聚合酶的共同性质是：需要DNA模板；RNA或DNA作为引物；ATP与Mg2+的参与；以dNTP作底物；DNA合成的方向是53。反应特点：新生链的延伸方向为53；半保留方式合成子代DNA双链；反应需要DNA引物。共同具有的酶活性：53聚合酶活性；35核酸外切酶活性。RNA聚合酶RNA聚合酶也称依赖DNA的RNA聚合酶，能以DNA为模板，四种核苷三磷酸为底物，按照碱基配对原则，从53方向延长RNA链。原核生物的RNA聚合酶只有一种，是由四种亚基2组成的五聚体蛋白质，称为全酶。去掉亚基后，剩下的2称为核心酶。活细胞的转录起始，需要全酶；而核心酶负责催化RNA链的延伸。 真核生物RNA聚合酶有三种，即RNA聚合酶I、II、III。RNA聚合酶I定位在核仁，主要转录5.8S、18S、28S-rRNA基因；酶II定位在核浆，主要转录编码蛋白质的基因，即主要转录产生mRNA；酶III定位在核浆，主要转录tRNA和5S-rRNA基因。RNA聚合酶催化聚合反应时需要有Mg2+或Mn2+的存在，无35外切酶海性，无校对功能。密码子分为起始密码和终止密码，起始密码为AUG，终止密码为UAA、UAG和UGA，共有64种不同的密码。可作为原核生物起始密码的是：AUG.GUG.UUG。遗传密码具有以下特点：连续性：两个密码子之间没有任何核苷酸加以分隔，即密码是无标点的。B、方向性：mRNA中密码子的排列是有方向性的，即起始密码子总是位于编码区5末端，而终止密码子位于3末端。每个密码子的三个核苷酸也是53方向阅读，不能倒读。C、简并性：是指遗传密码中除色氨酸和甲硫氨酸仅有一个密码子外，其余氨基酸有26个密码子为其编码。D、通用性：从最简单的病毒、原核生物、直至人类，都使用同一套遗传密码。E、摆动性：翻译过程中，氨基酸的正确加入，要靠mRNA上的密码子与tRNA上的反密码子相辩认。密码子与反密码子配对辩认时，有时不完全遵守碱基互补规律，即使不严格互补也能辩认配对，这种现象称为摆动。转录的过程及特点转录是以DNA为模板，以4种NTP为原料，依碱基配对规律，在DNA指导的RNA聚合酶催化下合成RNA的过程，其过程包括：起始、延长和终止三个阶段。转录的特点：A、对于一个基因组来说，转录只发生在一部分基因，而且每个基因的转录都受到相对独立的控制。B、转录是不对称的。C、转录时不需要引物，而且RNA链的合成是连续的。D、转录的单向性，即RNA生物合成时，只能向一个方向进行聚合，所依赖的模板DNA链的方向为35，而RNA链的合成方向为53。E、有特定的起始和终止位点。参与转录终止的因素为因子或转录产物的3端发夹结构,转录终止的修饰点:AATAAA+GT序列。原核生物DNA复制的过程及特点复制过程包括：起始（复制起始位点识别、解螺旋酶解开DNA双链，引发体合成RNA引物）延伸（DNA聚合酶催化聚合反应，连续合成前导链，不连续合成随从链）。终止（RNA引物去除、冈崎片段连接、在特殊的终止结构区域停止）。复制的共同特点为：半保留复制和半不连续复制、聚合反应都需要模板、底物、DNA聚合酶及其它酶和蛋白质。真核生物染色体DNA复制的特点：（原核相反）复制起始点为多个；复制叉移动速度慢；复制方向大多数为双向；RNA引物短；冈崎片段短，不可连续复制翻译的主要过程及特点起始：形成翻译起始复合物延长：指每加一个氨基酸经过进位、成肽和转位，使肽链从N端向C端延长。终止（当mRNA分子中的终止密码子出现后，多肽链合成停止，肽链从肽酰-tRNA中释出，mRNA、核蛋白体等分离）。蛋白制合成是一个耗能过程，每生成一个肽键，要消耗2个高能磷酸键，氨基酸活化要消耗2个高能磷酸键，整个过程可能多于4个高能磷酸键。14、原核生物mRNA的加工：转录产物mRNA分子不需加工。tRNA结构基因的初级转录产物需要加工，才能成为具有生物功能的成熟分子。tRNA前体的加工包括剪切作用（切除多余核苷酸）、添加和修复3端CCA序列，某些碱基的化学修饰（成熟tRNA分子中有稀有碱基）。翻译后的加工修饰：加工包括：A、去掉N-甲酰基、N-蛋氨酸或N端序列。B、个别氨基酸的修饰（羟化、磷酸化形成-S-S-等）。C、多蛋白水解修饰，D、分子伴侣，蛋白质二硫键异构酶，肽-脯氨酰顺反异构酶辅助折叠成空间构象。E、亚基聚合，F、辅基的结合（糖基化等）。其中A、B、C属一级结构修饰，D、E、F属空间结构修饰。多肽链形成后，氨基酸残基可进行多种共价修饰，包括；磷酸化，羟基化，ADP-核糖基化，形成胱氨酸及乙酰化。翻译过程涉及多种分子之间的相互作用，可以归纳为：RNA-蛋白质相互作用，蛋白质-蛋白质相互作用及RNA-RNA相互作用。参与翻译终止的蛋白质因子包括：RF、PR、IF。广义的核蛋白体循环包括：翻译起始，进位，成肽，转位和翻译终止。真核生物mRNA的加工包括：5端加帽（由加帽酶催化5端加入7-甲苷乌苷酸，形成帽子结构m7GpppmNP-）。 3端加入Poly(A)尾（A、组蛋白的成熟mRNA无需加polyA尾；B、加尾信号包括AAUAAA和富含GU的序列；C、加尾不需模板；D剪切过程需要多种蛋白质因子的辅助）。mRNA前体的剪接（剪接加工以除去内含子序列，并将外显子序列连接成为成熟的有功能的mRNA分子。内含子两端的结构通常是5-GUAG-3。选择性剪接的作用机制包括；A使用不同的剪接位点，B选择使用外显子，C、反式剪接，D、使用不同的启动子，E、使用不同的多腺苷酸化位点）。RNA的编辑（发生于转录后水平，改编mRNA序列，CU或AG，增加遗传信息容量）。基因表达是指生物基因组中结构基因所携带的遗传信息经过转录、翻译等一系列过程，合成特定的蛋白质，进而发挥特定的生物学功能和生物学效应的全过程。但并非所有基因表达过程都产生蛋白质，tRNA、rRNA编码基因转录生成RNA的过程也属于基因表达。基因表达受到多级水平的调控，具有阶段特异性（时间特异性）和组织特异性（空间特异性）。基因表达分为几个阶段：基因活化、转录、转录后加工、翻译、翻译后加工等、产物是RNA和有功能的蛋白质。原核生物基因表达调控的环节，主要在转录水平，其次是翻译水平。原核生物基因多以操纵子的形式存在，转录水平的调控涉及到启动子、因子（能与RNA聚合酶结合）、阻遏蛋白(负调控)、正调控蛋白、倒位蛋白、RNA聚合酶抑制物、衰减子等多种因素。而翻译水平的调控涉及到SD序列（位于AUG前）、mRNA的稳定性（不稳定，其5端和3端的发夹结构可保护其不被酶水解，mRNA的5端与核糖体结合，可明显提高其稳定性）、翻译产物及小分子RNA的调控作用。真核生物基因表达的调控环节较多，在DNA水平可通过染色体丢失，基因扩增、基因重排、DNA甲基化以及染色体结构改变影响基因表达，在转录水平则主要通过反式作用因子的作用调控转录因子与TATA盒的结合、RNA聚合酶与转录因子-DNA复合物的结合及转录起始复合物的形成；在转录后水平主要通过RNA修饰、剪接及mRNA运输的控制来影响基因表达；影响翻译水平的因素有影响起始翻译的阻遏蛋白、5AUG、5端非编码区的长度、mRNA的稳定性调节及小分子RNA等。真核基因调控中最重要的环节是基因转录，真核生物基因表达需要转录因子、启动子、沉默子和增强子。反式作用因子：指能直接或间接辨认和结合转录上游区段DNA的蛋白质，其主要特点包括三个功能结构域（DNA识别结合域、转录活性域、结合其它蛋白的结合域）、能识别并结合上游调控区的顺式作用元件、对基因表达有正性和负性调控作用。其活性调节方式：表达式调节，共价修饰，配体结合及蛋白质-蛋白质相互作用。作用方式:成环、扭曲、滑动、Oozing。DNA结构域包括：锌指、螺旋转角螺旋、亮氨酸拉链和螺旋环螺旋。转录激活域富含：酸性氨基酸、脯氨酸和谷氨酰胺。参与DNA复制（合成）的物质包括：模板（解开成单链的DNA母链）。引物（提供3OH未端使dNTP可以依次聚合）。底物（dATP，dGTP，dCTP和dTTP）。聚合酶（依赖DNA的DNA聚合酶（DNApol）。其它的酶和蛋白质因子。DNA复制的基本过程包括：DNA双链解开，RNA引物的合成，DNA链的延长，切除引物，填补缺口，连接相邻DNA片段，切除和修复错配碱基。结构基因突变的类型包括点突变、缺失、插入和倒位四类，遗传密码的改变分为错义突变、无义突变、同义突变和移码突变。癌基因恶性激活的机制包括：原癌基因点突变，原癌基因获得外源启动子而激活，原癌基因因甲基化程度降低而激活，基因易位或重排使原癌基因激活。逆转录病毒载体是基因治疗中最常用的载体。造血肝细胞是基因治疗中最重要的靶细胞，禁用生殖细胞。基因转移技术(基因治疗技术)包括生物学方法和非生物学方法:生物学方法有:逆转录病毒载体.腺病毒载体.腺相关病毒载体.单纯疱疹病毒载体;非生物学方法有：脂质体、直接注射、受体介导基因转移技术、DNA磷酸钙沉淀法、电穿孔法、显微注射、颗粒轰击。DNA甲基化的一个特点是它们经过细胞许多代分裂之后仍保持稳定。在真核生物DNA中，几乎所有甲基化均发生于二核苷酸序列5mCG3上。一个基因所包括的序列有：编码蛋白质肽链或RNA的核酸序列、保证转录所必需的调控序列、位于编码区5端上游的非编码序列、内含子、位于编码区3端下游的非编码序列。启动子是RNA聚合酶特异性识别和结合的DNA序列,启动子具有方向性，真核生物的启动子必须与转录因子结合后，才能被DNA聚合酶识别和结合，真核生物的启动子元件是TATA盖,TATA盒的核心序列是TATA(A/T)A(A/T)，位于转录起始点上游25bp处,启动子决定转录方向.模板链及转录效率。上游启动子元件包括：CAAT盒，CACA盒和GC盒。逆转录：是指以RNA为模板，利用宿主细胞中4种dNTP为原料，在引物的3端以53方向合成与RNA互补的DNA链的过程，此过程与中心法则方向相反，故称为逆转录。原癌基因产物的类型及细胞定位生长因子及其类似物，由细胞分泌，如C-sis家族 （sis编码血小板源生长因子，表达产物与PDGF链结构同源）。跨膜生长因子受体型的酪氨酸蛋白激酶，如erb-B,表皮细胞生长因子（EGF）受体；fims,巨噬细胞集落刺激因子受体；定位于质膜。细胞内信号传导分子，定位于胞夜,包括A、低分子量G蛋白，如H-ras等基因表达产物；B、胞内蛋白激酶（包括与膜结合的蛋白酪氨酸激酶和胞浆丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶），如src、abl。核内转录因子：如myc、fos等，定位于细胞核内。胞浆调节蛋白，如crk的产物是存在于胞浆中的调节蛋白，定位于胞浆。可溶性蛋白酪氨酸激酶受体和非蛋白激酶受。细胞周期的主要调控点细胞周期的运行受多种因素所调控，有2个主要调控点，亦称为检测点。 G1/S期检测点：在酵母中称起点，在哺乳细胞中称限制点,是控制细胞进入S期检测点（G1期检测点）,cyclinB与CDK4和CDK6结合，cyclinE与CDK2，CDK3结合，通过磷酸化使它们活化。cyclin-CDK复合物可使Rb蛋白磷酸化，从而释放转录因子E2F，促进DNA复制相关基因的表达。CDK2也可和cyclinA、cyclinA1结合，促进早S期DNA合成的起始。 G2/M期检测点：是控制细胞进入M期检测点（G2期检测点），促有丝分裂因子（MPF）由cyclinB和CDK1组成，是启动有丝分裂的关键因子。细胞何时进入M期取决于Cdc2的磷酸化状态。真核细胞转染的基本方法：磷酸钙沉淀法。电穿孔法。脂质体介导的基因导入法。DEAE-葡聚糖法。显微注射法。DNA损伤的主要类型碱基和糖基破坏错配DNA链断裂：电离辐射致DNA损伤的主要形式DNA变联。上述DNA损伤可导致DNA模板发生碱基的置换、插入、缺失、链的断裂，并可影响到染色体的高级结构。DNA链中一种嘌呤被另一种嘌呤取代，或嘧啶被另一种嘧啶所取代，称为转换；嘌呤被嘧呤取代，或反之，称为颠换；转换和颠换在DNA复制时可引起碱基错配，导致基因突变；碱基的插入和缺失可引起移码突变。DNA修复机制的主要类型光修复；切除修复；重组修复；SOS修复；错配修复。 基因文库筛选的主要方法及原理根据抗药性标志筛选：对于带有某种抗药性标志基因，只有转化成功的受体菌才可能在含该抗生素的培养基中生存并形成菌落；而没有转化成功的受体菌，不能在培养基中生长，以此可选择阳性菌。(2)根据菌落的呈色反应筛选（互补、蓝-白筛选）：根椐菌落的颜色并结合插入片段的序列测定筛选。(3)营养缺陷型标记法:(4)核酸分子杂交法：即采用与目的基因部分互补的DNA片段作为探针，与含有重组体的细菌菌落进行杂交，以确定重组体中带目的基因。包括原位杂交和southern印迹杂交。（5）遗传互补法：载体上的营养代谢标记可以对宿主细胞的营养代谢缺陷进行互补，以此作为筛选重组体的标记。（6）免疫学方法：如果克隆基因的产物是已知的，并且在菌落或噬菌斑中表达，因而可以用相应的抗血清或单克隆抗体，通过放射免疫、化学发光或显色反应进行筛选。PCR的主要步骤及引物设计的基本要求PCR的主要步骤：PCR又称聚合酶链式反应，是在体外进行的DNA复制反应过程。其基本过程包括：A、双链DNA模板加热变性成单链(变性),温度95度左右。B、在低温下引物与单链DNA互补配对(退火),85-90度。C、延伸：在四种DNTP底物及Mg2+存在条件下，TaqDNA聚合酶在最适作用温度（7075）下，根据碱基互补配对原则，从特异结合到DNA模板上的引物3-OH端开始掺入单核苷酸，合成新的DNA分子。引物设计的基本要求：A、引物长度一般为1530个核苷酸。B、引物中的碱基组成尽可能随机分布，避免出现嘌呤、嘧啶碱基堆积现象，尤其在3端避免连续3个G或C。C、引物自身不应存在互补序列以避免折叠成发夹结构，引物自身存在的连续互补序列，一般不超过3bp。D、两个引物之间不应存在互补序列，尤其应避免3端的互补重叠。E、引物与非特异扩增区的序列的同源性不要超过70%，引物3末端连续8个碱基在待扩增区以外不能有完全互补序列。F、引物与模板结合时，引物的5端可以修饰。乳糖操纵子的正、负调节机制乳糖操纵子包含3个结构基因Z.Y.A（编码-半乳糖苷酶，-半乳糖苷通透酶和转乙酰基酶）、3个调控元件（启动子、操纵基因和CAP结合位点）和1个调节基因（编码阻遏蛋白）。乳糖操纵子的转录起始是由CAP和阻遏蛋白两种调控因子来调控的。（1）阻遏蛋白的负调控：无乳糖时，阻遏蛋白结合操纵基因，妨碍RNA聚合酶结合启动子，从而抑制结构基因转录。有乳糖时，生成半乳糖（诱导剂）结合阻遏蛋白，使阻遏蛋白构象改变，变构的阻遏蛋白不能与操纵序列结合，阻遏机制解除，结构基因可以转录，基因得以表达。cAMP-CAP复合物的正调控:无葡萄糖时，cAMP浓度高，形成的cAMP-CAP复合物结合于CAP结合位点，增强启动子转录活性，促进下游基因得以表达；有葡萄糖时，cAMP浓度低，cAMP-CAP复合物形成受阻，影响转录活性。正、负调控机制相辅相成：cAMP-CAP复合物是转录必需的，同时阻遏蛋白进一步控制转录启动。综上，乳糖操纵子最强的表达条件是有乳糖而无葡萄糖。双脱氧末端终止法DNA测序的主要步骤：双脱氧末端终止法是以单链或双链DNA为模板，采用DNA引物引导新生DNA的合成，又称为引物合成法，或酶促引物合成法。其主要步骤为：制备单链模板。模板与测序引物结合。掺入法标记反应。延伸-终止反应。 变性胶电泳。放射自显影。阅读测序结果。常用的分子生物学技术的原理、过程及特点核酸分子杂交技术：基本原理是：具有互补序列的两条单链核酸分子在一定条件下碱基互补配对结合，重新形成双链；在这一过程中，核酸分子经历了变性和复性的变化，以及复性过程中各分子间键的形成和断裂等。特点：直接检测血清中病毒基因组，无须扩增，灵敏度较PCR低。在杂交体系中已知的核酸序列称作探针。聚合酶链反应（PCR）：PCR的原理是根据待测DNA片段两端的核苷酸序列，设计并人工合成两个分别与DNA片段两端互补的寡聚核苷酸引物，在有过量的引物、过量的底物（4种dNTP）、DNA聚合酶以及模板（待扩增片段的DNA分子）的反应体系中，经过高温变性（使DNA链解开）、低温退火（使引物与模板结合）和适温延伸（新合成的DNA片段）三个阶段的循环周期，对DNA分子进行扩增。特点:极强的扩增能力,度高灵敏性,高度特异性，只需微量模板,只需数小时,扩增产物量大,变性.复性.延伸三个步聚循环进行,操作简便，适用广泛，但可出现假阳性. DNA序列测定：DNA序列测定是在高分辨率变性聚丙烯酰胺凝胶电泳技术的基础上建立起来的，包括Sanger双脱氧链末端终止法和化学降解法。Sanger法的基本原理是：双脱氧核苷酸（ddNTP）在DNA合成过程中代替相应的脱氧核苷酸（dNTP）作为底物，不能形成3，5-磷酸二酯键而导致链延伸终止。化学降解法：是采用化学试剂处理末端放射性标记的DNA单链片段，造成碱基特异性切割，由此产生一组具有不同长度的DNA链的反应混合物，经凝胶电泳按分子大小分离和放射自显影，直接读出待测DNA的核苷酸顺序。DNA芯片技术：DNA芯片技术是一种大规模集成的固相核酸分子杂交，以大量已知碱基序列的寡核苷酸片段为探针，检测样品中哪些核酸序列与其互补，然后通过定性、定量分析得出待测样品的基因序列及表达的信息。DNA芯片的主要技术流程包括：芯片的设计与制备、靶基因的标记（常用荧光色素.生物素或放射性核素标记dNTP）、芯片杂交与杂交信号检测。特点：高通量.鉴别诊断。酶：DNA聚合酶。所需探针：合成的寡核苷酸片段，cDNA，已克隆的基因片段，双链或单链DNA或RNA，肽核酸。基因克隆技术（重组DNA技术）：基因克隆是指某种目的基因的扩增与分离过程，具体是从基因组或DNA大片段中分离并获得某一特定的基因或DNA片段，再通过DNA序列扩增形成由众多拷贝组成的DNA拷贝群体的过程。其基本过程为：A-目的基因的制备；栽体的选择与制备；B-DNA分子的体外连接；C-将外源DNA导入宿主细胞；D-目的基因的筛选与鉴定；E-DNA重组体的扩增与表达原核生物与真核生物转录调控的特点比较：两者均涉及RNA聚合酶和转录调控序列（启动子等）的相互作用。真核需要多种转录因子辅助、原核不需要。真核以正调控为主，原核以负调控为主。真核3种RNA聚合酶负责不同种类基因的转录，原核只有1种RNA聚合酶。原核生物和真核生基因表达调控特点的比较。相同点：转录起始是基因表达调控的关键环节不同点：A、原核基因表达调控主要包括转录和翻译水平；真核基因表达调控主要包括染色质活化、转录、转录后加工、翻译、翻译后加工多个层次。B、原核基因表达调控主要为负调节，真核主要为正调节。C、原核转录起始不需要转录因子，RNA聚合酶直接结合启动子，由因子决定基因表达的特异性；真核转录起始需要基础、特异两类转录因子，依赖DNA-蛋白质、蛋白质-蛋白质相互作用，调控转录激活。D、原核基因表达调控主要采用操纵子模型，转录出多顺反子RNA，实现协调调节；真核基因转录产物为单顺反子RNA，功能相关蛋白质的协调表达机制更为复杂。质粒的特征：原核细胞中染色体外的共价闭合的环状DNA分子。能独立于细胞的染色体而进行复制，并依赖于宿主细胞。在同一宿主中具有不相容性，即具有相同复制起始位点和分配区的两种质粒不能共存于一个宿主菌。具有严格的遗传控制系统（复制调控系统，分配系统，细胞分裂控制系统 ，位点特异重组系统）。其所携带的遗传信息能赋予宿主细胞特定的遗传性状。是DNA重组技术中所使用的主要载体。作为克隆载体的质粒具有的特点：分子量较小，能在细菌内稳定存在，有较高的拷贝数；具有一个以上的遗传标志；具有多个限制酶的单一切点，称为多克隆位点，便于外源基因的插入。真核生物基因组结构与功能的特点。每一种真核生物都有一定的染色体数目， 体细胞一般为双倍体。真核基因组远远大于原核生物的基因组，具有许多复制起点。真核基因组由一个结构基因与相关的调控区组成，转录产物为单顺反子，即一分子mRNA只能翻译一种蛋白质。真核生物分子含有大量重复顺序。真核生物基因组内非编码的顺序占90%以上。真核基因是断裂基因。功能相关的基因构成各种基因家族。真核生物基因组中也存在一些可移动的遗传因素。蛋白质生物合成后的靶向输送过程及特点：蛋白质合成后，定向地被输送到最终发挥生物学功能的部位称为靶向输送。靶向输送的蛋白质的N端往往有一些特异的氨基酸序列，称为信号序列，是决定蛋白质靶向输送特性的重要元件，通过信号序列引导蛋白质从胞浆进入内质网.线粒体.叶绿体和核内，靶向不同的蛋白质各有特异的信号序列。分泌型蛋白合成后进入内质网，经加工，包装成分泌小泡，再转移.融合到靶部位或分泌出细胞，其靶向输送主要靠信号肽与胞浆中的信号肽识别粒子（SRP）识别并特异结合，然后再通过SRP与膜上的对接蛋白（DP）识别并结合后，将所携带的蛋白质送出细胞；线粒体蛋白的靶向输送靠导肽与多种蛋白复合体介导进入基质和膜间腔，然后自发的或在分子伴侣HSP70帮助下折叠形成有功能的蛋白质；而细胞核蛋白的靶向输送则通过核定位信号与核输入受体结合形成核蛋白-受体复合物，被导出核孔，再与核孔复合体结合后进入细胞核。核酸分子杂交的基本方法包括：Southern印迹杂交（鉴别DNA靶分子的杂交、待测核酸是DNA片段）、Northern印迹杂交（鉴别RNA靶分子、待测核酸是RNA）、斑点杂交、原位杂交和液相杂交。DNA复制与转录的异同。相同点：模板是DNA遵守碱基互补规律新链合成方向为53催化核苷酸以磷酸二酯链连接合成部位在细胞核。不同点：复制的原材料是dNTP，转录的原料是NTP复制的主要酶类是DNA聚合酶，转录酶是RNA聚合酶复制需要RNA引物，转录不需要引物复制的产物是双链DNA，转录的产物是单链RNA复制的模板是DNA双链（半保留复制），转录的模板是DNA单链（不对称转录）复制的功能是传递遗传信息给子代 ,转录是表达信息所需步聚. 双脱氧核苷酸末端终止法DNA序列测定中所需要的顺序试剂：M13载体、dNTP、DNA聚合酶I的klenow片段，逆转录酶，TqaDNA聚合酶（耐热DNA聚合酶），经过修饰的T7噬菌菌体DNA聚合酶，测序酶2.0版，双脱氧核苷三磷酸（即2,3-ddNTP）、dNTP类似物，放射性标记的a-32PdNTP。PCR体系的主要成分。引物、TaqDNA聚合酶、dNTP、模板核酸、缓冲液。DNA聚合酶I的作用特点：模板为DNA，底物为4种脱氧核苷酸（dATP、dCTP、dGTP、dTTP），Mg2+参与，DNA合成方向为53，具有DNA聚合酶活性，35及53核酸外切酶活性，其53核酸外切酶活性，用于缺口平移法标记DNA探针。基因治疗的方法有两种：体内直接转基因，称为体内法；细胞介导的基因治疗，称为回体法。基因灭活技术有：反义核酸技术，核酶技术，三链技术，干扰RNA技术。人的DNA端粒含有TTAGGG重复序列。49.信号肽的特点:能与细胞质中的信号识别颗粒结合,SRP受体是蛋白质进入内质网所必需的,N端一小段富含蔬水氨基酸的序列,翻译的同时引导新生多肽链穿过内质网.基因组文库采用限制酶将基因组DNA切成片段，每一DNA片段都与一个载体分子拼接成重组DNA，将全部DNA分子都引入宿主细胞并扩增所得到的分子克隆混合体叫基因组文库。50.基因重组是指DNA之间的共价连接.在分子克隆中的克隆是指无性繁殖DNA。基因工程中目的基因的来源可以是:化学合成.PCR合成.细胞DNA.组织DNA.cDNA文库。12