（高清正版）DB2308_T 124-2022稻瘟病菌生理小种鉴定技术规范.pdf

ICS 65.020B 05黑 龙 江 省 佳 木 斯 市 地 方 标 准DB2308DB2308/T 1242022稻瘟病菌生理小种鉴定技术规范2023-01-05 实施2022-12-06 发布佳木斯市市场监督管理局 发 布前 言 本文件按照 GB/T 1.1-2020标准化工作导则 第 1 部分：标准化文件的结构和起草规则的规定起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利，本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本标准的附录 A 是资料性附录。本文件由佳木斯市农业农村局提出并归口。本文件由佳木斯市市场监督管理局批准发布。本文件起草单位：黑龙江省农业科学院水稻研究所 本文件主要起草人：宋成艳、王桂玲、刘乃生、陆文静、周雪松、韩笑、马文东。本文件为 2022 年首次发布。稻瘟病菌生理小种鉴定技术规范 1 适用范围 本标准规定了稻瘟病菌（Magnaporthe oryzae）生理小种鉴定的术语、鉴别寄主选择、育苗、病菌采样、分离、培养、接种、保湿培养、调查记载方法及抗性评价技术措施。本文件适用于黑龙江省佳木斯市稻瘟病菌生理小种鉴定。2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。NY/T 2646 水稻品种试验稻瘟病抗性鉴定与评价技术规程 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。3.1 对照品种 control variety 未检测出对病菌具有抗性基因，因而对病菌各个菌株均呈毒性反应的鉴别寄主，用以检测菌株活力或环境条件是否适宜、操作是否符合规范。4 材料和用具 4.1 常用仪器用具 常用仪器及用具包括：剪刀、超净工作台、无菌载玻片、试管、接种针、9 cm 培养皿、冰箱、生物显微镜、培养箱、高压灭菌器、干燥灭菌器、医用白瓷盘、滤纸、移液器、变色硅胶、干燥器、医用纱布、保湿隔离罩、旱田土、壮秧剂、喉头喷雾器。4.2 专用器具 电动吸引器：市场售卖的电动吸引器接入反向电源变成向外喷雾。4.3 试验场地及设施 选择水泥地面场所，有水源和电源，遮阳布，防雀、鼠网。4.4 试剂及培养基 试剂及培养基包括：75%酒精、琼脂粉、酵母培养基（淀粉 10 g、酵母粉 2 g、琼脂粉20 g、水 1000 mL）；高粱粒培养基（高粱粒煮到中间有小硬心时，高温灭菌 40 min）。4.5 鉴别寄主 特特普、珍龙13、四丰43、合江18、东农363、关东51、丽江新团黑谷7个全国稻瘟病菌生理小种鉴别寄主。5 鉴定方法 5.1 病菌标样采集与保存 采集主要稻区主栽品种的节瘟或者穗颈瘟，晾干后放在有变色硅胶的干燥器内于 4 保存备用。5.2 病菌产孢 将采集的病菌标样，用无菌水洗净后放在 26 培养箱内，保湿培养 12 h 即可产生大量分生孢子。5.3 病菌分离 悬挂震落法分离单孢菌株。5.3.1 孢子震落 在无菌条件下进行，先在倒有琼脂培养基的培养皿的内盖上抹上凡士林，将培养好带有霉层的病节粘在凡士林上，要求病节霉层面朝上（不与凡士林接触），将粘有病节的培养皿盖子盖到培养皿上，用手轻轻敲打培养皿盖，震落一次后再换位置震落，使孢子均匀地散落在培养基表面，敲打完后将培养皿反转放置。5.3.2 单孢镜检 镜检时将培养皿反转放在显微镜的载物台上，在 10 倍10 倍的显微镜下查找稻瘟病菌孢子，同时在其附近无其它孢子和杂菌存在时，用蘸水钢笔在单孢处轻轻点一墨水小圆点，以小圆点为中心画个小圆圈，将点过的小圆点用酒精棉擦掉，再进一步检查所划圆圈内是否是单个孢子，确定无其它孢子后，再用蘸水钢笔在单孢处轻轻点一墨水小圆点，在无菌条件下将所画圆圈内的单孢挑入酵母淀粉培养基上。5.4 病菌培养 将挑取的单孢放入酵母淀粉培养基上，在培养皿上注明菌株编号、分离日期后，放入26 培养箱内黑暗培养。5.5 接种体准备 5.5.1 菌丝培养 将挑取的单孢放入酵母淀粉培养基上，在培养皿里培养 5 d7 d，再转入斜面培养基上培养 7 d。5.5.2 孢子培养 将斜面培养基上培养的各单孢菌株分别接种到高粱粒培养基上，在 26 培箱内黑暗培养 14 d 左右备用。5.5.3 孢子悬浮液制备 将高粱粒培养基培养的各单孢菌株分别用无菌水洗后再放在医用白瓷盘内培养 48 h 促其产孢，然后用无菌水洗下孢子，用 2 层医用纱布过滤配制成 2105 个/mL 的孢子悬浮液备用。孢子液的浓度符合 NY/T 2646 4.1.1 的规定。5.6 鉴别寄主的培育 5.6.1 育苗土 将过筛的旱田土拌入水稻壮秧剂，混均后装入塑料方盆中，铺平压实后浇水划区。5.6.2 种子消毒及催芽 将鉴别品种种子严格粒选，用清水浸种 24 h 后放入培养箱中催芽 48 h。5.6.3 播种 将催芽的种子播入事先准备好的白塑料方盆内，每个品种播 1 穴，每穴播 10 粒15 粒，播种后表面覆盖 0.5 cm 厚的细土。然后支上铁架，盖上铁丝网和塑料薄膜，防鼠、雀害。5.6.4 苗期管理 出苗立针达到 70%80%后，打开塑料膜两端通风，接种前 3 d 追施尿素，按 30 g/m2施尿素 1 次，保证稻苗嫩绿健壮。5.7 接种和保湿 5.7.1 接种时期和接种方法 秧苗长到 34 叶时接种。接种当天将准备好的高粱粒培养基产生的新鲜分生孢子用蒸馏水洗下，各菌种切忌混杂，各种玻璃器皿专用，用电动吸引器和喉头喷雾器接种，菌液用量，每菌株 25 mL，对照喷清水。5.7.2 保湿 接种后即罩保湿罩和遮阳苫布，在适温 25 27、高湿、黑暗条件下遮荫、保湿24 h。5.7.3 潜育期管理 接种 24 h 后，打开保湿罩和遮阳苫布，保持水分管理，防鼠害、防雀害和虫害。5.8 发病调查 5.8.1 调查方法 接种 7 d10 d 后调查，病斑分 3 级，按附录 A 中规定的分级标准进行调查记载。5.8.2 无效数据重复测定 若某菌株对某鉴别品种出现“M”反应，或某菌株对所有鉴别品种无致病力，则不能定类群，需重做或不计结果。6 生理小种命名 全国稻瘟病菌生理小种鉴别寄主接种结果以全国稻瘟病菌生理小种联合试验组（1980）方法进行小种鉴定。附录 A（资料性）病斑反应型记载标准：R（抗）：无病斑或叶片上产生针头状褐点或稍大褐点；M（中抗）：叶片上产生圆至椭圆形病斑，中间灰白，边缘褐色，病斑大小在两条叶脉间；S（感）：叶片上产生梭形大斑，中间灰白，边缘黄褐色的慢性型病斑，或灰暗色的急性型病斑，且病斑大小超过两叶脉间；以病斑反应型为主要依据，目测法调查记载。若一株叶片有不同病斑，只记最高反应型。