酶的化学修饰省公共课一等奖全国赛课获奖课件.pptx

退出 Enzyme Engineering酶工程第1页第五章第五章 酶化学修饰酶化学修饰第一节第一节概述概述第二节第二节酶分子化学修饰方法学酶分子化学修饰方法学第三节第三节酶分子侧链基团化学修饰酶分子侧链基团化学修饰第四节第四节有机大分子对酶修饰有机大分子对酶修饰第五节金属离子置换修饰及物理修饰第五节金属离子置换修饰及物理修饰第六节第六节酶化学修饰应用酶化学修饰应用第2页第一节第一节 概述概述 一、一、概念概念二、二、进行化学修饰原因进行化学修饰原因三、三、化学修饰基本原理化学修饰基本原理四、四、修饰酶特点修饰酶特点第3页一、概念一、概念 n酶化学修饰酶化学修饰利用各种修饰剂含有化学基团，与酶分子上某利用各种修饰剂含有化学基团，与酶分子上某种氨基酸残基产生化学反应，使酶分子结构发生改种氨基酸残基产生化学反应，使酶分子结构发生改变，从而改变酶一些特征和功效技术变，从而改变酶一些特征和功效技术n修饰酶修饰酶在体外用一定化学方法将酶和一些试剂进行共在体外用一定化学方法将酶和一些试剂进行共价连接后而形成酶价连接后而形成酶体外改造体外改造第4页二、二、进行化学修饰原因进行化学修饰原因q稳定性不够，不能适应大量生产需要稳定性不够，不能适应大量生产需要q作用最适条件不符，活性不高作用最适条件不符，活性不高q临床应用特殊要求：可能含有抗原性临床应用特殊要求：可能含有抗原性第5页三、三、化学修饰基本原理化学修饰基本原理1、怎样增强酶天然构象稳定性与耐热性、怎样增强酶天然构象稳定性与耐热性2、怎样保护酶活性部位与抗抑制剂、怎样保护酶活性部位与抗抑制剂3、怎样维持酶功效结构完整性与抗蛋白、怎样维持酶功效结构完整性与抗蛋白水解酶水解酶4、怎样消除酶抗原性及稳定酶微环境、怎样消除酶抗原性及稳定酶微环境第6页四、四、修饰酶特点修饰酶特点1、热稳定性增加、热稳定性增加2、增加抗抑制剂、抗蛋白水解酶能力，体、增加抗抑制剂、抗蛋白水解酶能力，体内半衰期延长内半衰期延长3、消除了酶抗原性、消除了酶抗原性4、微环境稳定性增强，最适、微环境稳定性增强，最适pH改变改变5、酶学性质改变、酶学性质改变第7页第一节结束第一节结束概念概念进行化学修饰进行化学修饰原因原因化学修饰基本化学修饰基本原理原理修饰酶特点修饰酶特点第8页第一节结束第一节结束n点击返回 第9页第二节第二节 酶分子化学修饰方法学酶分子化学修饰方法学 一、一、修饰需考虑问题修饰需考虑问题二、二、选择酶分子修饰剂选择酶分子修饰剂三、三、修饰反应普通程序修饰反应普通程序四、四、测定修饰程度和修饰部位测定修饰程度和修饰部位五、五、酶修饰方法酶修饰方法第10页一、一、修饰需考虑问题修饰需考虑问题1、酶性质了解酶性质了解(1)酶活性部位情况酶活性部位情况(2)酶稳定条件、酶反应最适条件酶稳定条件、酶反应最适条件(3)酶分子侧链基团化学性质及反应活酶分子侧链基团化学性质及反应活泼性等泼性等第11页一、一、修饰需考虑问题修饰需考虑问题2、选择反应条件选择反应条件(1)反应体系中酶与修饰剂分子百分比反应体系中酶与修饰剂分子百分比(2)反应体系溶剂性质，反应体系溶剂性质，pH条件和离子强度条件和离子强度(3)反应温度及时间反应温度及时间(4)其它其它第12页二、二、选择酶分子修饰剂选择酶分子修饰剂n修修饰剂须具具备特征特征1、能选择性地与一个氨基酸残基反应能选择性地与一个氨基酸残基反应2、反应在确保酶蛋白不变性条件下进行反应在确保酶蛋白不变性条件下进行3、被标识残基在肽中稳定，轻易经过降解分离被标识残基在肽中稳定，轻易经过降解分离出来并判定出来并判定4、反应程度能用简单技术测定反应程度能用简单技术测定第13页二、二、选择酶分子修饰剂选择酶分子修饰剂n修修饰剂选择1、修饰剂相对分子质量、修饰剂链长度对蛋修饰剂相对分子质量、修饰剂链长度对蛋白质吸附性白质吸附性2、修饰剂上反应基团数目及位置修饰剂上反应基团数目及位置3、修饰剂上反应基团活化方法与条件修饰剂上反应基团活化方法与条件第14页三、三、修饰反应普通程序修饰反应普通程序修修饰反反应终止止稀稀释阳离子交阳离子交换洗洗涤过滤干燥干燥第15页三、三、修饰反应普通程序修饰反应普通程序注意事注意事项n修修饰后需后需进行总氨基酸分析进行总氨基酸分析n各种各种酶分子，修饰后均需对每个氨基酸残基酶分子，修饰后均需对每个氨基酸残基进行确定进行确定n注意缓冲液成份或修饰副产物对修饰部位和注意缓冲液成份或修饰副产物对修饰部位和修饰程度及对酶活性影响修饰程度及对酶活性影响n修饰后酶性质改变修饰后酶性质改变第16页四、四、测定修饰程度和修饰部位测定修饰程度和修饰部位n修修饰反反应评价原因价原因1、有多少修饰剂已结合到酶分子上有多少修饰剂已结合到酶分子上2、哪些氨基酸被修饰，修饰度是多少哪些氨基酸被修饰，修饰度是多少3、有多少种不一样形式修饰剂酶分子耦合物，有多少种不一样形式修饰剂酶分子耦合物，每种各有多少每种各有多少4、表面修饰、内部修饰表面修饰、内部修饰n测定方法测定方法第17页五、五、酶修饰方法酶修饰方法n侧链基团化学修饰侧链基团化学修饰n大分子结合修饰大分子结合修饰n其它其它(金属离子置换修饰、物理修饰金属离子置换修饰、物理修饰)第18页第二节结束第二节结束酶分子性质了解酶分子性质了解选择酶分子修饰剂选择酶分子修饰剂选择反应条件选择反应条件修饰反应要注意其它问题修饰反应要注意其它问题修饰反应普通程序修饰反应普通程序测定修饰程度和修饰部位测定修饰程度和修饰部位酶修饰方法酶修饰方法第19页第二节结束第二节结束n点击返回 第20页第三节第三节 酶分子侧链基团化学修饰酶分子侧链基团化学修饰 一、一、概述概述二、二、几个主要修饰反应几个主要修饰反应三、三、特定氨基酸残基侧链基团化学修饰特定氨基酸残基侧链基团化学修饰第21页一、一、概述概述n侧链基团修饰侧链基团修饰采取一定方法采取一定方法(普通为化学法普通为化学法)使酶分子侧使酶分子侧链基团发生改变，从而改变酶分子特征和功效链基团发生改变，从而改变酶分子特征和功效修饰方法修饰方法n酶侧链基团酶侧链基团组成蛋白质氨基酸残基上功效团。有氨基、组成蛋白质氨基酸残基上功效团。有氨基、羧基、巯基、咪唑基、吲哚基、酚羟基、羟基、羧基、巯基、咪唑基、吲哚基、酚羟基、羟基、胍基、甲硫基等胍基、甲硫基等第22页一、一、概述概述n作用作用研究各基团作用及其对酶结构、特征和功效研究各基团作用及其对酶结构、特征和功效影响影响(研究酶活性中心必需基团研究酶活性中心必需基团)改变酶分子性质，提升实用价值改变酶分子性质，提升实用价值测定某一基团在酶分子中数量测定某一基团在酶分子中数量取得新酶种取得新酶种第23页一、一、概述概述n类别类别蛋白类酶蛋白类酶核酸类酶核酸类酶侧链基团：磷酸基，核糖上羟基，嘌呤、嘧啶碱侧链基团：磷酸基，核糖上羟基，嘌呤、嘧啶碱基上氨基和羟基基上氨基和羟基(酮基酮基)等等第24页二、二、几个主要修饰反应几个主要修饰反应q酰化及其相关反应酰化及其相关反应q烷基化反应烷基化反应q氧化还原反应氧化还原反应q芳香环取代反应芳香环取代反应第25页酰化及其相关反应酰化及其相关反应第26页烷基化反应烷基化反应 第27页氧化和还原反应氧化和还原反应 第28页芳香环取代反应芳香环取代反应 定量测定定量测定第29页三、三、特定氨基酸残基侧链基团化学修饰特定氨基酸残基侧链基团化学修饰n巯基巯基n氨基氨基n羧基羧基n咪唑基咪唑基n胍基胍基n二硫键二硫键第30页1、巯基化学修饰巯基化学修饰 n巯基：许多酶活性中心催化基团；形成二硫巯基：许多酶活性中心催化基团；形成二硫键，稳定酶结构键，稳定酶结构n巯基含有很强亲核性，采取巯基修饰剂与酶蛋白巯基含有很强亲核性，采取巯基修饰剂与酶蛋白侧链上巯基结合，使巯基发生改变，从而改变酶侧链上巯基结合，使巯基发生改变，从而改变酶空间构象、特征和功效。提升酶稳定性空间构象、特征和功效。提升酶稳定性n惯用：酰化基、烷基化剂、马来酰亚胺、二硫苏惯用：酰化基、烷基化剂、马来酰亚胺、二硫苏糖醇、巯基乙醇、硫代硫酸盐、硼氢化钠糖醇、巯基乙醇、硫代硫酸盐、硼氢化钠第31页第32页2、氨基化学修饰氨基化学修饰 n氨基甲基化与乙酰化氨基甲基化与乙酰化赖氨酸、精氨酸、组氨酸、谷氨酰胺侧链氨基；谷赖氨酸、精氨酸、组氨酸、谷氨酰胺侧链氨基；谷氨酰胺和天冬氨酸羧基氨酰胺和天冬氨酸羧基-OH上上甲基转移酶甲基转移酶n氨基烷基化氨基烷基化脱氨基作用或与氨基共价结合，屏蔽酶分子侧链上脱氨基作用或与氨基共价结合，屏蔽酶分子侧链上氨基氨基修饰剂：亚硝酸、修饰剂：亚硝酸、2,4-二硝基氟苯二硝基氟苯(DNFB)、丹磺酰氯、丹磺酰氯(DNS)、醋酸酐、琥珀酸酐、二硫化碳、乙亚胺甲酯、醋酸酐、琥珀酸酐、二硫化碳、乙亚胺甲酯第33页第34页3、羧基化学修饰、羧基化学修饰 n修饰剂与酶分子侧链羧基进行酯化、酰基化等反修饰剂与酶分子侧链羧基进行酯化、酰基化等反应应n修饰剂：碳化二亚胺、重氮基乙酸盐、乙醇修饰剂：碳化二亚胺、重氮基乙酸盐、乙醇-盐盐酸试剂、异噁唑盐等酸试剂、异噁唑盐等第35页第36页4、咪唑基化学修饰咪唑基化学修饰 n组氨酸。许多酶活性中心必需基团组氨酸。许多酶活性中心必需基团n修饰剂经过咪唑基氮原子烷基化或碳原子亲核取修饰剂经过咪唑基氮原子烷基化或碳原子亲核取代进行修饰代进行修饰n修饰剂：碘乙酸、焦碳酸二乙酯修饰剂：碘乙酸、焦碳酸二乙酯第37页第38页5、胍基化学修饰胍基化学修饰 n精氨酸。在结合带有阴离子底物酶活性部位中起精氨酸。在结合带有阴离子底物酶活性部位中起主要作用主要作用n一些二羰基化合物在中性或弱碱性条件下与精氨一些二羰基化合物在中性或弱碱性条件下与精氨酸胍基生成稳定杂环酸胍基生成稳定杂环n修饰剂：丁二酮、修饰剂：丁二酮、1,2-环己二酮、丙二醛、苯乙环己二酮、丙二醛、苯乙二醛等二醛等第39页第40页6、二硫键化学修饰二硫键化学修饰 n同巯基基团类似同巯基基团类似n还原方法与巯基修饰方法结合，阻止再氧化成二还原方法与巯基修饰方法结合，阻止再氧化成二硫键。可用于计算断裂二硫键数目硫键。可用于计算断裂二硫键数目n修饰剂：巯基乙醇、二硫苏糖醇修饰剂：巯基乙醇、二硫苏糖醇(DTT)、二硫赤、二硫赤藓糖醇藓糖醇(DTE)、过甲酸等、过甲酸等第41页第42页第三节结束第三节结束酰化及其相关反应酰化及其相关反应烷基化反应烷基化反应氧化还原反应氧化还原反应芳香环取代反应芳香环取代反应巯基化学修饰巯基化学修饰氨基化学修饰氨基化学修饰羧基化学修饰羧基化学修饰咪唑基化学修饰咪唑基化学修饰胍基化学修饰胍基化学修饰二硫键化学修饰二硫键化学修饰概述概述几个主要修饰反应几个主要修饰反应特定氨基酸残基侧链特定氨基酸残基侧链基团化学修饰基团化学修饰第43页第三节结束第三节结束n点击返回 第44页第四节第四节 大分子结合修饰大分子结合修饰一、一、概念概念二二、大分子大分子结合修合修饰方法方法三、三、大分子大分子结合修合修饰作用作用第45页一一、概念概念q利用水溶性大分子与酶结合，使酶空间结构利用水溶性大分子与酶结合，使酶空间结构发生一些精细改变，从而改变酶特征与功效发生一些精细改变，从而改变酶特征与功效方法称为大分子结合修饰法，简称为大分子方法称为大分子结合修饰法，简称为大分子结正当结正当第46页二二、大分子大分子结合修合修饰方法方法修饰剂选择修饰剂选择修饰剂活化修饰剂活化修饰修饰分离分离第47页1、修饰剂选择、修饰剂选择q水溶性大分子。如聚乙二醇水溶性大分子。如聚乙二醇(PEG)、右旋糖酐、蔗、右旋糖酐、蔗糖聚合物、葡聚糖、环状糊精、肝素、羧甲基纤糖聚合物、葡聚糖、环状糊精、肝素、羧甲基纤维素、聚氨基酸等维素、聚氨基酸等qPEG:110KD。溶解度高，无抗原性，无毒。溶解度高，无抗原性，无毒性，生物相容性好性，生物相容性好第48页2、修饰剂活化、修饰剂活化q需活化才能与酶分子侧链基团进行反应需活化才能与酶分子侧链基团进行反应eg.单甲氧基聚乙二醇单甲氧基聚乙二醇(MPEG)(1)聚乙二醇均三嗪衍生物聚乙二醇均三嗪衍生物MPEG1,MPEG2。对天冬酰胺酶等氨基进行修饰。对天冬酰胺酶等氨基进行修饰(2)聚乙二醇琥珀酰亚胺衍生物聚乙二醇琥珀酰亚胺衍生物SS-MPEG,SSA-MPEG,SC-MPEG。pH7-10条件下对酶条件下对酶分子氨基进行修饰分子氨基进行修饰(3)聚乙二醇马来酸酐衍生物聚乙二醇马来酸酐衍生物PM。其中马来酸酐经过酰胺键对酶分子上氨基进行修饰。其中马来酸酐经过酰胺键对酶分子上氨基进行修饰(4)聚乙二醇胺类衍生物聚乙二醇胺类衍生物对酶分子上羰基进行修饰对酶分子上羰基进行修饰第49页3、修饰、修饰q将活化大分子修饰剂与经分离纯化酶液以一定百分比混合，将活化大分子修饰剂与经分离纯化酶液以一定百分比混合，在一定温度、在一定温度、pH等条件下反应。使修饰剂活化基团与酶分等条件下反应。使修饰剂活化基团与酶分子侧链基团共价结合，进行修饰子侧链基团共价结合，进行修饰第50页4、分离、分离q经过凝胶层析等方法，将含有不一样修饰程经过凝胶层析等方法，将含有不一样修饰程度酶分子分开，从中取得含有很好修饰效果度酶分子分开，从中取得含有很好修饰效果修饰酶修饰酶第51页三、大分子结合修饰作用三、大分子结合修饰作用q提升酶活力提升酶活力q增强酶稳定性增强酶稳定性q降低或消除抗原性降低或消除抗原性酶半衰期相对稳定性天然SOD6min1右旋糖酐-SOD7h70ficoll(低分子量)-SOD14h140ficoll(高分子量)-SOD24h240聚乙二醇-SOD35h350天然天然SOD与修饰后与修饰后SOD在人体血浆中在人体血浆中半衰期半衰期第52页第四节结束第四节结束概念概念大分子结合修饰方法大分子结合修饰方法大分子结合修饰作用大分子结合修饰作用修饰剂选择修饰剂选择修饰剂活化修饰剂活化修饰修饰分离分离提升酶活力提升酶活力增强酶稳定性增强酶稳定性降低或消除抗原性降低或消除抗原性第53页第四节结束第四节结束n点击返回 第54页第五节第五节 金属离子置换修饰及物理修饰金属离子置换修饰及物理修饰一、一、金属离子置换修饰金属离子置换修饰二、二、物理修饰物理修饰第55页一、一、金属离子置换修饰金属离子置换修饰1、概念概念q把酶分子中金属离子换成另一个金属离子，把酶分子中金属离子换成另一个金属离子，使酶特征和功效发生改变修饰方法，称为金使酶特征和功效发生改变修饰方法，称为金属离子置换修饰属离子置换修饰第56页一、一、金属离子置换修饰金属离子置换修饰2、方法方法酶分离纯化酶分离纯化除去原有金属离子除去原有金属离子加入置换离子加入置换离子加入金属螯合剂加入金属螯合剂(EDTA)，形，形成螯合物，透析、超滤、分成螯合物，透析、超滤、分子筛层析等除去子筛层析等除去普通都是二价金属离子。比如普通都是二价金属离子。比如Ca2+、Mg2+、Zn2+、Co2+、Cu2+、Fe2+等等只适合用于哪些在分子结构只适合用于哪些在分子结构中原来含有金属离子酶中原来含有金属离子酶第57页一、一、金属离子置换修饰金属离子置换修饰3、作用作用q说明金属离子对酶催化作用影响说明金属离子对酶催化作用影响q提升酶活力提升酶活力q增强酶稳定性增强酶稳定性q改变酶动力学特征改变酶动力学特征第58页二、二、物理修饰物理修饰1、概念概念q经过各种物理方法使酶分子空间构象发生一经过各种物理方法使酶分子空间构象发生一些改变，从而改变酶一些特征和功效方法，些改变，从而改变酶一些特征和功效方法，称为酶分子物理修饰称为酶分子物理修饰第59页二、二、物理修饰物理修饰2、作用作用q了解在不一样物理条件下，因为酶分子空间构象改了解在不一样物理条件下，因为酶分子空间构象改变而引发酶特征和功效改变情况变而引发酶特征和功效改变情况q探索极端环境中生物生存可能性及其潜力探索极端环境中生物生存可能性及其潜力q提升酶催化活性，增强酶稳定性，改变酶催化动力提升酶催化活性，增强酶稳定性，改变酶催化动力学特征学特征第60页二、二、物理修饰物理修饰3、特点特点q不改变酶组成单位及其基团，酶分子中共价键不发不改变酶组成单位及其基团，酶分子中共价键不发生改变。只是副键发生一些改变和重排生改变。只是副键发生一些改变和重排q可在一些变性剂作用下，首先破坏酶分子原有空间可在一些变性剂作用下，首先破坏酶分子原有空间构象，然后在不一样物理条件下，使酶分子重新构构象，然后在不一样物理条件下，使酶分子重新构建新空间构象建新空间构象第61页第五节结束第五节结束金属离子置换修饰金属离子置换修饰物理修饰物理修饰概念概念方法方法作用作用概念概念作用作用特点特点第62页第五节结束第五节结束n点击返回 第63页第六节第六节 酶化学修饰应用酶化学修饰应用 一、一、在酶学研究方面应用在酶学研究方面应用二、二、在医药方面应用在医药方面应用三、三、在工业方面应用在工业方面应用四、四、在有机介质酶催化反应中应用在有机介质酶催化反应中应用v化学修饰方法不足化学修饰方法不足第64页一、一、在酶学研究方面应用在酶学研究方面应用q酶活性中心研究酶活性中心研究q酶空间结构研究酶空间结构研究采取含有荧光特征修饰剂，可借助荧光光谱研究，采取含有荧光特征修饰剂，可借助荧光光谱研究，分析各基团在酶分子中空间分布情况分析各基团在酶分子中空间分布情况采取巯基修饰剂，可了解酶分子中半胱氨酸数目及采取巯基修饰剂，可了解酶分子中半胱氨酸数目及分布情况，确定肽链数目和二硫键数目分布情况，确定肽链数目和二硫键数目q酶作用机制研究酶作用机制研究了解各种残基及侧链基团在酶催化过程中作用了解各种残基及侧链基团在酶催化过程中作用惯用修饰方法有亲和标识法、差异标识法、氨基酸惯用修饰方法有亲和标识法、差异标识法、氨基酸(核酸核酸)置换法等置换法等第65页二、二、在医药方面应用在医药方面应用q降低或者消除酶抗原性降低或者消除酶抗原性q增强医药用酶稳定性增强医药用酶稳定性(半衰期延长半衰期延长)q改变组织分布改变组织分布酶经化学修饰后，能在血液中被靶器官选择酶经化学修饰后，能在血液中被靶器官选择性地吸收性地吸收第66页三、三、在工业方面应用在工业方面应用q提升工业用酶活力提升工业用酶活力q增强工业用酶稳定性增强工业用酶稳定性q改变酶动力学特征改变酶动力学特征第67页四、四、在有机介质酶催化反应中应用在有机介质酶催化反应中应用q经侧链基团修饰，酶分子能溶解于有机溶剂，均经侧链基团修饰，酶分子能溶解于有机溶剂，均匀分布于溶剂中，提升酶催化效率和稳定性匀分布于溶剂中，提升酶催化效率和稳定性eg.用用MPEG对脂肪酶、过氧化氢酶、过氧化物酶等酶分子对脂肪酶、过氧化氢酶、过氧化物酶等酶分子表面上氨基进行共价结合修饰，得到修饰酶能均一地溶解表面上氨基进行共价结合修饰，得到修饰酶能均一地溶解于苯和氯仿等有机溶剂于苯和氯仿等有机溶剂第68页v化学修饰方法不足化学修饰方法不足n扩散速度受限扩散速度受限n生物活性降低生物活性降低n修饰剂展现各种聚合度，选择性不高修饰剂展现各种聚合度，选择性不高n只能在含有极性氨基酸残基侧链上进行只能在含有极性氨基酸残基侧链上进行第69页第六节结束第六节结束在酶学研究方面应用在酶学研究方面应用在医药方面应用在医药方面应用在工业方面应用在工业方面应用在有机介质酶催化反应中应用在有机介质酶催化反应中应用v化学修饰方法不足化学修饰方法不足第70页思索题思索题1.酶化学修饰、修饰酶概念。酶化学修饰、修饰酶概念。2.为何要进行酶化学修饰？经化学修饰后，为何要进行酶化学修饰？经化学修饰后，酶性质通常会发生哪些改变？酶性质通常会发生哪些改变？第71页第六节结束第六节结束n点击返回 第72页