GB 31658.20-2022 食品安全国家标准 动物性食品中酰胺醇类药物及其代谢物残留量的测定 液相色谱-串联质谱法-（高清版）.pdf

中华人民共和国国家卫生健康委员会食品安全国家标准动物性食品中酰胺醇类药物及其代谢物残留量的测定液相色谱-串联质谱法04中 华 人 民 共 和 国 国 家 标 准备案号：XXXX-XXXX67.050X31658.202022National food safety standardDetermination of amphenicols and metabolite residues in animalderived food by liquid chromatography-tandem mass spectrometry methodGB2022?09?20发布2023?02?01实施发 布国 家 市 场 监 督 管 理 总 局中 华 人 民 共 和 国 农 业 农 村 部CCSG B 前言本文件按照G B/T 标准化工作导则第部分:标准化文件的结构和起草规则 的规定起草.本文件系首次发布.G B 食品安全国家标准动物性食品中酰胺醇类药物及其代谢物残留量的测定液相色谱串联质谱法范围本文件规定了动物性食品中酰胺醇类药物及其代谢物残留量检测的制样和液相色谱串联质谱测定方法.本文件适用于猪、鸡、牛、羊的肌肉、肝脏、肾脏、脂肪组织,以及鸡蛋、牛奶、羊奶中氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考和氟苯尼考胺残留量的测定.规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款.其中,注日期的引用文件,仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件.G B/T 分析实验室用水规格和试验方法术语和定义本文件没有需要界定的术语和定义.原理试样中残留的氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考和氟苯尼考胺用氨化乙酸乙酯溶液提取,正己烷脱脂,氨化乙酸乙酯反萃取,液相色谱串联质谱法测定,内标法定量.试剂和材料除另有规定外,所有试剂均为分析纯,水为符合G B/T 规定的一级水.试剂 甲醇(CHOH):色谱纯.乙腈(CHC N):色谱纯.氨水(NHHO).乙酸乙酯(CHO).无水硫酸钠(N aS O).氯化钠(N a C l).甲酸铵(HC OONH).正己烷(CH).溶液配制 氨化乙酸乙酯溶液:取氨水 m L,用乙酸乙酯稀释至 m L.氯化钠溶液:取氯化钠g,用水溶解并稀释至 m L.氯化钠饱和的正己烷:取氯化钠溶液适量,加入过量的正己烷,混合,静置分层,取上层正己烷.甲醇溶液:取甲醇 m L,用水稀释至 m L.G B mm o l/L甲酸铵溶液:取甲酸铵 g,用水溶解并稀释至 m L.标准品氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考、氟苯尼考胺,含量均,氯霉素 D、甲砜霉素 D、氟苯尼考 D、氟苯尼考胺 D内标,含量均,具体见附录A.标准溶液制备 标准储备液:取氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考、氟苯尼考胺标准品各适量(相当于各活性成分约 m g),精密称定,分别加甲醇适量使溶解并稀释定容至 m L容量瓶中,配制成浓度为 g/m L的标准储备液.以下保存,有效期 个月.内标储备液:取氯霉素 D、甲砜霉素 D、氟苯尼考 D、氟苯尼考胺 D内标各适量(相当于各活性成分约 m g),精密称定,分别加甲醇适量使溶解并稀释定容至 m L容量瓶中,配制成浓度为 g/m L的内标储备液.以下保存,有效期 个月.混合标准中间液:分别精密量取氯霉素标准储备液 m L,甲砜霉素、氟苯尼考、氟苯尼考胺标准储备液各 m L,于 m L容量瓶中,用甲醇稀释至刻度,配制成氯霉素浓度为g/m L,甲砜霉素、氟苯尼考、氟苯尼考胺浓度为g/m L混合标准中间液.以下保存,有效期个月.混合内标中间液:分别精密量取氯霉素 D内标储备液 m L,甲砜霉素 D、氟苯尼考 D、氟苯尼考胺 D内标储备液各 m L,于 m L容量瓶中,用甲醇稀释至刻度,配制成氯霉素 D浓度为g/m L,甲砜霉素 D、氟苯尼考 D、氟苯尼考胺 D浓度为g/m L混合内标中间液.以下保存,有效期个月.混合内标工作液:取混合内标中间液,用 甲醇溶液稀释成氯霉素 D浓度为 n g/m L,甲砜霉素 D、氟苯尼考 D、氟苯尼考胺 D浓度为 n g/m L混合内标工作液,现配现用.材料尼龙微孔滤膜:m.仪器和设备 液相色谱串联质谱仪:配电喷雾离子源(E S I).天平:感量 g和 g.均质机.涡旋混合器.多管涡旋振荡器.高速冷冻离心机:转速可达 r/m i n.氮吹仪.试样的制备与保存 试样的制备 肌肉、肝脏、肾脏和脂肪组织取适量新鲜或解冻的空白或供试组织,绞碎,并均质.a)取均质后的供试样品,作为供试试样;b)取均质后的空白样品,作为空白试样;c)取均质后的空白样品,添加适宜浓度的标准工作液,作为空白添加试样.奶取适量新鲜或解冻的空白或供试牛奶或羊奶,混合均匀.a)取混合均匀后的供试样品,作为供试试样;b)取混合均匀后的空白样品,作为空白试样;G B c)取均质后的空白样品,添加适宜浓度的标准工作液,作为空白添加试样.鸡蛋取适量新鲜或冷藏的空白或供试鸡蛋,去壳,并均质.a)取均质后的供试样品,作为供试试样;b)取均质后的空白样品,作为空白试样;c)取均质后的空白样品,添加适宜浓度的标准工作液,作为空白添加试样.试样的保存 以下保存.测定步骤 提取取试料g(准确至 g),置于 m L离心管中,加混合内标工作液 L,涡旋混匀,再加氨化乙酸乙酯溶液 m L(牛奶、羊奶样品需另加无水硫酸钠g),涡旋 s,涡旋振荡 m i n,r/m i n离心m i n.上清液转入另一 m L离心管中,残渣中加氨化乙酸乙酯溶液 m L,重复提取一次.合并两次提取液,于 氮气吹干,待净化.净化取待净化残渣,加氯化钠溶液m L,涡旋使溶解,再加氯化钠饱和的正己烷m L,涡旋 s,r/m i n离心m i n,弃去上层正己烷层,用氯化钠饱和的正己烷重复脱脂一次.加氨化乙酸乙酯溶液m L,涡旋振荡m i n,r/m i n离心m i n,取上层有机相.用氨化乙酸乙酯溶液m L重复萃取一次,合并有机相,氮气吹干,加 甲醇溶液 m L,涡旋 s,过 m滤膜,供液相色谱串联质谱仪测定.标准曲线的制备精密量取混合标准中间液和混合内标工作液适量,用 甲醇溶液稀释,配制成氯霉素浓度分别为 g/L、g/L、g/L、g/L、g/L、g/L,甲砜霉素、氟苯尼考、氟苯尼考胺浓度分别为g/L、g/L、g/L、g/L、g/L、g/L,氯霉素 D浓度均为g/L,甲砜霉素 D、氟苯尼考 D、氟苯尼考胺 D浓度均为g/L的系列标准溶液,临用现配,供液相色谱串联质谱仪测定.以定量离子峰面积比为纵坐标、浓度为横坐标绘制标准曲线,求回归方程和相关系数.测定 液相色谱参考条件a)色谱柱:C 色谱柱(mm mm,m),或相当者;b)柱温:;c)进样量:L;d)流速:m L/m i n;e)流动相:A为 mm o l/L甲酸铵溶液;B为乙腈;梯度洗脱程序见表.表梯度洗脱程序时间,m i n mm o l/L甲酸铵溶液,乙腈,质谱参考条件a)离子源:电喷雾离子源;b)扫描方式:正离子扫描/负离子扫描;G B c)检测方式:多反应离子监测(MRM);d)脱溶剂气、锥孔气、碰撞气均为高纯氮气或其他合适气体;e)喷雾电压、碰撞能等参数应优化至最优灵敏度;f)待测物离子源、定性离子对、定量离子对、锥孔电压和碰撞能量参考值见表.表待测物离子源、定性离子对、定量离子对、锥孔电压和碰撞能量参考值药物离子源定性离子对m/z定量离子对m/z锥孔电压V碰撞能量e V氯霉素E S I 甲砜霉素E S I 氟苯尼考E S I 氟苯尼考胺E S I 氯霉素 DE S I 甲砜霉素 DE S I 氟苯尼考 DE S I 氟苯尼考胺 DE S I 测定法 定性测定在同样测试条件下,试料溶液中酰胺醇类药物及其代谢物的保留时间与标准工作液中酰胺醇类药物及其代谢物的保留时间相对偏差在 以内,且检测到的相对离子丰度,应当与浓度相当的校正标准溶液相对离子丰度一致.其允许偏差应符合表要求.表定性确证时相对离子丰度的允许偏差单位为百分号相对离子丰度允许偏差 定量测定取试料溶液和相应的标准溶液,作单点或多点校准,按内标法以色谱峰面积比定量.标准溶液及试样溶液中酰胺醇类药物及其代谢物与其相应内标峰面积比均应在仪器检测的线性范围内.对于残留量超出仪器线性范围的,在提取时根据药物浓度相应增加内标工作液的添加量,使试样溶液稀释后酰胺醇类药物及其代谢物的浓度在曲线范围之内,对应内标浓度与标准工作液一致.标准溶液特征离子质量色谱图见附录B.空白试验取空白试料,除不加药物外,采用完全相同的测定步骤进行测定.结果计算和表述试样中酰胺醇类药物及其代谢物的残留量按标准曲线或公式()计算.XCsCisAiA isVC isAsAism()式中:X 试样中酰胺醇类药物及其代谢物残留量的数值,单位为微克每千克(g/k g);G B Ci s 试样溶液中酰胺醇类药物及其代谢物内标浓度的数值,单位为微克每升(g/L);Cs 标准溶液中酰胺醇类药物及其代谢物浓度的数值,单位为微克每升(g/L);C i s 标准溶液中酰胺醇类药物及其代谢物内标浓度的数值,单位为微克每升(g/L);Ai 试样溶液中酰胺醇类药物及其代谢物的峰面积;Ai s 试样溶液中酰胺醇类药物及其代谢物内标的峰面积;As 标准溶液中酰胺醇类药物及其代谢物的峰面积;A i s 标准溶液中酰胺醇类药物及其代谢物内标的峰面积;V 溶解残渣的 甲醇溶液体积的数值,单位为毫升(m L);m 试样质量的数值,单位为克(g).方法灵敏度、准确度和精密度 灵敏度本方法氯霉素的检测限为 g/k g,定量限为 g/k g;甲砜霉素、氟苯尼考、氟苯尼考胺的检测限为 g/k g,定量限为g/k g.准确度本方法氯霉素在 g/k g g/k g添加浓度水平,甲砜霉素在g/k g g/k g添加浓度水平,氟苯尼考、氟苯尼考胺在g/k g g/k g添加浓度水平上的回收率均为 .精密度本方法批内相对标准偏差,批间相对标准偏差.G B 附录A(资料性)酰胺醇类药物及其代谢物标准品和内标物中英文通用名称、化学分子式和C A S号酰胺醇类药物及其代谢物标准品和内标物中英文通用名称、化学分子式和C A S号见表A .表A 酰胺醇类药物及其代谢物标准品和内标物中英文通用名称、化学分子式和C A S号中文通用名称英文通用名称化学分子式C A S号氯霉素C h l o r a m p h e n i c o lC H C lNO 甲砜霉素T h i a m p h e n i c o lC H C lNOS 氟苯尼考F l o r f e n i c o lC H C lF NOS 氟苯尼考胺F l o r f e n i c o l a m i n eC H F NOS 氯霉素 D内标C h l o r a m p h e n i c o l DC HDC lNO 甲砜霉素 D内标T h i a m p h e n i c o l DC H DC lNOS 氟苯尼考 D内标F l o r f e n i c o l DC H DC lF NOS 氟苯尼考胺 D内标F l o r f e n i c o l DAm i n eC H DF NOSG B 附录B(资料性)酰胺醇类药物及其代谢物标准溶液特征离子质量色谱图酰胺醇类药物及其代谢物标准溶液特征离子质量色谱图见图B .图B 酰胺醇类药物及其代谢物标准溶液特征离子质量色谱图(氯霉素 g/L,氯霉素 D g/L,甲砜霉素、氟苯尼考、氟苯尼考胺 g/L,甲砜霉素 D、氟苯尼考 D、氟苯尼考胺 D g/L)