表达抗PD-1抗体的溶瘤病毒在结肠癌腹腔移植瘤模型中的抗肿瘤作用.pdf

第37 卷第2 期2024年4月文章编号：10 0 4-8 8 2 0(2 0 2 4)0 2-0 19 9-0 8烟台大学学报（自然科学与工程版）Journal of Yantai University(Natural Science and Engineering Edition)Vol.37 No.2Apr.2024doi:10.13951/ki.37-1213/n.230312表达抗PD-1抗体的溶瘤病毒在结肠癌腹腔移植瘤模型中的抗肿瘤作用刘文琦,胡宗风,李淑珍,李劲风,李小鹏（烟台大学药学院，分子药理和药物评价教育部重点实验室（烟台大学），新型制剂与生物技术药物研究山东省高校协同创新中心，山东烟台,2 6 40 0 5）摘要：为了研究表达小鼠抗PD-1抗体（VT1093M）的溶瘤病毒对结肠癌腹腔移植瘤模型的抗肿瘤作用,利用BALB/c小鼠成瘤的小鼠结肠癌CT26-luc细胞株建立了结肠癌腹腔移植瘤模型。接种后第8 天进行分组，设置生理盐水（normal saline,NS）组、病毒VT09X组和VT1093M组，每组5只，注射剂量为2.510 pfu/250L,NS注射2 50 L每隔一天注射一次,共注射5次。末次注射后6 d,脱颈处死小鼠,提取外周血中CD45+细胞和腹水细胞,进行体外杀伤实验。治疗组初次出现荧光消失后第13天，进行再挑战实验。结果表明，造模实验确定最佳接种条件为2 0 0 uL的2.510 个/mL细胞悬液；药效实验中，VT09X组和VT1093M组较NS组具有明显的肿瘤抑制效果,VT1093M组治疗期间出现肿瘤消失情况,较VT09X组抑瘤效果明显，但差异无统计学意义；再挑战实验中，VT1093M组均未出现肿瘤再次生长；在体外杀伤实验中，注射病毒组的外周血CD45*细胞在靶效比为1:40 时对CT26-luc杀伤效果明显，对4T1细胞，各组杀伤效果较差。因此，重组溶瘤病毒VT1093M在结肠癌腹腔转移瘤模型中具有显著的抗肿瘤作用,且能激发小鼠产生较为持久的特异性免疫反应。关键词：结肠癌;腹腔移植瘤；溶瘤病毒；生物发光;特异性免疫中图分类号：R735.3+5文献标志码：A结肠癌占全球所有癌症的10.2%，是世界上发病率排名第三、死亡率第二高的恶性肿瘤 。结肠癌晚期常出现腹腔转移，在复发转移的结直肠癌患者中腹膜转移发生率高达2 5%30%2-3，国内已有关于应用 GFP/luc标记技术建立胃癌、肝癌等动物模型的报道4-5,且目前的研究多集中于结直肠癌皮下移植瘤模型或原位模型,针对于结肠癌晚期转移的研究较少6-7 。本研究利用小鼠结肠癌腹腔移植瘤模拟结肠癌晚期腹腔转移后腹腔内多发肿瘤以及产生血性腹水的症状。完全根治性手术切除是延长结肠癌患者生存时间的主要方式,但由于转移以及肿瘤分期不同,导致单一手术治疗的效果并不理想9。术前放疗或化疗也对转移性疾病或总生存期没有很大影响10 。因此,研究更加有效的治疗策略势在必行。溶瘤病毒选择性地感染并在肿瘤细胞中复制,导致肿瘤细胞裂解,并且可以作为载体携带外源基因进人肿瘤，从而改变肿瘤微环境。临床前研究表明溶瘤病毒通过多种系统运作，包括肿瘤环境的突变和免疫效应分子活性的复合变化,从而将肿瘤环境转变为收稿日期：2 0 2 3-0 3-2 7基金项目：山东省顶尖人才“一事一议”项目（主持人：李小鹏）。通信作者：李小鹏（），教授，博士，主要研究方向为微生物与生物技术药物。5.7.9天第1、3、5.7.9天200抗肿瘤环境12 。有研究表明表达小鼠抗PD-1抗体的溶瘤病毒小鼠在CT26结肠癌皮下模型中显示出显著的抗肿瘤作用13。本研究摸索生物荧光标记的小鼠结肠癌腹腔移植瘤造模条件,探究表达小鼠抗PD-1抗体(VT1093M)的溶瘤病毒在 CT26-luc结肠癌腹腔移植瘤模型上的抗肿瘤作用。1材料与设备1.1材料小鼠结肠癌细胞-荧光素酶标记,CT26-luc,购自上海南方模式生物科技股份有限公司；小鼠乳腺癌细胞,4T1,购自上海中国科学院细胞库。1.2试剂CFSE试剂盒、PI染料均购自美国Thermo Fish-er 公司,CD45（T I L)M i c r o b e a d s、D e a d Ce l l R e m o v a lKit均购自德国美天旅公司，IVISbrite D-LuciferinPotassium Salt Bioluminescent Substrate 购自珀金埃尔默股份有限公司。1.3病毒VTO9X,以野生型单纯疱疹病毒1 型（HSV1）病毒株为基础，通过同源重组删除了基因组中34.5基因和47基因的拷贝。VT1093M，以VT09X为载体构建的表达小鼠抗PD-1抗体的重组溶瘤病毒。1.4实验动物SPF级健康56 周雌性BALB/c小鼠，体重1820g,购自济南朋悦动物繁殖有限公司。所有动物实验方案操作均遵守烟台大学实验动物使用管理规范。1.5仪器磁场（德国美天施），小动物活体成像系统（珀金埃尔默），FACSCelesta流式细胞仪（美国BD公司）。2方法2.1细胞体外发光效率检测CT26-luc细胞培养在含有10%FBS 的RPMI1640培养基中,收集指数生长期的细胞,将细胞数按照0、31 2 50、6 2 50 0、12 5 0 0 0、2 50 0 0 0、50 0 0 0 0,1000000个/孔分别接种到96 孔黑板中，设置3个复孔，每孔加入10 0 LD-Luciferin使其终浓度为150 g/mL,另设置只有细胞不加 D-Luciferin 的对照组。暗室反应5 10 min用活体成像系统检测，分析发光强度与细胞数之间的相关性。烟台大学学报（自然科学与工程版）2.2结肠癌腹腔移植瘤造模实验收集生长旺盛的CT26-luc 细胞,离心,计数,用PBS或不含血清的培养基调整细胞浓度,置于冰上备用。设置四个造模条件：分别接种2 0 0 L的510个/mL细胞悬液，40 0 L的2.510 个/mL细胞悬液,2 0 0 L的2.510 个/mL细胞悬液和400L的1.2 510 个/mL细胞悬液，消毒小鼠左下腹壁,将细胞悬液注射入左下腹腔。在接瘤第4天开始通过动物活体成像系统进行观察，隔天测量一次小鼠腹腔的肿瘤荧光变化和体重变化,待小鼠腰围发生变化后记录小鼠腰围。在实验过程中注意观察小鼠的生理状况,包括摄食，饮水,排泄情况,竖毛情况和荷瘤小鼠活动性等异常现象。2.3浴溶瘤病毒在腹腔CT26-luc结肠癌腹腔移植瘤模型中的药效评价参照“2.2”结果，确定CT26-luc细胞接种浓度建立结肠癌晚期转移模型,将 CT26-luc 细胞在无血清培养基中重悬，腹腔注射2 0 0 L的2.510 个/mL细胞悬液，接瘤后待体内光子通量值达到110p/s以上,将小鼠随机分为3组（n=5）,分组当天记作治疗第1天。所用溶瘤病毒通过空斑法测定滴度为2 10 pfu/mL,参照实验室前期动物实验中针对病毒的安全性和有效性评估,确定注射体积为2 50 L/只,腹腔注射时一次进针，分34点进行注射,尽可能地使溶瘤病毒能够均匀地分布到腹腔中。具体治疗方案如表1,每隔一天用动物活体成像系统观察小鼠腹腔荧光变化。在注射病毒组初次出现荧光消失后第13天，进行再挑战实验，腹腔注射2 0 0 L的2.510 个/mL细胞悬液,并记录荧光变化情况。表1治疗方案Tab.1 Treatment plan组别nNS5VTO9X52.5 10 pfuVT1093M52.5 10 pfu2.4小鼠外周血CD45*细胞及腹水对肿瘤细胞杀伤作用的检测末次注射病毒后6 d处死小鼠,取外周血和腹水,再利用磁珠分离小鼠外周血中的CD45*细胞，第37 卷剂量注射方式治疗时间第1、3、250Li.p.i.p.i.p.第1、3、5.7.9天工第2 期刘文琦,等:表达抗PD-1 抗体的溶瘤病毒在结肠癌腹腔移植瘤模型中的抗肿瘤作用并计数。为检测小鼠外周血 CD45+细胞和腹水细胞是否会对肿瘤细胞产生特异性杀伤,选取CT26-luc和4T1 细胞为靶细胞,以相同种属的肿瘤细胞4T1为对照靶细胞,确定靶效比为1:10 和1:40,用CFSE对靶细胞进行预先染色,随后根据不同的效靶比在2 4孔板中加入适量的CD45*细胞悬液，每个比例做3个平行对照。再加入1mL1640完全培养基,摇匀后放入37,5%CO,细胞培养箱培养4h。将细胞消化后，加人适量16 40 完全培养基，150 0 r/min离心5min,加人2 0 0 LPBS重悬,向其中加人2.5LPI染料,加入后反应40 s上机检测。杀伤效率=CFSE+/PI+:（C FSE*/PI+C FSE*/PI-）100%。2.5楼数据处理以GraphPad Prism9.3软件进行统计学分析，所得数据以xs表示。数据分析采用双尾、非配对T检验或双因素方差分析,用Kaplan-Meier生存曲线评价动物存活率,用Mantel-Cox检验进行统计学分析。P0.05被认为具有统计学意义。3 结 果3.1鉴定CT26-luc细胞体外生物发光效率将细胞数按照0、312 50、6 2 50 0、12 5 0 0 0、250000、50 0 0 0 0 和10 0 0 0 0 0 个/孔分别接种到96孔黑板中,加入荧光素底物进行观察,结果如图1显示，生物发光强度与细胞数成正比,R=0.9584且在较低细胞数时达到较高的光子通量，说明细胞发光效率较高，可进行下一步动物造模和药效学评价实验。4107-(r.s.d)/鲁士%3107-2107-1107-00图1CT26-luc光子通量与细胞数之间的相关性研究Fig.1Correlation study between CT26-luc lumines cenceintensity and cell number3.2CT26-luc细胞造模接种条件确定201本实验设置四个不同接种条件建立动物模型，结果如图2 所示。1x101l 200 L 510/mL8x1010-400L2.5106 个/mL(.s.d)/磨默上%200 L2.5106个/mL6x1010 400 L 1.2510个/mL41010_210100-1272200L510%个/mL400 L2.510个/mL200L2.510个/mL10wo/围+400L1.25106个/mL8-专61510075-50-25-y=59.451x+41060十R?=0.958 40图2 结肠癌晚期转移造模结果Fig.2 Results of advanced metastasis in colon cancer150000300000450000600 000细胞个数/个4T10根据图2 中小鼠腹腔光通量变化、小鼠腰围变化和小鼠生存期提示,发现相同的接种细胞数并没有出现预期中接种体积越大、造模效果越好的情况，结合相同接瘤浓度但体积不同（接种条件为40 0 L的2.510 个/mL和2 0 0 L的2.510 个/mL细胞悬液)的造模效果类似,而相同接瘤细胞数但浓度不同（接种条件为2 0 0 L的2.510 个/mL和621！120t/d(c)小鼠生存期n=5,xs9t/d主上24t/d200 L5106个/mL+4400 L2.510%个/mL-L.200 L2.510%个/mL 400 L 1.2510%个/mL3040122815十31202400L的1.2 510 个/mL细胞悬液）的造模效果相差较大,推测腹腔接瘤效果与接种细胞浓度有较大的关系,可能是由于高体积低浓度细胞液稀释了动物体内局部组织液，导致细胞在体内环境生长所需营养交换效率降低,限制并影响了细胞周期,进而影响肿瘤细胞的生长。在接种条件为40 0 L的2.510个/mL和2 0 0 L的2.510 个/mL细胞悬液时,光子通量和腰围变化趋势较大,2 0 0 L的2.510个/mL的接种条件时，生存期略长。以200L的2.510 个/mL的细胞接种条件建立小鼠CT26-luc腹腔移植瘤模型,在接种18 d 时解剖该模型小鼠,发现腹腔内已形成血性腹水,且肠系膜和肝脏组织出现多发的转移灶，呈现腹腔内的广泛转移,说明小鼠CT26-luc 腹腔移植瘤模型构建成功（图3）。因此选择2 0 0 L的2.510 个/mL的细胞接种量为小鼠腹腔移植瘤模型建模条件。3.3溶瘤病毒对结肠癌腹腔移植瘤的抗肿瘤活性为评价溶瘤病毒VT1093M对小鼠CT26-luc 腹腔移植瘤的治疗效果，本实验选择2 0 0 L的2.510个/mL细胞悬液的接种条件建立了小鼠CT26-luc腹腔移植瘤模型，并检测溶瘤病毒T1093M在该模型中的抑瘤效果,实验方案如图4烟台大学学报（自然科学与工程版）所示。治疗过程中,NS 组较其他注射病毒组体重增加（图5（a）,NS组小鼠腰围在接瘤第14天后明显增大，而其他注射病毒组腰围无明显变化（图5（b)）,可能是腹腔移植肿瘤增长和转移产生腹水引起腰围增长。在给药起始阶段，各组小鼠光子通量相似,给药后VT1093M组的肿瘤负荷显著小于NS组,且明显小于起始负荷。VTO9X组的肿瘤负荷也明显降低，但略高于VT1093M组（图6）。图32 0 0 L、2.510 个/mL的接种条件造模解剖图Fig.3Ananatomical map of inoculation conditions at 200 L2.5 10 cells/mL第37 卷再挑战实验每只小鼠腹腔注射510 5个CT26-luc细胞分为三个治疗组，分别腹腔注射250 L NS、V T 0 9X、V T 10 93M每只小鼠腹腔注射5105个CT26-luc细胞天数081012141630图4实验方案Fig.4Experimental plan247VT09X22VT1093M18-主16-T8Fig.5 Anti-tumor activities of OVs against eritoneal metastasis of colon cancerNS主T11(a)小鼠体重变化曲线图5溶瘤病毒对结肠癌腹腔转移的抗肿瘤活性9NSVT09X8-VT1093Mw/围7-王王T1417t/d王主6一主2014(b)小鼠腰围变化曲线n=5,xsT1721t/d25第2 期刘文琦,等:表达抗PD-1 抗体的溶瘤病毒在结肠癌腹腔移植瘤模型中的抗肿瘤作用203发光强度第8 天(p/s/cm/sr)10 000NS80006000VT09X4 000VT1093M2.000发光强度第11天(p/s/cm/sr)10 000NS80006 000VT09X40002.000VT1093M发光强度第14天(p/s/cm/sr)10 000NS80006 000VT09X4.0002.000VT1093发光强度第17 天(p/s/cm/sr)10.000NS80006000VT09X4.0002.000VT1093M图6 月肿瘤接种后第8、11、14、17 天的生物发光图Fig.6Bioluminescence images at days 8,11,14 and 17 after tumor inoculation4101031010210101101008x10106x1010-410102101008x1010(r.s.d)/鲁土乐6x1010410102101001.51011(j-s.d)/唐上11011.5x1010-0NSNSNSNSVT09XVT1093MVT09XVT1093M*VT09XVT1093M*VT09XVT1093M204在荧光消失后13天（即初始接瘤后第30 天)进行再挑战实验，此阶段NS组小鼠全部死亡，选择VT1093M组荧光消退小鼠、VT09X组荧光量最小的小鼠和未处理小鼠,接种2 0 0 L的2.510 个/mL细胞悬液,再次接种后第5天开始进行荧光观测,结果显示，未处理小鼠自接种第5天出现荧光，且光子通量持续增长,直到再接种后第11天，VT1093M组均未出现肿瘤生长情况，VT09X组小鼠肿瘤生长较再次接种前荧光缓慢增长（图7）,说明腹腔注射溶瘤病毒VT1093M可以诱导小鼠产生针对CT26-luc的特异性免疫反应。3.4体外杀伤实验验证VT1093M病毒的抗肿瘤免疫反应为进一步证明VT1093M病毒提高了小鼠免疫反应,末次注射病毒后处死小鼠,取腹水中的细胞以及利用磁珠分离小鼠外周血中的 CD45*细胞,将其在体外与CT26-luc 和4T1细胞共培养4h,通过比较共培养前后靶细胞死亡比例来反映小鼠体内的免疫反应的强弱及其特异性。图8 显示,各注射病毒组的外周血 CD45*细胞对 CT26-luc 的杀伤作用明显,且随着靶效比例的增加而增大,但对4T1细胞的杀烟台大学学报（自然科学与工程版）伤效果较差,各比例之间无显著性差异；腹水中的细胞对肿瘤细胞的杀伤效果均不明显。实验结果表明注射VT1093M组外周血中的白细胞对于肿瘤细胞的杀伤以特异性杀伤为主。发光强度对照VT09X第5天第8 天第11天图7 病毒的肿瘤特异性抗肿瘤免疫反应验证Fig.71Validation of the tumor-specific anti-tumor immuneresponse of the virus第37 卷VT1093M(p/s/cm/sr)-10000-8000-6000-40002.000外周血 CD45+细胞100-靶效比1:10*靶效比1:4080-60-CT26-1UC4020-0腹水细胞100*80-%/率光酬60-40-20-0NSVT09X靶效比1:10靶效比1:40VT1093MNSVT09XVT1093M10080-60-4T140-20-0靶效比1:10靶效比1:40NSVTO9Xn=3，x s。与NS 组相比，*P0.05，*P 0.0 0 1。10080-60-40-20-0VT1093M靶效比1:10靶效比1:40NSVT09XVT1093M图8 小鼠外周血CD45*细胞和腹水细胞的体外杀伤实验Fig.8 In vitro killing of CD45+cells and ascites cells in mouse peripheral blood第2 期刘文琦,等:表达抗PD-1 抗体的溶瘤病毒在结肠癌腹腔移植瘤模型中的抗肿瘤作用4 讨 论本研究以CT26-luc 为实验材料成功建立了结肠癌腹腔移植瘤模型,并利用动物活体成像进行长期的观测,较普通造模更加直观灵敏且结果更加准确可靠。随后利用该模型探究了重组溶瘤病毒的抗肿瘤作用,结果显示VT1093M在结肠癌腹腔移植瘤模型中展示出较好的抑瘤效果，腹部荧光显著弱于NS组,在外周血分离的 CD45*细胞与 CT26-luc 和4T1细胞共培养实验中，VT1093M表现出对CT26-luc更明显的杀伤,并且对4T1无明显作用,这说明血液中的白细胞对肿瘤细胞的杀伤属于特异性杀伤,因此在再挑战实验中无肿瘤生长和复发的现象，从而达到持久且良好的抑瘤作用。已有研究表明,腹腔注射溶瘤病毒在小鼠腹腔肿瘤模型中显示出良好的治疗效果。LAMBRIGHT等报道在h-ras 转化的小鼠成纤维细胞衍生的肿瘤细胞系 EJ-6-2-Bam-6a 腹腔肿瘤模型上,溶瘤病毒HSV-1716以每次410 pfu进行腹腔注射。多次注射后小鼠的生存期得到显著的提高,达到40%的治愈率,且 HSV1 免疫过的腹腔肿瘤模型小鼠对比未免疫过的小鼠生存率没有明显的下降，这表明了腹腔注射HSV1溶瘤病毒的有效性和安全性14。本研究中,VT09X实验组的抑制效果进一步证实了该实验结果,并且VT1093M在VT09X的基础上表达 PD-1 抗体,显著提高了腹腔肿瘤的治愈率。本研究第一次报道携带免疫检查点抑制剂的HSV1溶瘤病毒在小鼠腹腔移植瘤中的显著抑瘤效果。临床上利用溶瘤重组腺5 型病毒 H101(Oncorine)治疗肿瘤腹腔转移后产生腹水的病人，证明了H101具有良好的安全性和有效性，腹腔注射H101可以促进腹腔肿瘤细胞消退以及树突状细胞、CD8+T细胞的水平上升，且腹水控制率达到7 5%，显示出H101的溶瘤活性以及激活腹腔内杀伤肿瘤的免疫活性15携带免疫检查点抑制剂的HSV1溶瘤病毒在临床上针对腹腔转移病人的治疗具有较大的潜力,探究在腹腔移植瘤小鼠中腹腔注射VT1093M所引起免疫环境的改变是我们下一步的研究目标。总之，通过荧光标记的细胞建立可在动物活体成像系统下直接观测的结肠癌腹腔移植瘤模型，来模拟结肠癌晚期腹腔转移后腹腔多发转移且产生血性腹水的现象，重组溶瘤病毒VT1093M展现出显著的抗肿瘤作用，且激发了小鼠较为持久的特异性免疫反应，为结肠癌晚期腹腔转移肿瘤的临床治疗提供了依据。参考文献：1 SUNG H,FERLAY J,SIEGEL R L,et al.Global cancer205statistics 2020:GLOBOCAN estimates of incidence and mortalityworldwide for 36 cancers in 185 countries J.CA:A CancerJournal for Clinicians,2021,71(3):209-249.2 ARNOLD M,SIERRA M S,LAVERSANNE M,et al.Global patterns and trends in colorectal cancer incidence andmortalityJ.Gut,2017,66(4):683-691.3中国医师协会结直肠肿瘤专业委员会腹膜肿瘤专业委员会，结直肠癌腹膜转移预防和治疗腹腔用药中国专家共识（V2019）J 中华结直肠疾病电子杂志，2 0 19，8（4）：329-335.4CEELEN W P,FLESSNER M F.Intraperitoneal therapyfor peritoneal tumors:biophysics and clinical evidence J.Na-ture Reviews Clinical Oncology,2010,7(2):108-115.5叶雨辰，赵俊龙，王琳，等ECFP-Luc-Hepal-6 细胞系的构建及其在小鼠肝癌模型中的应用J中国生物工程杂志,2 0 15,35(5)：1-7.6 闫明霞，刘蕾，朱淼鑫，等。人肝癌原位移植瘤的活体动态观察J实验动物与比较医学，2 0 10，30（6）：40 1-405.7 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8 after inoculation,mice are randomly divided into three groups(n=5):nor-mal saline(NS)group,VT09X virus group and VT1093M virus group.A dose of 2.5 10pfu/250 L is admin-istered once every other day for a total of five viral injections.On day 6 after the last injection,mice are sacrificed,ascites cells and CD45+cells from peripheral blood are extracted for in vitro killing experiments.The rechallengeexperiment is performed on day 13 after the initial disappearance of fluorescence in the injected virus group.Model-ing experiments determine that the optimal seeding condition is 200 L2.5 10 cells/mL cell suspension.The re-sults indicate the potential efficacy of VT1093M oncolytic viruses in treating colon cancer.In the drug efficacy ex-periment,both the VTO9X and VT1093M groups exhibit significant tumor suppression compared with the NS group.The VT1093M group shows complete tumor disappearance during the treatment period with a more pronouncedtumor-suppressive effect than the VT09X group,though no significant difference is observed between the twogroups.In the rechallenge experiment,no tumor regrowth is observed in the VT1093M group.In the in vitro killingexperiment,the peripheral blood CD45+cells in the injected virus group exhibit obvious killing effect on CT26-lucwhen the target effect ratio is 1:40,while the killing effect on 4T1 cells is poor.These findings demonstrate thatthe recombinant oncolytic virus VT1093M has a significant antitumor effect in the colon cancer abdominal metastasismodel and it stimulates a relatively durable specific immune response in mice.Key words:Keywords:colon cancer;celiac graft tumor;oncolytic virus;bioluminescence;specific immunity(责任编辑周雪莹)