黏土组合芽孢杆菌Ba3控制赤潮甲藻研究.pdf

第 卷 第 期 年 月出版亚热带资源与环境学报 喻光烺 王英 苏玉萍 等.黏土组合芽孢杆菌 控制赤潮甲藻研究.亚热带资源与环境学报 ():.():.:/.黏土组合芽孢杆菌 控制赤潮甲藻研究收稿日期:基金项目:国家重点研发计划()福建省高校产学合作项目()福建省水利厅项目()福建省水利科技项目()和横向项目()联合资助作者简介:喻光烺()男 江西南昌人 硕士研究生 研究方向为河流富营养化 通信作者:苏玉萍()女 福建福州人 教授 博导 研究方向为河湖健康与生态修复 喻光烺 王英 苏玉萍 钟启俊 郑璐薇 冷东梅(.福建师范大学 环境与资源学院、碳中和现代产业学院 福州 .福建省河湖健康研究中心福州 .福建省环境保护设计院有限公司 福州 .福州市环境科学研究院 福州)摘要:基于细菌溶藻和黏土吸附的特性 探索了溶藻菌 与黏土组合控藻技术 正交实验确定了投加量为 无菌滤液和 黏土为最佳组合 该组合技术在 内对米氏凯伦藻的溶藻率达到 分别对比了单独投加无菌滤液、黏土、黏土 无菌滤液、黏土、黏土的控藻效果 结果显示 黏土、黏土组合在 后出现了藻密度“回弹”现象 黏土 无菌滤液在 后的溶藻效果达到 以上显著高于其他组合 检测试验前后叶绿素 浓度的变化 进一步验证了 无菌滤液组合黏土的高效控藻效果 有望在赤潮甲藻控制中应用推广关键词:溶藻菌 黏土 米氏凯伦藻 赤潮中图分类号:文献标志码:文章编号:()(.):.“”.:鉴于绿色经济发展的大趋势 从已被恢复的海洋环境中分离得到与赤潮藻类相制衡的生物 通过这种 第 期喻光烺等:黏土组合芽孢杆菌 控制赤潮甲藻研究生物来调节海洋环境富营养化是较好的选择 这种方法即生物控制法 中国天然黏土细菌组合治理赤潮研究已较为成熟 目前研究较多的溶藻菌溶藻方式主要分为 种 直接溶藻和间接溶藻 此外 近些年“以菌治藻”理念日渐深入人心 微生物可以杀灭赤潮藻类 同时可降解有毒赤潮藻释放的藻毒素 继而控制赤潮 随着相关研究的深入 溶藻菌可制备生物杀藻剂进而产业化的前景颇受广大学者关注 多种菌性载体组合或联用的生物杀藻剂的研究已达到了原位试验操作甚至批量运用的阶段 黏土组合载体具有分布广泛 低成本、环境友好等优点 一度被认为是未来治理藻类的热点问题 如刘姗姗等通过不同种类的微生物与传统的改性黏土复合方法 对东海原甲藻去除起到显著的提升作用 黏土主要起到溶藻菌或者活性物质载体的作用 并不能直接杀灭单一的沉降藻类细胞 后续需结合其他多种生物或化学法进行二次消杀 基于黏土表面离子和生物细胞的性质 团聚的动力来源以吸附力为主 颗粒间的碰撞使黏土颗粒聚集变大 黏土沉降的同时 水中的赤潮藻随之被去除 水体中藻细胞表面一般呈负电性黏土颗粒在水中表面也带负电荷 使用天然黏土控藻通常投加量较高 而投加量较高又容易造成残渣的堆积 因此黏土的除藻效果并不理想 为了在保证控藻效果的同时尽可能减少黏土的用量 许多研究对天然黏土进行改性 曹西华、俞志明和李盼盼等对此又做了相关研究 大量实验研究者发现黏土在投加量小于 时 形成的微小胶体颗粒很难下沉 要增加黏土投加量才能奏效 因而受到成本的限制溶藻菌虽表现出良好的控藻效果 但需在 后才得以体现本研究拟通过正交实验确定组合控藻技术的有效条件 综合考虑成本 技术和高效性 研究组合适用的控藻方法 考虑到藻密度用浮游植物计数法计数时 计数法不能辨别出死亡的藻细胞 可能会产生较大误差 因此本研究增加了通过叶绿素 的浓度变化反映溶藻菌与黏土组合的效果 如何定量化实现溶藻菌与黏土组合的最佳效果 对海洋赤潮的治理有着重要意义 材料与方法 实验菌种和藻种来源实验菌种:芽孢杆菌株 来自福建师范大学相关合作团队野外分离菌种实验藻种:米氏凯伦藻()购买自近海海洋环境科学国家重点实验室 实验藻种和菌株 的培养及其无菌滤液的获取将起始密度约为 米氏凯伦藻按 扩培于添加了大约 培养液的灭菌海水中 置于光照培养箱中进行培养 后期相关培养条件及菌液获取操作参考相关文献 溶藻菌 和黏土组合投加量的确定已有相关研究表明 芽孢杆菌 是通过分泌胞外化学物质进行间接方式杀藻的 其分泌的溶藻活性物质通常是一类具有耐高低温、耐酸碱的脂肽类物质 脂肽通常是芽孢杆菌由非核糖体合成途径产生的一类具有多种生物活性的次级代谢产物 且分子量多在 表 不同投加配比的无菌虑液溶藻效率实验 菌液浓度/()初始藻密度/()无菌虑液投加配比/实验平行组数温度/光暗比/()因此 设计相关实验方案以确定溶藻菌 无菌滤液和黏土组合投加的最佳去除配比 发挥两者的最优投加量区间的效率 设计方案如表 和表 实验过程中第 、取样测定藻细胞密度 计算溶藻率 分别分析溶藻菌和黏土单一投加量范围 用逼近法确定 无菌滤液和黏土最佳用量将 无菌滤液投加量设定在最佳值 调整黏土用量 分析黏土用量变化对控藻效果的影响 最后再进行正交实验 为保证控藻的相对条件下的最优效果 设计溶藻菌 和黏土投加顺序对控藻效果的分析实验 第一组先加入黏土后再投加 无菌滤液 第二组先投加 无菌滤液后再加入黏土 对比分析后确定溶藻菌 无菌滤液与黏土的组合投加顺序 亚热带资源与环境学报第 卷表 不同投加配比的黏土除藻效果探究实验 初始藻密度/()黏土投加配比/()实验平行组数温度/光暗比/无菌滤液组合黏土法实验对比无菌滤液、黏土、黏土 无菌滤液(确定最佳组合投加量与投加顺序后)、黏土、黏土对米氏凯伦藻生长的影响同时用试验前后叶绿素 浓度变化表征衡量各组合法的有效性及其条件 得出 无菌滤液与黏土组合使用的控藻最优条件及其效果 设计如下表 方案 实验用藻为 恒温培养表 不同加料配比组合的溶藻效果对比探究 初始藻密度/()投加组分投加量及配比实验平行组数温度/光暗比/对照组无菌滤液组 滤液 黏土组 黏土无菌滤液 虑液黏土 黏土 的米氏凯伦藻 实验周期为 在第 、测定藻细胞密度在第 、时测定叶绿素 含量 每一处理设 组平行样 指标测定)藻细胞密度和溶藻率藻细胞计数采用浮游生物计数法 取 摇匀的藻液于离心管中 再经鲁格试剂固定后 混匀取 滴于计数板 光学显微镜()下观察计数 藻类的鉴定参考中国内陆水域常见藻类图谱.计算细胞密度、菌液浓度和溶藻率参照文献)叶绿素 含量测定当前叶绿素 的测定根据不同的现场要求和实验室的标准 提出了多种可行的方法 本研究按 标准对地表水中叶绿素 进行分离提纯与测定 结果与讨论 无菌滤液和黏土单独投加控藻效果研究无菌滤液单独使用和黏土单独使用对米氏凯伦藻的去除效果分别如图 ()所示 单一投加无菌滤液后 与对照组相比 后藻细胞密度下降显著 时溶藻率接近 单一投加黏土后 与对照组相比 水体中的藻细胞密度亦呈下降趋势 与无菌滤液组相比 在 前 黏土组的溶藻率高于无菌滤液组 而在大约 后 黏土组的溶藻率显著下降 主要由于黏土在前期短时间内将藻细胞吸附沉降于底部 故检测到的藻密度较低 一段时间后沉降而未失活的藻细胞又再悬浮回到水体 说明单独黏土的物理吸附并不能彻底永久地消除藻的危害 考虑到无菌虑液的生物毒理性以及上述单独投加的实验效果 为后期使用无菌虑液对藻细胞的彻底灭活和黏土的物理吸附的联合控藻法提供了实践和理论的基础图 无菌滤液和黏土单独作用对米氏凯伦藻的去除效果 第 期喻光烺等:黏土组合芽孢杆菌 控制赤潮甲藻研究 不同条件下 无菌滤液和黏土单因子变量控藻效果研究由于溶藻菌 具有较高的环境抗逆性 初期菌体活性依然较高 然而生长后期 尤其是培养基中营养液即将耗尽时 溶藻菌 菌体活性及其代谢活动显著下降 以适量的黏土作为载体 从而间接性地固定化芽孢杆菌 胞外活性物质致使藻细胞溶解后 藻细胞内部释放的一些活性物质也可为溶藻菌 提供适合长时间生存的微环境和养分供给 因此分别以 无菌滤液和黏土进行单因子变量控制 实验验证了梯度浓度下的 无菌滤液和黏土分别对米氏凯伦藻溶藻率的变化 如图 所示 在全部的 内溶藻率均呈上升趋势 随着投加梯度浓度的增加 溶藻率也表现出梯度增加的趋势 时 投加量 和 的溶藻率均达到了 已无显著性差异 但均高于投加量 、的两组()且实际应用时矿物黏土投加量过大容易会对底泥沉积产生负面影响 综合溶藻菌和黏土各自单一投加杀藻时梯度投加量的去除效率均表现为在一定的低浓度区间缓慢增加 继续过高便持平甚至下降 因此考虑到藻密度和运用成本 选择投加量为 无菌滤液 黏土为最佳组合投加量 溶藻菌 和黏土投加顺序对控藻效果的影响基于前人对溶藻菌 和黏土除藻作用机理的反馈分析 溶藻菌 和黏土投加顺序不同 对米氏凯伦藻的控藻结果亦可能相差显著 根据图 所示 分别设置不同投加顺序的溶藻菌和黏土对照组 结果显示 在全部的 内 黏土优先投加组的溶藻率始终是高于无菌滤液优先投加组(相差 )推测由于先投加的黏土迅速将藻细胞进行吸附团聚 重力沉降至底 继续投加溶藻菌 无菌滤液后 其中含有的脂肽类物质将更加充分有效地对高密度藻细胞进行溶解 因此从提高黏土的絮凝效果看 将黏土先于 无菌滤液投加更具溶藻优势 组合法控藻效果分析通过探究实验对比后 为进一步比较组合作用与单独 亚热带资源与环境学报第 卷作用的控藻效果 将组合法在 内的溶藻率与无菌滤液、黏土单独作用的溶藻率对比分析图 ()图 ()红线表示组合法对米氏凯伦藻的溶藻率变化 蓝线则表示 无菌滤液单独作用的溶藻率变化 图 ()图中绿线表示黏土单独作用的溶藻率变化 阴影部分代表二者之差 从阴影面积看组合法的控藻速度快 在实验 开始表现出强烈的溶藻效果 在 时溶藻率达到 比无菌滤液单独使用时()提高 比黏土单独使用时提高 直至实验结束也未出现藻密度“回弹”的现象 控藻效果稳定 基于前期研究推测 组合法中先投加的黏土强烈吸附水体中的和大分子营养物质和藻细胞 促使形成团聚核心 加速藻类沉降 后投加的溶藻菌 无菌滤液对悬浮在水体中微小藻囊进行化学消杀 发挥物理法和生物化学法控藻的双重优势 实现快速而持久的控藻效果图 无菌滤液组合黏土与单独作用效果对比 图 黏土和 组合法对米氏凯伦藻的去除效果 据安娣等研究发现 充分利用其多孔表面电势差的吸附性 在一定的温度条件下达到吸附解析平衡 能有效地将水体中过剩的营养盐和低分子有机物吸附去除 对藻类具有很好的去除效果 本研究也对黏土与 的简单组合的除藻效果进行了探究 结果如图 所示 在 时 米氏凯伦藻藻细胞密度由 下 降 至 溶 藻 率 达 到 与其他实验组相比 黏土 组在更短时间内可产生明显的控藻效果 但在 后藻密度出现了轻微“回弹”现象 直到实验结束 溶藻率为 与 相比没有较大提升 且远低于黏土无菌滤液组 黏土与 组合在短时间内能将藻细胞絮体沉降到底部 但一段时间后藻细胞易出现逃离絮体、恢复生长的现象 这与周庆等指出藻细胞能够逃离絮体 使水体中的藻细胞密度在 内迅速增加的研究发现相一致的根据前人研究基础 发现少量的过氧化氢()可以在水中生成氧化能力很强的 预氧化可使微藻类失去活性 复合黏土作为助凝剂 能较大程度提高藻类去除率 通过设置黏土与组合法的对照实验结果 结果如图 所示 在 时 藻细胞密度下降至 溶藻率达 但其除藻效果在 之后便处于不稳定状态 直到实验结束 溶藻率仍较 时无明显提高 根据前期研究 在 投加量为 左右时 可使绝大部分藻细胞失去活性而未破裂 本实验的研究结果与其相似 在王桂荣等研究中 随着与水样的接触时间的增加 消耗量随之增多 可见 的投加量对杀藻效果影响非常大 因此 黏土与 组合能使藻细胞在短时间 第 期喻光烺等:黏土组合芽孢杆菌 控制赤潮甲藻研究图 黏土和 组合法对米氏凯伦藻的去除效果 内迅速被氧化失活至沉降 但藻细胞可能并未破裂随着时间的增加藻细胞会挣脱絮体 在水体中重新悬浮 表明该组合法只是短暂性地消除藻细胞 难以实现根治性的效果 不同控藻法叶绿素 含量变化对比叶绿素 ()作为藻密度监测的一项重要衡量指标 其含量的高低与该水体中藻类的种类、数量等密切相关 因此通过测定水体中叶绿素 含量可在一定程度上反映水质健康状况 含量会随藻密度的增加而增多 通过测定 含量对比各组合的除藻效果 综合上述不同的溶藻组合法表现出的除藻作用 研究对比了无菌滤液、黏土、黏土无菌滤液、黏土、黏土这 种控藻方法试验前后 含量的变化 考虑到水体中叶图 不同控藻方法对叶绿素 含量的影响 绿素 的变化 一方面可通过吸附等去除 另一方面对藻细胞的溶解也会存在一定的释放 实验设置采用单因子控制变量法 即只改变投加物的种类其他设置条件均完全一致 如图 所示 实验结束时 各实验组的 含量较对照组均有显著下降()降幅达到 后 黏土无菌滤液组的 含量下降幅度达实验末期 含量几乎接近 去除效果不仅远高于无菌滤液和黏土单独使用组 且优于黏土 组与黏土 组 综上对比研究表明通过投加无菌虑液黏土组合前后的 含量变化 更能准确地反映并验证该组合的高效性 结论)本研究将黏土和溶藻菌 无菌滤液进行组合除藻 有效发挥物理化学法和芽孢杆菌法控藻的双重优势 尽管含量大于 的溶藻菌和较高浓度的黏土组合均显示出 以上的控藻效率 但综合藻密度控制效果以及成本考虑 确定投加量为 无菌滤液 黏土为最佳组合投加量该配比下溶藻效果达到)通过分析试验前后藻细胞密度和叶绿素 含量的变化 黏土组合 无菌滤液法 时溶藻率达到 分别高于黏土 组合法和黏土组合法的 与 显示出黏土和 无菌滤液组合法在控制海洋甲藻赤潮方面的高效率 为防控海洋赤潮提供技术参考参考文献():何彦龙 袁一鸣 王腾.典型半封闭海湾生态敏感性评估方法研究 以惠州市大亚湾海域为例.亚热带资源与环境学报 ():.:.():.缪锦来 石红旗 李光友 等.赤潮灾害的发展趋势?防治技术及其研究进展.安全与环境学报.():.():.():.吕乐 尹春华 许倩倩 等.环境有效微生物菌剂治理蓝藻水华研究.环境科学与技术 ():.亚热带资源与环境学报第 卷.():.王艳 吴凡.改性黏土与抑藻菌耦合法抑制锥状斯氏藻研究.深圳职业技术学院学报 ():.():.栗畅 许文涛 丁桂香 等.溶藻菌及 絮凝技术联合除藻研究.广东化工 ():.():.刘姗姗 俞志明 宋秀贤 等.微生物复合改性黏土去除东海原甲藻()初探.海洋与湖沼 ():.().():.(/):.(/):.():.():.曹西华 宋秀贤 俞志明 等.有机改性黏土去除赤潮生物的机制研究.环境科学 ():.():.李盼盼 周利 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