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细菌染色技术
(2023-11-22 22:29:46)
目的规定
初步掌握细菌涂片制作，单染色法及革兰染色法等染色技术。
实验内容
1．细菌染色一般程序
涂片 干燥 固定 初染 (媒染) 脱色 复染
(1) 涂片 临床标本或液体培养物可直接涂抹于洁净的载玻片上，固体培养的细菌先在玻璃片上滴一滴生理盐水，然后取菌少许在盐水中磨匀，呈轻度混浊。涂好的菌膜大小一般以1cm2左右为宜。
(2)干燥 涂片最佳在室温下自然干燥，或将标本面向上，置于酒精灯火焰高处慢慢烘干，切不可在火焰上烧干。
(3)固定 细菌的固定常用火焰加热法，即将上述已干的涂片在火焰中迅速通过3～5次，温度以手能摸时热而不烫为度。目的在于杀死细菌，凝固细胞质，改变细菌对染料的通透性。
(4) 初染 不同的染色方法，所用染液也不同。染液以覆盖菌膜为度。
(5) 媒染 通过媒染可增长染料和被染物质的亲和力。媒染剂还可用于固定之后，亦可含在固定液或染液中。
(6) 脱色 此环节重要目的是观测细菌与染料间结合的稳定限度，作为鉴别染色之用。
(7) 复染 细菌初染色被脱色后常以复染液复染，便于观测。复染液的颜色与初染液有明显不同。
2．常用染料原液配制
一般制备100ml纯酒精饱和溶液所需染料量：美兰2g～5g；结晶紫7g～14g；碱性复红3g～7g。
3．常用的染色方法
(1) 单染色法 即用一种染料染色的方法。常用吕氏美兰或稀释石炭酸复红染液。
1) 染液
① 吕氏美兰液 美兰酒精饱和液30ml+0.01%KOH溶液70ml即成。
② 稀释石炭酸复红液 碱性复红酒精饱和液10ml+5%石炭酸溶液90ml，然后用蒸馏水作10倍稀释即成。
2) 菌种 大肠埃希菌普通斜面培养物。
3) 染色方法 于已做好的涂片上滴加吕氏美兰或稀释石炭酸复红染液，染色1min，以水冲洗至无颜色流下为止，自然干燥或以远火烘干后镜检。
4) 结果 以美兰染色者菌体呈现兰色；以稀释石炭酸复红染色的菌体呈现红色。
(2) 革兰染色法
1) 原理 细菌被结晶紫着色后，再经媒染剂解决，染成深紫色或紫黑色。如被酒精脱去颜色，经复红复染成红色，称为革兰阴性菌；如不被酒精脱色，则仍为紫黑色，称为革兰阳性菌。
革兰染色的原理尚未完全明了，重要有三种学说：① 等电点学说 革兰阳性菌的等电点低(pH2～3)，革兰阴性菌等电点较高(pH4～5)，一般染色液pH值为7.0左右，故电离后阳性菌所带阴电荷比阴性菌多，因此，摄取带阳电荷的染料（如结晶紫）多且不易脱色。② 通透性学说 革兰阳性菌细胞壁的通透性比阴性菌小，脱色剂较易通过革兰阴性菌的细胞壁，将染料溶解洗出，故易脱色；阳性菌的细胞壁通透性低，故不易脱色。③ 化学学说 革兰阳性菌细胞内具有某种特殊化学成分，一般认为是核糖核酸镁盐与多糖的复合物，它能和染料-媒染剂互相结合，使已着色的细菌不易脱色；革兰阴性菌体含核糖核酸镁盐复合物较少，易被脱色。
2) 染液
① 结晶紫染液 取结晶紫饱和溶液20ml+1%草酸铵水溶液80ml混合过滤。
② 卢戈碘液 取碘化钾2ml以10ml蒸馏水充足溶解，然后加碘1g待完全溶解后加蒸馏水至300ml。
③ 脱色剂 95%乙醇。
④ 稀释石炭酸复红 同单染色法。
3) 菌种 大肠埃希菌和葡萄球菌混合菌液。
4) 方法
① 初染 将结晶紫染液2～3滴加于制好的涂片上，染色 1min，水洗；
② 媒染 加卢氏碘液2～3滴染色1min，水洗；
③ 脱色 95%乙醇脱色0.5min(无紫色脱落为止)，水洗；
④ 复染 加稀释石炭酸复红数滴，染色1min，水洗干后镜检。
5) 结果 革兰阳性菌染成紫色，革兰阴性菌染成红色。
6) 注意事项 ① 涂片不宜过厚，否则脱色受影响，使革兰阴性菌染成革兰阳性菌，导致错误鉴定。② 为防止染液蒸发而改变浓度，碘液的颜色变淡应弃去。③ 涂片积水过多会改变染液浓度，影响染色效果，故每次水洗后应将玻片甩干。④ 注意细菌的菌龄，一般以18h～24h左右培养物效果最佳，菌龄过长影响细菌染色性。
(3) 萋-纳抗酸染色法(ziehl—neelsen)：重要用于结核杆菌和麻风杆菌检查。
1) 染液
① 石炭酸复红染液 取碱性复红酒精饱和液10ml+5%石炭酸水溶液90ml混合。
② 脱色剂 3%盐酸酒精。
③ 复染剂 吕氏美兰染液，同单染色法。
2) 菌种 卡介苗和表皮葡萄球菌混合液。
3) 方法
① 初染 在已固定的涂片上滴加石炭酸复红染液，远火渐渐加热至有蒸汽冒出，但切不可沸腾，并随时添加染色液，染色3 min～5min，冷却后水洗。
② 脱色 滴加3%盐酸酒精脱色至无红色流下为止，一般为2min。
③ 复染 水洗后用吕氏美兰复染0.5 min～1min，水洗干后镜检。
4) 结果 抗酸菌染成红色，非抗酸菌染成蓝色。
5) 注意事项 ① 加热时火切勿过大，防止染液沸腾。② 每张玻片只允许放一份标本，以免阴阳结果混淆。③ 用过的玻片要彻底洗干净，防止抗酸菌留在玻片上。④ 切勿使用染色缸，印干的滤纸只能一片一张，不得反复使用。⑤ 脱色时间宁长勿短，以免误诊。⑥ 为防止实验室感染，标本要高压灭菌后再制片。
(4) 潘本汉抗酸染色法(panpenhein) 重要用于尿及粪便中抗酸菌检查。当用萋-纳抗酸染色检出抗酸菌后，用该方法染色，结核分枝杆菌染成红色，耻垢分枝杆菌染成蓝色。
1) 染液
① 石炭酸复红染液 见萋-纳抗酸染色法。
② 复染液 取蔷薇色酸1g先溶于100ml无水乙醇中，然后加美兰2g(至饱和)，置室温中4天，使其充足溶解，过滤后加甘油20ml混匀备用。
2) 标本 怀疑肾结核患者的尿液。
3) 方法
① 初染 于制好的涂片上滴加石炭酸复红染液数滴加温染色2min。
② 复染 倾去染液勿水洗，滴加复染液，边滴边倾去，反复4～5次后，水洗、待干、镜检。
3) 结果 结核分枝杆菌染成红色，耻垢分枝杆菌及其他细菌染成蓝色。
(5) 鞭毛镀银染色法
1) 染液
① 甲液 鞭酸5g，三氯化铁5g，36%甲醛1ml，1%NaOH 1ml，蒸馏水100ml。
② 乙液 取AgNO3 2g溶于100ml蒸馏水中，临用前用15%氨水滴定，出现棕色沉淀后继续滴加氨水直至呈现乳白色薄雾状为止。
2) 方法
① 将奇异变形杆菌在1.4%的软琼脂上传两代，形成迁徙生长现象。取洁净玻片一张，于玻片上滴加蒸馏水一滴，然后取上述迁徙生长边沿的细菌少许，轻轻点于蒸馏水中，使其自然扩散、干燥，切勿火焰固定。
② 在制好的涂片上滴加甲液染3 min～5min，用蒸馏水冲洗。
③ 用乙液冲去残水后，加乙液0.5 min～1min，并在火焰上方稍加热，用蒸馏水冲洗，干后镜检。
3) 结果 菌体染成深褐色，鞭毛染成浅褐色。
4) 注意事项 ① 细菌培养时传代次数因菌种不同可适当增长。② 制涂片时菌量不宜过多，动作要轻，切勿研磨，以免鞭毛脱落。③ 加乙液后加热温度不要太高。
(6) 魏曦氏鞭毛染色法
1)    染液 饱和钾明矾液2ml，5%石炭酸液5ml，20%鞣酸液2ml相混合。临用时加碱性复红酒精饱和液1ml，混合后过夜，次日过滤后使用。此染液以3日内使用效果最佳。
2)    方法 将奇异变形杆菌在1.4%的软琼脂上传两代，形成迁徙生长现象。取高度洁净玻片一张，于玻片上滴加蒸馏水一滴，然后取上述迁徙生长边沿的细菌少许，轻轻点于蒸馏水中，使其自然扩散，置37℃培养箱内让其自干。无需火焰固定。滴加染液染0.5 min～1min，水洗待干，镜检。
3)    结果 菌体与鞭毛均呈红色。
(7) 芽胞染色法
1) 染液
① 石炭酸复红染液 见抗酸染色法。
② 脱色剂 95%乙醇。
③ 复染液 吕氏美兰染液，同单染色法。
2) 菌种 炭疽芽胞杆菌普通斜面培养物。
3) 方法
① 初染 于制好的涂片上滴加石炭酸复红染液加热染3 min～5min，勿使染液沸腾。
② 脱色 水洗后用95%乙醇脱色约1min，水洗。
③ 复染 加吕氏美兰染液染1min，水洗干后镜检。
4) 结果 芽胞染成红色，菌体呈蓝色。
(8) 黑斯(Hiss)荚膜染色法
1) 染液 结晶紫染液：取结晶紫饱和液5ml加蒸馏水95ml混合；20%CuSO4水溶液。
2) 标本 提前数日小白鼠腹腔注射肺炎链球菌菌液0.2ml，小鼠死亡后解剖取腹腔液印片。
3) 方法
①    将印片在空气中自然干燥，无需加热固定。
②    滴加结晶紫染液在火焰上加热，使有蒸汽冒出为止，勿水洗。
③    以20% CuSO4溶液冲洗染液，勿水洗，干后镜检。
4) 结果 菌体呈紫色，荚膜呈淡紫色。
(9) 阿尔伯特(Albert)异染颗粒染色法
1)    染液
① 甲液 甲苯胺兰0.15g，孔雀绿0.2g，溶于95%酒精2ml中再加入蒸馏水至100ml及冰醋酸1ml，放置24h后过滤备用。
② 乙液 将碘化钾3g溶于蒸馏水10ml～20ml中，再加碘2g等溶解后加蒸馏水至300ml备用。
2) 菌种 白喉棒状杆菌吕氏鸡蛋斜面培养物。
3) 方法 已固定的涂片上加甲液染3 min～5min，水洗后，再加乙液染色1min，水洗待干，镜检。
4) 结果 菌体呈蓝绿色，异染颗粒呈蓝黑色。
(10) 刚果红染色法(负染色法)：背景着色而菌体不着色的染色方法。
1) 染液 2%刚果红水溶液，1%盐酸酒精溶液。
2) 方法 于载玻片上滴加2%刚果红溶液1滴与少量培养菌混合，涂成均匀厚片待干，以1%盐酸酒精溶液冲洗，待干后镜检。
3) 结果 背景呈蓝色，菌体无色。
(11) 金胺“O”染色法
1)    染液
①    金胺“O”染液 金胺“O”0.1g溶于10ml95%酒精中，另取3ml石炭酸加在87ml的蒸馏水中。将此二液混匀，虽混浊但不必过滤，装入褐色瓶中，放室温保存。
②0.5%盐酸酒精。
③0.5%高锰酸钾溶液。
2) 菌种 怀疑结核的痰标本。
3) 方法 在已固定的涂片上加金胺“O”染液染15min，水洗后用0.5%盐酸酒精脱色2min，水洗，再加0.5%高锰酸钾液作用3min，水洗，待干，用荧光显微镜观测。
4) 结果 抗酸菌呈亮黄色荧光。
（12）美兰染色法
美蓝是常用的活体染色染料，当它处在氧化状态是呈现出蓝色，而还原态时为无色。用它进行活体染色时，由于活细胞代谢过程中的脱氢作用，美蓝接受H后就由氧化转变为还原态，故表现出无色；而衰老的细胞由于代谢缓慢或停止，不能使美蓝还原，所以呈蓝色或者淡蓝色。
（13）苏木精-伊红染色
苏木精-伊红染色，又称“苏木素-伊红染色”，或“H&E染色”（hematoxylin and eosin stain、HE stain），是组织学最常用的染色方法之一。
这种染色方法的基础是组织结构对不同染料的结合限度不同。染料苏木精可以将嗜碱性结构染成蓝紫色，而伊红可以将嗜酸性结构染成粉红色。嗜碱性结构通常涉及具有核酸的部分，如核糖体、细胞核及细胞质中富含核糖核酸（RNA）的区域等。嗜酸性结构则通常由细胞内及细胞间的蛋白质，如路易体（Lewy body）、酒精小体（Mallory body）、细胞质的大部分等。
有时，黄褐色也会出现在染色样本中，这是由于组织内原有的色素，例如黑色素等导致的。
（14）吉姆萨染液
吉姆萨染液（英语：Giemsa stain）是一种用于染色体的染色方法。它是罗曼诺夫斯基染色法的改善版本。以它的发明者，德国汉堡科学家古斯塔夫·吉姆沙命名。染色物质Giemsa与DNA上的磷酸机团结合，可以用于产生G显带并制作染色体组型图。通过后者，可以观测到染色体变异，如缺失，易位等。
Giemsa在A-T丰富的区段结合率高，通过显微镜可以观测到该区段呈暗带。
（15）免疫组织化学
免疫组织化学染色法是指在抗体上结合萤光或可呈色的化学物质，运用免疫学原理中抗原和抗体间专一性的结合反映，检测细胞或组织中是否有目的抗原的存在，此方式不只可以用来测知抗原的表现量也可观测抗原所表现的位置。只要是可以让抗体结合的物质，也就是具有抗原性的物质涉及蛋白质、核酸、多糖、病原体等都可侦测。
免疫组织化学的优势在于专一性、灵敏度、简便快速以及成本低廉，所以广为医院采用，通常是借由特定的肿瘤标记来筛选癌症。免疫组织化学染色法对基础研究及防止和诊疗上都是相称重要的一个方法。
（16）刘氏染色法
刘氏染色法（Liu's stain），一种将动物细胞染色以便用光学显微镜观测的方法。改良自瑞氏染色法（Romanowsky Stain），1953年由台湾大学刘祯辉专家所研究发表。
简介
相较于其他染色法，刘氏染色法的优点是非常快速，染色过程只须2~3分钟。刘氏染色法在临床上的应用非常广泛，重要用作血球染色形态分类，此外也可以当作组织学的简易染色，在临床细菌学上的使用更可以作为阴道分泌物、痰液、脓等检体的简朴染色剂(Simple Stain)。
成份
刘氏染色法所用的染液提成LiuA和LiuB两部份。LiuA具有Eosin Y，可将细胞质和血红素等染成红色；LiuB则具有Azur I 和methylene azure，可和细胞核以及白血球的嗜碱性颗粒作用，染成蓝紫色。
染液
LiuA Eosin Y 甲醇（用来固定细胞） methylene azure（少量）
LiuB Azur I methylene azure Na2HPO4˙12H2O 水 KH2PO4
环节
将组织切片放到玻片上风干固定
将Liu A染液滴加在已固定的玻片上，静置30~45秒
直接再加上Liu B染液（大约两倍Liu A体积的量），吹气混合，静置60~90秒
用小水流冲洗玻片背面，洗去残余染液，可看到表面出现绿色金属光泽
风干后即可到显微镜下观测