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学生姓名 （宋体小3号）
指导教师 （宋体小3号）
年 月 （宋体3号）

本科毕业论文
党参总酮体外抗氧化活性的研究

姓 名： 赵芬芳
班 级：
专 业： 生物工程
指导教师： 姜宁

中国·恩施
五月

Std.ID:

BACHELOR’S THESIS OF HUBEI UNITroloxRSITY FOR NATIONALITIES

Antioxidant activities of total flavonoids from radix codonopsis

Faculty Name:
School of Biological Science and technology
Major:
Biological engineering
Stu-Name:
Zhao fen fang
Mentor:
Jiang Ning

Enshi China日期？

郑重声明
本人郑重声明如下:
1.本人所呈交的学士学位论文是在指导老师的指导下自己独立完毕的。
2.本所有点材料，实验和数据都是真实的
3.本论文中引用别人已经发表的成果、数据、观点等，均已注明出处。
4.除本文中已经注明引用的内容外，不包含任何其他已经发表或撰写过的科研成果。
本声明的法律责任由本人承担。

论文作者署名: 日期:

摘要
目的：研究党参总黄酮的体外抗氧化活性。方法：以超氧阴离子自由基、、羟自由基、ABTS自由基、DMPD自由基、DPPH自由基和过氧化氢的清除能力，铁离子螯合力、总还原力、铁离子还原力为指标，测定党参总黄酮体外抗氧化活性，同时以EDTA-2Na、VC和Trolox作为阳性对照。结果：党参总黄酮体外抗氧化活性的结果表白，超氧阴离子自由基清除力为（11.79±0.8）μmol VC当量/mg,羟自由基清除力为（0.58±0.02）mmol VC当量/mg，ABTS自由基清除力为(0.35±0.1) μmol VC当量/μg、（0.04±0.01）μmol Trolox 当量/μg，DMPD自由基清除力为（17.11±1.1）μmol VC 当量/mg，DPPH自由基清除力为（14.71±1.02）μmol VC当量/mg、（6.87±0.5）mmol Trolox当量/mg，过氧化氢的清除力为（95.4±6.5）μmol VC当量/mg，铁离子螯合力为（10.48±0.8数据均保存小数点后两位。
）μmol EDTA 当量/mg，总还原力为（125.31±2.7）mmmol VC 当量/mg、（96.71±1.3）μmol Trolox 当量/mg，铁离子还原力为（0.31±0.01）μmol VC 当量/mg、（6.59±0.6）μmol Trolox 当量 /mg。结论：党参总黄酮具有较强的体外抗氧化活性，该研究为党参总黄酮进一步开发提供理论依据。
关键字：党参；总黄酮；体外抗氧化

ABSTRACT
Objective：To investigate the antioxidant activities in vitro of total flavonoids from Radix codonopsis. .Method：Some antioxidant indexes in vitro To including superoxide anion free radicals, hydroxyl radicals, ABTS, DMPD, DPPH free radical and hydrogen peroxide scavenging, Iron iron ion chelating ability, the total reducing power, and Ferric ferric ion reducing power, were determination determined of total flavones in vitro antioxidant activity of radix codonopsis pilosulae,ai the same timewhile EDTA-2Na, VC, and Trolox as were used as positive control. Result：In vitro antioxidant activity activities of total flavonoids from Radix Codonopsis showed that, superoxide anion radical scavenging capacity（11.79±0.80）μmol VC Equivalent /mg, ; hydroxyl radical scavenging capacity（0.58±0.02）mmol VC Equivalent /mg, ; ABTS free radical scavenging capacity (0.35±0.10)μmol VC Equivalent /μg、,（0.04±0.01）μmol Trolox Equivalent /μg, ; DMPD scavenging capacity for （17.11±1.10）μmol VC Equivalent /mg, ; DPPH free radical scavenging capacity （14.71±1.02）μmol VC Equivalent /mg、,（6.87±0.50）mmol Trolox Equivalent /mg, ; hydrogen peroxide scavenging capacity for （95.4±6.50）μmol VC Equivalent /mg, ; iron ion chelating ability for （10.48±0.8）μmol EDTA Equivalent /mg, ; the total reducing power for （125.31±2.7）mmmol VC Equivalent/mg、,（96.71±1.3）μmol Trolox Equivalent /mg and, iron ion reduction for （0.31±0.01）μmol VC Equivalent /mg、,（6.59±0.60）μmol Trolox Equivalent /mg.Conclusion：Total flavonoids of Radix Codonopsis exhibited strong antioxidant activity, the study provides a theoretical basis for its further development.
Keywords：radix Radix Codonopsiscodonopsis; flavonoids; antioxidant activities

目录

1.前言 1
1.1党参的介绍 1
1.1.1党参地理分布 1
1.1.2党参的化学成分 1
1.1.3党参的药理作用 1
1.2黄酮类化合物的介绍 2
1.2.1黄酮类化合物的分类 2
1.2.2黄酮类化合物的药理作用 2
1.3抗氧化活性 3
1.3.1体外抗氧化活性评价方法 3
1.3.2体外抗氧化活性评价方法的原理 3
1.4实验背景及意义 5
2.实验材料与方法 5
2.1.实验材料 5
2.2实验试剂 5
2.3实验仪器 7
2.4实验方法 7
2.4.1溶液样品的制备和试剂的配制 7
2.4.2芦丁标准曲线的测定 9
2.4.3党参黄酮的提取与测定 10
2.4.4 党参总黄酮体外抗氧化活性的测定 10
2.4.4.1超氧阴离子清除能力的测定 10
2.4.4.2过氧化氢(H2O2)清除能力的测定 10
2.4.4.3羟自由基清除能力的测定 11
2.4.4.4ABTS·+清除作用 11
2.4.4.5 DMPD·+清除能力的测定 11
2.4.4.6 DPPH清除能力的测定 12
2.4.4.7铁离子螯合能力的测定 12
2.4.4.8总还原力的测定 13
2.4.4.9铁离子还原抗氧化力的测定 13
2.5数据解决 13
3．实验结果 13
3.1芦丁标准曲线测定结果 13
3.2桑枝黄酮提取率 14
3.3 党参总黄酮体外抗氧化活性 14
3.3.1超氧阴离子的清除能力 14
3.3.2过氧化氢(H2O2)清除能力的测定结果 14
3.3.3羟自由基清除能力的测定 15
3.3.4 ABTS·+清除能力 15
3.3.5 DMPD·+清除能力 16
3.3.6 DPPH清除能力 16
3.3.7铁离子螯合能力 17
3.3.8总还原力 17
3.3.9铁离子还原抗氧化力 18
4．讨论 18
5．结论 19
6．参考文献 20
7．致谢 22

1.前言
1.1党参的介绍
党参(Radix codonopsis)，是我国传统中草药之一，它有着悠久的历史。党参重要具有补气、益血、生津的功能，主治脾肺气虚，食少倦怠，咳嗽虚喘，气血局限性，面色萎黄，心悸气短，津伤口渴，内热消渴等症[1]。由于党参具有较高的运用价值，对党参研究的人越来越多，而是从各个方面对其进行了解，使其发挥更大的功能，为我们带来更多的益处。
1.1.1党参地理分布
中国作为世界党参的主产区和分布中心的国家，拥有39种党参属植物，就了解全世界也仅仅只有40余种。在《中国药典》所收载的党参是桔梗科植物党参Codonopsis pitosala (Franch.) Nannf或川党参Codonopsis tangshen Oliv的干燥根，同属其它种类的根在局部地区亦作党参药用。由于野党参多为数年生植物无法满足市场的需要，虽然其生长适应性强，但大都垂直分布在海拔1200~3300m之间，因此市面上多使用栽培党参，主产区山西多将党参栽培于海拔700m以上地区，甘肃则多在1300m以上[2]。
1.1.2党参的化学成分
党参属药用植物，具有丰富的化学成分。目前已分离并鉴定出来的有10种甾醇类，21种糖苷类，5种生物碱类及含氮成分，34种挥发油成分，13种三萜类及其他类成分，尚有多种人体必须的无机元素和氨基酸。例如，从党参、缠绕党参中分离到3个中性五环三萜化合物；从川党参中分离得到党参苷Ⅰ、党参苷Ⅱ、党参苷Ⅲ、党参苷Ⅳ和丁香苷5个新木脂素苷；从寻甸党参(Codonopsis xundianensis)中分离鉴定了4个黄酮类组分，分别是柯伊利叶素、苜蓿素、汉黄芩素和木犀草素。其中，柯伊利叶素、苜蓿素和汉黄芩素3个黄酮组分均为从党参属植物中初次分离得到等等[3,4]。
1.1.3党参的药理作用
通过对党参化学成分的结识，现代药理研究表白，党参对人体许多方面都能带来不同样的效果：
(1)对中枢神经的作用
党参对中枢神经系统方面起到克制作用，张晓丹等发现党参水提物能延长传统催眠药戊巴比妥钠及麻醉药乙醚引起的睡眠时间，表现出镇静作用。不仅如此，党参还具有促记忆、改善学习记忆障碍的作用[3,4]。
(2)对心血管系统的作用
根据李丹明等对党参水煎剂的研究，表白其对兔胸积极脉血管平滑肌条舒缩活动的影响，结果证明党参对离体血管肌条有舒张作用，且此作用依赖于内皮细胞,也许是通过内皮细胞释放NO而产生的。不光如此，党参还具有可以改善心肌代谢，提高酶的活性的作用[3,4]。
1.2黄酮类化合物的介绍
黄酮类化合物（flavonoids）是一类在自然界中广泛存在的化合物，几乎所有的植物中都有，他们经常以游离态或与糖结合成苷的形式存在。由于其分布极其广泛并且在植物中的含量较高，所以它们是较早被人类发现的一类天然产物，同时也是许多植物成分的活性化合物，具有抗菌、抗病毒、抗氧化、抗肿瘤等药理作用[5,6]。
1.2.1黄酮类化合物的分类
黄酮类化合物具有 C6-C3-C6的基本骨架，根据中间三碳链的氧化限度、B 环( 苯基) 连接位置( 2-或 3- 位) 以及三碳链是否呈环状等特点，分为许多不同类型：涉及黄酮、黄酮醇、二氢黄酮、二氢黄酮醇、异黄酮、二氢异黄酮、查尔酮等化合物[7]。
1.2.2黄酮类化合物的药理作用
近年来，研究黄酮类化合物的国内外学者，越来越多。对其的研究也越来越进一步，这使得黄酮类化合物的应用也变得更加广泛。
(1)抗氧化、清除自由基作用
据调查，人类心脑血管疾病、肿瘤、老年性痴呆、震颤麻痹症等疾病几乎都与氧自由基有关。然而传统的合成类抗氧化剂带来的副作用太大，人们只能寻找其他的代替无，此时多酚类物质中的黄酮类化合物因其分布广泛、抗氧化性好、毒副作用小而受到大量关注[8]。以银杏叶为例，其中黄酮类化合物含量较高，具有提高免疫力，抗癌防癌；抗衰老和延长寿命等方面的作用[9]。
(2)抗哮喘作用
支气管哮喘（简称哮喘）是一种常见病、多发病。全世界患哮喘的人高达3亿人之多，我国约有3000万人，因其死亡的每年差不多有20万人。其机制复杂，并且是个长期用药的病，对药物的毒副作用规定是很高的。据研究，黄酮类化合物作为最安全的非免疫原性生物活性物质之一，具有克制炎症因子释放，改善气道炎症；改善肺功能，减少气道高反映性等功能[10]。
除此之外，黄酮类化合物尚有许多作用，例如，降血脂、镇痛等作用[11]。
1.3抗氧化活性
抗氧化是指抗氧化自由基的简称。现代医学研究表白，衰老、癌症、心血管疾病、炎症的产生与发展等都可由自由基及其代谢产物诱发，化妆品中的自由基还会直接袭击人的皮肤，从表皮细胞中抢夺电子，使皮肤失去弹性，粗糙老化，因而研究抗氧化功能评价极其重要。抗氧化功能评价方法涉及了体内评价和体外评价。由于体内研究费用高、费时长，所以现在采用更多的是体外评价。由于体外评价方法的增多，我们可以将这些方法分为两类：化学评价方法和生物活性评价方法[12]。
1.3.1体外抗氧化活性评价方法
根据抗氧化活性重要表现在克制脂质的氧化降解、清除自由基、克制促氧化剂（如螯合过渡金属）和还原能力等几方面的原理，将这些方法可以归为五大类：以脂质的氧化降解为基础的方法；以清除自由基为基础的方法；以螯合过渡金属防止产生自由基的方法；测定待测物的还原能力的方法；其它方法。本论文采用了其中的三大类为基础，进行了九个指标的研究。
以清除自由基为基础的方法：以自由基的种类不同分为生物体中存在的自由基（超氧自由基、过氧化氢、羟自由基等）和人工合成自由基（ABTS自由基、DMPD自由基、DPPH自由基等）；以螯合过渡金属防止产生自由基的方法：铁离子螯合能力；测定待测物的还原能力的方法：总还原力和铁离子还原能力的方法[13]。
1.3.2体外抗氧化活性评价方法的原理
体外抗氧化活性评价的方法有许多，在此实验过程中，本人使用了以下九中办法：
(1)超氧阴离子清除能力
超氧阴离子自由基属于单线氧自由基，它是通过邻苯三酚在碱性条件下发生自氧化而产生，体系颜色由无色变成浅黄、黄色、最后变成绿色，加入抗氧化剂可克制邻苯三酚自氧化，使体系颜色加深变缓[14]。超氧阴离子的产生如图1.1[15]：

图1-.1超氧阴离子的产生
Fig. 1.1加上英文标注

(2)过氧化氢清除能力
通过待测液对过氧化氢的清除能力进行分析。
(3)羟自由基清除能力
羟基自由基(·OH) 是一种可以激发油脂过氧化反映的较强的氧化剂，是生物细胞内反映活性最强的氧族自由基，实验体系中，过氧化氢在亚铁离子作用下生成羟自由基，向体系中加入水杨酸捕获羟自由基，同时产生在可见光区有特性吸取的紫色产物。在反映体系中加入抗氧化物质，与水杨酸竞争捕获羟自由基，使生成的紫色产物减少，溶液的吸光度发生改变[15]。

图1-.2羟自由基的产生
Fig. 1.2 同Fig. 1.1

(4)ABTS·+清除作用
ABTS[2,2' -azinobis-3-ethylbenzthiazoline-6- suLphonate，2,2' - 联氮- 二(3-乙基- 苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐] 自由基阳离子清除实验是根据不同浓度受试物对ABTS 自由基阳离子溶液吸光度的影响测定天然产物对 ABTS 自由基阳离子的清除能力。ABTS 在氧化剂的过氧化作用下形成一种亚稳态的自由基阳离子，在抗氧化物质的作用下，ABTS 自由基阳离子被部分清除，溶液吸光度减少[15]。
(5)DMPD·+清除能力
DMPD(二甲基对苯二胺)法，在酸性条件下，DMPD被氧化生成稳定的DMPD+·，它在波长505nm处有最大吸取峰，根据加入抗氧化剂后吸光度的变化可测得样品清除自由基的能力[16]。
(6)DPPH自由基清除能力
DPPH（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazine ，1,1- 二苯基-2-三硝基苯肼）是一种在氮氮连接键上具有不对称价电子的氮族自由基。DPPH 自由基清除实验中，受试物给出的氢原子与 DPPH 自由基结合，使反映溶液的吸光度发生变化[15]。
(7)铁离子螯合能力
在多种金属离子中，铁离子是最具有影响力的抗氧化剂，可以促进脂质氧化作用进行。运用铁离子与菲咯嗪(Ferrozine)的复合物的呈色反映，可以测得待测样品对铁离子的螯合能力。当样品螯合铁离子后，后导致反映物在562 nm处的吸光度值减少。0D值越小，反映待测样品的还原能力越强[17]。
(8)用铁氰化钾还原法测定样品的总还原能力
该方法的原理为抗氧化剂所提供的电子可以使Fe3 +还原为Fe2+，使体系溶液颜色改变，反映出体系中氧化还原状态的改变。体系溶液吸光度值越大，则表达被测物还原力越强，抗氧化效果越佳[14-15]。
(9)铁离子还原抗氧化力
FRAP 法是以抗氧化物质具有很强的还原能力为理论基础的。反映体系中的Fe3 +在抗氧化剂作用下生成Fe2 +，抗氧化物质的活性、含量与Fe2 +的生成量成正比。适宜的条件下Fe3 +-TPTZ 被还原生成有色物质证明有抗氧化物质存在[14]。
1.4实验背景及意义
党参作为中国人传统用药中极其重要的一味药，越来越受到人们的重视。目前对党参的研究大多还局限在它的应用，如在羊日粮中添加党参药渣有助于减轻羊肉膻[18]：党参发酵液能延缓疲劳的出现，具有显著抗疲劳效果[19]，对党参总黄酮体外抗氧化能力的研究尚少。本研究以超氧阴离子的清除能力、过氧化氢清除能力、羟自由基清除能力、ABTS清除能力、DMPD清除能力、DPPH清除能力、铁离子螯合能力、总还原力、铁离子还原能力作为指标，检测党参总黄酮的体外抗氧化活性，为党参总黄酮的进一步开发提供理论基础。

2.实验材料与方法章标题的段前为0.8行，段后为0.5行；节标题段前为0.5行，段后0.5行；标题以外的文字行距为“固定值”23磅，字符间距为“标准”
按以上的规定设计各级标题的段前段后距离

2.1.实验材料
党参购自湖北省金贵中药饮片公司
2.2实验试剂
试剂
厂家
芦丁
国药集团
NaNO2(亚硝酸钠)
天津市福晨化学试剂厂
Al(NO3)3(硝酸铝)
天津市广成化学试剂有限公司
NaOH(氢氧化钠)
天津市风船化学试剂科技有限公司
VC(抗坏血酸)
天津市光复科技有限公司
Trolox(奎诺二甲基丙烯酸酯)
东京化成工业株式会社
Na2HPO4(磷酸氢二钠)
天津市光复科技有限公司
Na2H2PO4(磷酸二氢钠)
天津市恒兴化学试剂制造有限公司
Ke[Fe(CN)6](铁氰化钾)
天津市光复科技有限公司
FeCl3(三氯化铁)
天津市光复科技有限公司
TCA(三氯乙酸)
天津市光复精细化工研究所
Tris(三羟甲基氨基甲烷)
北京鼎国昌盛生物技术有限公司
HCl(盐酸)
信阳市化学试剂厂
邻苯三酚(焦性没食子酸)
天津市光复精细化工研究所
DPPH（1,1-二苯基-2-苦肼基)
东京化成工业株式会社
无水乙醇
天津市光复科技有限公司
EDTA-2Na(乙二胺四乙酸二钠）
国药集团
FeSO4（硫酸亚铁）
天津市恒兴化学试剂制造有限公司
菲咯嗪
东京化成工业株式会社
ABTS(2 ,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐)
life science products & senies
K2S2O8(过硫酸钾)
优耐德引发剂（上海）有限公司
TPTZ（2,4,6-三吡啶基三嗪）
阿拉丁
DMPD(N,N-二甲基对苯二胺二盐酸盐)
阿拉丁
冰乙酸(冰醋酸)
天津市光复科技有限公司
水杨酸钠
天津市光复精细化工研究所
H2O2（30%过氧化氢）
天津市恒兴化学试剂制造有限公司
甲醇
国药集团化学试剂有限公司
无水乙酸钠
天津市光复科技有限公司
2.3实验仪器
仪器
厂家
Tμ-1810
北京普析通用仪器有限责任公司
实验pH计
梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司
旋蒸仪
巩义市予华仪器有限责任公司
GZX-9140 MBE数显鼓风干燥箱
上海博讯实业有限公司
RT-02A粉碎机
弘荃机械公司有限公司
酶标仪
Tecan
电子天平
上海精密科学仪器公司
2.4实验方法
2.4.1溶液样品的制备和试剂的配制
(1) 芦丁标准溶液：称取芦丁0.038 g，用30%乙醇溶解定容至250 mL，贴上标签备用。
(2) 30%乙醇：量取16 mL 95%乙醇放置50 mL容量瓶中定容至刻度，贴上标签备用。
(3) 5% NaNO3溶液：称取5 g NaNO3放置于烧杯中溶解，移至100 mL容量瓶中定容，贴上标签备用。
(4) 10% Al(NO3)3溶液：称取10 g Al(NO3)3放置于烧杯中溶解，移至100 mL容量瓶中定容。
(5) 1 mol/L NaOH 溶液：称取4 g NaOH加热水放置于烧杯中溶解，移至100 mL容量瓶中定容，贴上标签备用。
(6) 2 mg/mL VC溶液：称取0.2 g抗坏血酸放置于烧杯中溶解，移至100 mL容量瓶中定容，贴上标签备用，再根据需要稀释到一定浓度。
(7) 800 μmol/l Trolox溶液：称取0.02 g Trolox放置于烧杯中溶解，移至100 mL容量瓶中定容，贴上标签备用，再根据需要稀释到一定浓度。
(8) 0.2 mol/L PBS（pH6.6）：称取7.163 g磷酸氢二钠和3.112 g磷酸二氢钠，分别用蒸馏水溶于小烧杯，再将两溶液分别定容至100 mL的容量瓶，摇匀。以3:5的比例取37.5 mL磷酸氢二钠溶液和62.5 mL磷酸二氢钠溶液，在烧杯中混合均匀，用pH计测定其pH，用稀盐酸或氢氧化钠溶液微调pH至6.6，贴上标签备用。
(9) 1%铁氰化钾溶液：称取1 g铁氰化钾放置于烧杯中溶解，移至100 mL容量瓶中，贴上标签备用。
(10) 10%三氯乙酸：称取10 g三氯乙酸放置于烧杯中溶解，移至100 mL容量瓶中，贴上标签备用。
(11)0.1%三氯化铁：称取0.1 g三氯化铁放置于烧杯中溶解，移至100 mL容量瓶中，贴上标签备用。
(12) 7 mmol/L邻苯三酚：称取0.0088 g邻苯三酚试剂，取10 mL纯水溶解于10 mL的EP管中，摇匀，贴上标签。需要注意的是，由于邻苯三酚容易发生自氧化，因此，邻苯三酚溶液必须现配现用。
(13) Tris-HCl缓冲液（pH8.2）：称取1.5142 g Tris颗粒，用蒸馏水溶解于小烧杯后转移至250 mL容量瓶，蒸馏水定容。将已定容的液体移至烧杯，加入浓盐酸不断搅拌，用pH计测定其pH，调节pH至8.2，贴上标签备用。
(14) DPPH溶液：称取0.394 g DPPH放置于小烧杯中加入10 mL无水乙醇溶解，放入10 mL的EP管中，贴上标签备用。需注意溶液必须现配现用，避光保存。
(15) EDTA-2Na溶液：称取0.9306 g EDTA-2Na放置于10 mL的EP管中溶解，贴上标签备用。
(16) 2 mM硫酸亚铁溶液：准确称取2.78 g硫酸亚铁放置于10 mL水的EP管中加入5 mL水溶解，贴上标签备用。
(17) 2 mM菲咯嗪溶液：准确称取4.92 g菲咯嗪放置于放置于10 mL水的EP管中加入5 mL甲醇（5 mM）溶液溶解，贴上标签备用。
(18) ABTS储备液：先配7 mM ABTS溶液，称取0.0960 g ABTS粉末，用蒸馏水溶解，25 mL容量瓶定容，贴上标签备用；再配140 mM K2S2O8溶液，称取0.3782g K2S2O8，用蒸馏水定容至10 mL；再次，5 mL ABTS溶液加上88 μLK2S2O8溶液，避光保存过夜，12~16小时测定（测定期，用无水乙醇或0.1 M pH7.4的磷酸缓冲液稀释至734 nm处吸光值为0.7±0.02），贴上标签备用。需注意加入氧化剂后，ABTS·+量减少，吸取值减少，因此要现配现用。
(19) Ferric-TPTZ试剂：300 mM pH3.6的醋酸缓冲液、溶于40 mM HCl 的10 mM TPTZ溶液、20 mM的FeCl3·6H2O溶液按体积比为10:1:1混合
(20) 10 mM DMPD溶液：称取209 mg DMPD,溶于10 mL的去离子水中，取10 mL溶液加入2 mL的0.1M pH6.3醋酸缓冲液，再加入0.2 mL的0.05 M氯化铁中，得到有颜色的自由基阳离子，贴上标签备用。需注意，该溶液要现配现用，室温保存不超过12 h。
(21) 6 mmol/L水杨酸钠溶液：称取0.24 g水杨酸钠，用水溶解，之后定容至250 mL的容量瓶中，贴上标签备用。
(22) 6 mmol/L FeSO4溶液：称取0.083 g FeSO4，用水溶解，之后定容至50 mL的容量瓶中，贴上标签备用。
(23) 6 mmol/L 过氧化氢溶液：量取61 μL 30%过氧化氢放入100 mL的容量瓶中稀释至刻度线，贴上标签备用。
2.4.2芦丁标准曲线的测定
将配制的芦丁标准溶液作为初始浓度。分别吸取1.0 mL、2.0 mL、4.0 mL、6.0 mL、8.0 mL标准品溶液分别加入标号为1、2、3、4、5的25 mL容量瓶中，蒸馏水对照为0号瓶，各加30%乙醇至12.5 mL。先加5%亚硝酸钠溶液0.7 mL，震荡摇匀后放置6 min；再加10%硝酸铝溶液0.7 mL，摇匀后放置6 min；之后依次加入浓度为1 mol/L的氢氧化钠溶液5 mL；最后用30%乙醇定容至25 mL，放置15-20 min。0号作空白对照调零，在510 nm波长下测量其余各瓶的吸光值(OD)。吸光值作为纵坐标，浓度(mg/mL)作为横坐标，绘制标准曲线图[20]。
2.4.3党参黄酮的提取与测定
称取党参粉末一定量，按提取：本实验说使用的党参黄酮，是通过超声波提取法所提取的，运用乙醇（平均浓度在50%）作为提取溶剂。乙醇体积分100％ ,料液比1：25（g／mＬ），提取温度70℃，提取时间5 h条件进行提取。
称取党参粉末0.5 g，共12份，分别装入同型号的试管中，将试管编号，之后分别用浓度为0%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、100%的乙醇提取，料液比为1:20，提取温度70℃，水浴锅内水浴3h。水浴期间，不时摇动试管。水浴结束后，将样品提取液放入离心机中以3000r／min的转速离心30 min，取上清液。吸取上清液4 mL于25 mL容量瓶中,测量不同料液比的样品中上清液中总黄酮的含量，并计算提取率[21-23]。每个因素反复三次。
样品中的总黄酮含量
C为所测溶液的吸光度值带入回归方程计算出的黄酮类化合物浓度（mg/mL）；
V为提取液的体积（mL）。
提取率（％）＝
M为样品质量（g）
2.4.4 党参总黄酮体外抗氧化活性的测定
2.4.4.1超氧阴离子清除能力的测定
采用邻苯三酚自氧化法，在2.4 mLTris—HCl溶液（ pH8.2） 中加入100 μL不同浓度（0 、0.0625 mg/mL、0.125 mg/mL 、0.25 mg/mL 、0.5 mg/mL 、1 mg/mL 、2 mg/mL）的待测液，混合后加入300 μL浓度为7 mmol/L的邻苯三酚，反映4 min后，加入1滴浓盐酸终止反映[24,25]。以蒸馏水做参比用石英比色皿在325 nm处测定其吸光值，三次反复，结果以超氧阴离子清除率(%)P1表达：

其中A0为空白吸光度，A1为待测液吸光度。
2.4.4.2过氧化氢(H2O2)清除能力的测定
取不同浓度的样品溶液0.5 mL加入到试管中，再加入3 mL 用的0.1 M磷酸盐缓冲液（pH7.4）配置的浓度为22 mMH2O2混匀后，在230 nm处测吸光值[26]。以浓度为横坐标，吸光值为纵坐标，求出清除率(%)P2：

其中As为加H2O2的吸光值，Ac为不加H2O2的吸光值
2.4.4.3羟自由基清除能力的测定
在标号的试管中一方面加入1 mL浓度为 6 mol/L的硫酸亚铁溶液，再加入2 mL浓度为6 mM的H2O2溶液，加入2 mL不同浓度的（0、7.8125 μg/mL、15.625 μg/mL、31.25 μg/mL、62.5 μg/mL、125 μg/mL、250 μg/mL、500 μg/mL ）VC溶液（或待测液），加入1 mL浓度为6 mM水杨酸钠溶液，摇匀，37℃恒温水浴30 min后以纯水作参比于510 nm处测定各吸光值[27,28]。结果以羟自由基的清除率（P3）表达：

As：硫酸亚铁+水杨酸钠+待测物+H2O2； Ar：硫酸亚铁+水杨酸钠+待测物+水；
A0：硫酸亚铁+水杨酸钠+水+H2O2
2.4.4.4ABTS·+清除作用
(1)制备7 mM的ABTS·+溶液，避光保存（现配现用）。分别取0、40、80、120、160、200 μL ABTS，用去离子水补足200 μL，于734 nm处侧吸光值，以ABTS浓度为横坐标，OD值为纵坐标，建立标准曲线。
(2)取100 μL不同浓度的样品分别加入到96孔板中，再加入ABTS·+溶液300 μL，混匀静置10或30 min后，于734 nm处测吸光值，以100 μL 50%乙醇溶液加入300 μLABTS·+溶液为空白[29]，并测定100 μL样品溶液+300 μL无水乙醇的吸光值。按下列公式计算清除率（P4）。

A0：100 μL50%乙醇溶液+300 μL ABTS+溶液后所测吸光值；At：100 μL样品溶液+300 μLABTS+溶液后所测吸光值：Ac：100 μL样品溶液+300 μL无水乙醇后所测吸光值
2.4.4.5 DMPD·+清除能力的测定
取不同浓度的样品或阳性对照50 μL加入96孔板中，加入DMPD·+溶液100 μL,10 min后，于505 nm处测吸光值[30]。以缓冲液的吸光值为空白，做三组平行，求清除率（P5）

Ac为DMPD·+初始浓度的吸光值；As为样品存在时的DMPD·+吸光值
2.4.4.6 DPPH清除能力的测定
(1)DPPH标准曲线的制作
制备0.1 mmol/L的DPPH无水乙醇溶液，避光保存（现配现用）。分别取0、40、80、120、160、200 μL DPPH，用无水乙醇补足200 μL，于510 nm处侧吸光值，以DPPH浓度为横坐标，OD值为纵坐标，建立标准曲线[31]。
(2)样品DPPH自由基清除率的测定
分别吸不同浓度的样品浓度100 μL，置96孔板的微孔中，加入100 μL的DPPH溶液，室温避光反映30 min，同时以100 μL DPPH溶液与100 μL 50%乙醇溶液为空白，在517 nm处测定吸光值[31]（P6），反复三次，求平均值。按下列公式计算

A0：100 μL50%乙醇溶液+100 μLDPPH溶液后所测吸光值；As:100 μL样品溶液+100 μLDPPH溶液后所测吸光值；Ac:100 μL样品溶液+100 μL无水乙醇后所测吸光值
2.4.4.7铁离子螯合能力的测定
吸取50 μL不同浓度（0、7.8125 μg/mL、15.625 μg/mL、31.25 μg/mL、62.5 μg/mL、125μg/mL、250μg/mL）的待测液（样品或EDTA-2Na溶液）分别加入到96孔培养板的孔中，再加入5 μL硫酸亚铁溶液(2 mM)，160 μL去离子水，室温需震荡反映5 min，加10 μL菲咯嗪溶液（5 mM，溶于甲醇），摇匀，室温反映10 min后，于562 nm处测定其吸光值[32-33]。进行三组平行实验，结果以铁离子螯合率（P7）表达：

A0为空白吸光度；A1为样品吸光度；A2为不加菲咯嗪时的吸光值
2.4.4.8总还原力的测定
取2.5mL不同浓度的待测液（样品或阳性对照）按浓度不同(0、7.8125 μg/mL、15.625 μg/mL、31.25 μg/mL、62.5 μg/mL、125μg/mL、250μg/mL、500 μg/mL)加入标号的试管中，依次加入2.5 mL磷酸盐缓冲液（0.2 mol/L ，pH6.6）和2.5 mL1%六氰合铁酸钾溶液，于50℃水浴保温20 min后，快速冷却；再加入2.5 mL10%三氯乙酸，以3000 r/min离心10 min，取上清液2.5 mL；依次加入2.5 mL蒸馏水，0.5 mL0.1%三氯化铁，充足混合，静置10 min后，在700 nm处测定吸光值[34。吸光值越大表达还原力越强（以蒸馏水作对比）。反复三次。
2.4.4.9铁离子还原抗氧化力的测定
吸取10 μL标准品或待测样品加入到96孔板中，再加入300 μL的ferric-TPTZ试剂，混匀，微板于37℃孵育，30 min后，于593 nm测吸光值[35-36]。
2.5数据解决
所有实验均反复三次，用Excel记录软件进行记录分析，数据以平均数±标准差（stand