多糖衍生物用于蛋白质复性及天然胶乳改性的研究.doc

中山大学博士后学位论文 多糖衍生物用于蛋白质复性及多糖衍生物用于蛋白质复性及天然胶乳改性的研究 姓名：陈继平 申请学位级别：博士后 专业：高分子化学与物理 指导教师：张黎明 摘要环糊精和温敏聚合物聚异丙基丙烯酰胺）（）对蛋白质的复性均有良好的促进作用，那么经改性后的环糊精衍生物能否更有效促进变性蛋白质的复性呢？为此，我们将氨基环糊精（一）和带末端羧基的聚一异丙基丙烯酰胺（）偶联得到了一种温敏一环糊精衍生物（），分别考察其在不同变性体系、不同。浓度、不同复性温度以及在表面活性剂十六烷基三甲基溴化铵（）存在下对溶菌酶的复性效果；通过与和的对比分析，揭示了分子中的环糊精空腔与链段的协同作用，并使用荧光光谱法进行了验证。实验结果表白：对盐酸胍变性溶菌酶的复性具有克制作用，但对尿素变性溶菌酶的复性具有促进作用；在常温下，的可使溶菌酶的复性率增长至，而直接稀释法仅为；对溶菌酶的复性温度应略小于的相转变温度（，。），高于这一温度时会由于发生相变而导致溶菌酶的复性率急剧减少；将在辅助溶菌酶复性一段时间（如）后再加入到复性体系，溶菌酶的复性效果更佳。在辅助溶菌酶复性的过程中，分子中的环糊精空腔与链段可以同时促进溶菌酶的复性，荧光光谱实验结果证实了这结论。针对天然乳胶（）品蛋白质过敏及乳胶制品的生物降解问题，考察了海藻酸钠、透明质酸及羧甲基纤维素的氧化产物氧化海藻酸钠（）、氧化透明质酸（）和氧化羧甲基纤维素（）对天然胶乳中的蛋白质的固定作用，对比了这三种氧化多糖对乳胶蛋白质的固定效果，分析了加入氧化多糖后蛋白质在乳胶膜中的分布情况，讨论了氧化多糖含量以及氧化多糖分子中的醛基含量对乳胶膜的力学性能、热降解及生物降解过程的影响。实验结果显示，三种氧化多糖对天然乳胶中蛋白质都具有很好的固定作用；以为研究对象表白，乳胶膜中含量越多，乳胶膜中水溶性蛋白质（）析出率越低，当占干乳胶的时，乳胶膜的溶出率即趋近于；中醛基含量越多，溶出率越低，当醛基含量为时，仅用（以固含量计）的可使乳胶膜中形孓晰出率低于眈。未加的乳胶膜在土埋天后的质量损失率为叭左右，之后质量不再发生明显改变；而具有的乳胶膜在土埋天后质量继续下降，其质量损失率超过乳胶中非橡胶成份所占的百分率，且用量越大，乳胶膜的质量损失率越大。同时，氧化多糖对乳胶膜的力学性能无明显的影响。关键词：一环糊精，聚（一异丙基丙烯酰胺），溶菌酶，复性，天然胶乳，多糖衍生物，蛋白质固定，降解 第一章温敏环糊精衍生物用于蛋白质复性的研究 引言 由于环糊精分子中具有疏水性空腔，客体分子能从宽口端进入其分子空腔形成包络化合物。因此在使用表面活性剂辅助蛋白质复性时，经常需要加入环糊精以剥离与蛋白质形成胶束的表面活性剂或去污剂【。等人【发现，向盐酸胍变性的碳酸脱水酶（）复性稀释液中加入适量一环糊精（）可使其复性率超过。他们认为这是由于环糊精的疏水性空腔与蛋白质复性中间体的疏水性位点发生了互相作用。聚烈异丙基丙烯酰胺）（）是一种具有温度敏感性的聚合物，在一定温度下能发生亲水疏水（）逆转变，在水溶液中表现为一种可逆的溶解沉淀行为【（在凝胶中则表现为一种可逆的溶胀收缩行为【】）。发生这一转变时的温度即为相转变温度（，），而水溶液的在附近，。曾被用于蛋白质的复性研究【。如等人【将用于辅助的复性，发现其复性效率比更高，使用可使经盐酸胍变性的一的活性率提高，而只能提高。等人【】曾采用，圆二色谱和荧光光谱等方法研究了对尿素变性溶菌酶的复性机理，认为对溶菌酶的复性作用是由于增强了蛋白质的二级结构并克制了溶菌酶的聚集作用，从而促进蛋白质的复性。将与耦联，制备具有温度敏感的一环糊精衍生物（一）重要被用于药物释放系统的研究协。虽然等人四曾将该体系用于溶菌酶的复性，但偶联产物中的结构单元重要用于剥离表面活性剂，而未考察其对溶菌酶的复性作用。结合等人】的研究，我们认为，用于辅助蛋白质复性时，其分子中链段及环糊精的疏水性空腔应当可以同时促进溶菌酶的复性，即具有协同辅助蛋白质复性的作用。为验证这一假设，本研究采用端基耦联的方法，合成了具有温度敏感的衍生物（），比较研究了及其合成中间产物：氨基一一环糊精（）、带末端羧基的聚（一异丙基丙烯酰胺）（）对尿素变性溶菌酶的复性效果，并采用荧光光谱分析了 对溶菌酶的复性机理；同时探讨与十二烷基三甲基溴化铵（）结合使用时对溶菌酶复性的协同作用。实验部分 原料与试剂 异丙基丙烯酰胺（，公司，美国），正己烷重结晶；巯基丙酸（，公司，美国）；（一二甲氨基丙基）一乙基碳二亚胺（，公司，美国）；偶氮二异丁腈（，上海试四赫维化工有限公司），甲醇重结晶纯化；一环糊精（上海伯奥生物科技有限公司），使用前于干燥；对甲苯磺酰氯（中国医药集团上海化学试剂公司）；溶菌酶、盐酸胍、二硫苏糖醇（订）、还原型谷胱甘肽（）、氧化型谷胱甘肽（）和微球菌均购自美国公司。十六烷基三甲基溴化铵（）购自日本公司；其余试剂均为分析纯。透析袋（，华美生物工程公司上海分公司）。样品溶液用去离子水配制。的制备与表征 和参，照等人的方法，在儿无水吡啶中依次加入对甲苯磺酰氯，于、搅拌条件下反映。在减压蒸馏出吡啶后，向反映混合物中加入水。过滤，水洗次除去吡啶，真空干燥得到白色粉末。将上述制备的白色粉末与无水乙二胺在反映。在减压蒸馏出无水二乙胺后，向油状物中加入丙酮。过滤，将沉淀溶于甲醇水溶液（体积比：）。往所得溶液中加入丙酮，得白色沉淀。过滤，真空干燥。产品为白色粉末。用核磁和红外光谱进行表征。的制备与表征参照等人的方法，将和链转移剂溶解于甲醇中。通氮气，加入引发剂，在氮气保护下，于”、搅拌条件下反映。减压蒸馏出大部分甲醇，用丙酮正己烷体系纯化两次。将所得沉淀过滤并真空干燥。产品为白色粉末。用核磁和红外光谱进行表征。的制备与表征参照等人的方法，将溶解于蒸馏水中，加入。调整溶液值为，加入，在室温下搅拌反映。所得溶液装入到透析袋（），用水透析以除去未反映的与小分子物质。溶液冷冻干燥得到一种淡黄色粉末。将所得的淡黄色粉末分散在中，用（体积比：）沉淀，真空干燥。所得产品为黄色粉末。用核磁和红外光谱进行表征。溶菌酶的变性参照等人【】的方法，将一定量的溶菌酶分别溶于盐酸胍变性缓冲液和尿素变性缓冲液（盐酸胍变性缓冲液：?、?盐酸胍和 一硫酸，值；尿素变性缓冲液：、?尿素、?”，值和?）置于。下反映，使溶菌酶彻底变性和还原，得到浓度为?。的变性溶菌酶溶液，放置于。冰箱中保存备用。溶菌酶复性将浓度为的一、或溶液分别缓慢加入到浓度为的溶菌酶中，复性后，加入复性缓冲液至溶液总体积为，在室温下（）继续复性。不含任何辅助剂时溶菌酶的复性为空白样。复性缓冲液为为的、晡溶液，该溶液还具有和。浓度对溶菌酶复性的影响、将和浓度为溶液分别缓慢加入到浓度为的盐酸胍变性溶菌酶和尿素变性溶菌酶溶液中。复性后，加入复性缓冲液至溶液总体积为，在室温下（）继续复性。不含任何辅助剂时溶菌酶的复性为空白样。复性温度对溶菌酶复性的影响将浓度为雕 溶液缓慢加入到浓度为的尿素变性溶菌酶溶液中，然后将溶液在某一个特定温度条件下（、”、”、”、。或”）复性后，加入复性缓冲液溶液总体积为，继续复性。表面活性剂对溶菌酶复性的影响将浓度为的溶液和溶液按照以下方式加入到浓度为的尿素变性溶菌酶溶液中：）仅加入溶液；）溶液和溶液同时加入；）在加入溶液后再加入溶液。将这些溶液在室温（）下放置。以不含任何辅助剂时溶菌酶的复性为空白样。相转变温度（）的测定通过测定浓度为的和溶液在的吸亮度值拟定聚合物的相转变曲线。所用仪器为一分光亮度计（中国，北京）。吸亮度一浓度曲线拐点的横坐标值即为该聚合物的平均值。溶菌酶活性的测定依据提出的以微球菌为底物的方法测定溶菌酶的活性。将微球菌溶于为的一缓冲液中，使该溶液在的吸亮度为。将溶菌酶溶液加入到底物溶液中，于混合，每隔测定一次所得悬浮液在的吸亮度，共测定次。所得吸亮度与时间的关系曲线为一直线。将该直线的斜率与同浓度的未变性溶菌酶溶液所得的直线进行对比，即可得到溶菌酶的复性率，结果用比例表达【。荧光光谱分析用缓冲液配制浓度分别为、汞拘、阿溶液，用黼表达。另用缓冲液配制浓度为溶菌酶溶液，用拗表达。将黼和黼混合，所得溶液用一荧光分光计（日本）扫描。设立激发和发射间距为。在激发蛋白质溶液，记录”范围内溶液的发射光谱。结果与讨论 核磁和红外表征（）（？，）（孓）图的合成路线一。一、铺。厂、一人让小懈洲黜图、和的红外谱图，咚”入二上几 叫汹、八一、，、，一，晦、人人；人（）图、和一的核磁谱图的合成路线如图所示。一方面糖坏上的羟基氢被磺酰基取代，然后磺酰基被乙二胺的氨基取代生成氨基化的环糊精，最后在水溶液中，氨基环糊精与带末端羧基的经催化缩水偶合得到。、带末端羧基的以及最终产物的红外光谱图分别如图、图和图所示。在口红外谱图（图）中，锄（，）峰相应为上的羟基伸缩振动峰。和锄峰相应为酰胺和酰胺的吸取（来自结构单元）。伽是一个很强很宽的谱带，相应为、（涉及醇羟基与羧羟基）的总吸取。、一一以及的核磁谱图分别如图、图和图所示。在这三种结构中，各氢的化学位移分别为，科（，（）（，一），（，?），（，一），（，一一）（，）。由图看出，既存在的特性峰，也存在的特性峰。通过、以及红外及核磁谱图的对比，证明的末端羧基已成功与的氨基发生酰胺化反映。和弘的温敏性质 浓度为的和水溶液在处的吸亮度随温度的变化如图所示。随着溶液温度的升高，和水溶液的吸亮度分别在溶液温度在或”时急剧升高。根据前述对的定义，此温度即相应为和的。在其附近会发生可逆的亲水疏水转变，当溶液温度低于时表现为亲水性，依靠氢键作用与水互溶：当溶液温度高于时，由亲水性转为疏水性，与水脱离并发生聚集，从而导致溶液的吸亮度增大。图显示，的为”，与文献报道接近【】。与亲水性基团结合以后会导致其升耐，而氨基改性表现为亲水性，所以的略高于，为”。至兰。图和的相转变曲线 肛对溶菌酶的复性效果 将不同浓度的 分别用于盐酸胍变性溶菌酶和尿素变性溶菌酶的复性，其活性收率如表所示。从表看出，随着复性体系中浓度的增大，盐酸胍变性溶菌酶的活性率逐渐减小，从（直接稀释法复性）减，至（浓度为）；而尿素变性溶菌酶复性的活性率则逐渐增大，从（直接稀释法复性）增至（浓度为）。即在盐酸胍变性溶菌酶的复性体系中，不仅不能促进溶菌酶的复性，反而对其复性有克制作用。而与此相反的是，对于尿素变性溶菌酶的复性体系，对溶菌酶的复性具有较好的促进作用。导致这一实验现象的因素有待进一步研究，在后续实验中，为了验证对溶菌酶的复性作用，我们以尿素变性溶菌酶作为研究对象。表不同浓度的对不同变性体系变性溶菌酶的复性 争、或对溶菌酶的复性效果在，变性溶菌酶（尿素变性溶菌酶，以下同）最终浓度为时，将的、和溶液分别用于辅助溶菌酶复性，其复性效果如图所示。使用辅助溶菌酶复性时，溶菌酶的活性率为，使用辅助溶菌酶复性时，其活性率为，而使用辅助溶菌酶复性时，其活性率为。三者均高于直接稀释法复性所得的活性率。这说明、和 对尿素变性溶菌酶的复性均有促进作用，而的促进作用最大。作为一种蛋白质的复性辅助剂，环糊精不仅可以克制蛋白质的聚集作用，同时还能有效地促进蛋白质折叠复性至其天然状态以恢复其活性瞄粕。伸展的或部分折叠的中间体疏水性表面与环糊精疏水性空腔之间的互相作用减少了分子间的疏水作用力，从而有效地消除或克制了蛋白质的聚集作用。而则通过其疏水性链段与蛋白质复性中间体氨基酸的疏水性侧链之间的疏水作用促进蛋白质的复性【。显然，在本实验中，分子中环糊精空腔和口一乍旷引乍疏水性链段的同时对溶菌酶的复性起到了辅助作用。即 分子中的匿疏水性空腔和疏水性链段对溶菌酶的复性具有协同作用。“；嚣象器貉瑟簟鼍？绻爹蓉?誓瞄：。矗矗。赞黟一蘑琵一筑参雠。罗 争对溶菌酶的复性机理溶菌酶分子中具有能发出内源荧光的色氨酸及酪氨酸。当蛋白质与物质发生物理碰撞或化学结合以后，蛋白质的荧光会发生一定的变化，这一规律常被用于研究蛋白质与物质之间的互相作用机理硎。图 是在变性溶菌酶溶液中加入一定量的、或后溶液的荧光光谱图。由图看出，溶菌酶溶液的荧光光谱曲线的形状未发生明显变化，但是荧光强度存在一定差异：加入具有结构单元的和时，随着辅助剂浓度的增长，溶液的荧光强度逐渐减少，且在辅助剂浓度相同时，加后荧光强度减少幅度比 减少幅度更大（图（，）；而对于不含结构单元的，即使辅助剂的浓度高达时溶液荧光强度的变化仍不明显（图（）。这表白对于溶菌酶而言，和是良好的焯灭剂，而不具有荧光卒灭作用。，）图不同浓度的、或加入变性溶菌酶溶液后的荧光光谱图。；，；，。，和的浓度分别为；假如溶菌酶被包络在或的的疏水性空腔中，那么由酪氨酸和色氨酸产生的天然荧光就也许被屏蔽，从而导致溶菌酶荧光强度减少。特别地，当浓度为时，溶菌酶的荧光强度已接近于，表白溶菌酶分子基本上都被包络进的疏水性空腔中。相对于相同浓度的而言，由于中链段的空间位阻效应以及相对较低的浓度，可以包络溶菌酶的数量相对少：，所以其荧光强度的减弱限度略小于。复性体系的荧光光谱法实验证明了分子中 结构单元对溶菌酶分子的包络作用。不同温度时溶菌酶的复性不同温度下的对溶菌酶的复性效果如图所示。从图中看出，随着温度的升高，溶菌酶的活性率逐渐增大。当温度达成时，溶菌酶的活性率最大。但继续升高温度，溶菌酶的活性率反而减少。结合的相转变温度（见图），发现溶菌酶的活性率最大时的温度与的相转变温度接近。这是由于，当温度达成的相转变温度时，会由亲水性转变为疏水性而发生聚集，从而导致溶菌酶的活性率急剧下降。因此，在将用于辅助溶菌酶复性时，复性温度应低于的。邑勺名?一 矗州口一。篮二 鬻隧艮甏簪：引妇，（）图不同温度下辅助溶菌酶复性的复性率（溶菌酶最终浓度为，的浓度为）和联合辅助溶菌酶复性将和按三种不同的添加方式：（）仅加入；（）一和同时加入；（）加入，复性后再加入，继续复性。溶菌酶的复性率如图所示。从图看出，与同时加入到变性溶菌酶中进行复性时，溶菌酶的复性率低于单独使用或，而在复性后再加入，溶菌酶的复性率高于单独使用或。将一与同时用于辅助溶菌酶复性时，的疏水链段与溶菌酶分子竞争进入环糊精的疏水空腔，但由于的疏水链段的疏水性强于溶菌酶分子，所以会优先进入环糊精的空腔内内【，这一竞争过程一方面导致部分环糊精的空腔被占据，使可以容纳溶菌酶的环糊精空腔减少；另一方面也导致溶液中的浓度大大减少，从而减少对溶菌酶的复性率。所以与同时用于溶菌酶复性时，其复性效果较单独使用和差。而在使用复性后，溶菌酶的复性过程已基本上完毕，此时再加入也许使部分未复性的溶菌酶在环糊精的疏水性空腔的疏水作用下继续复性，从而使最终溶菌酶的复性率高于单独使用的复性效果。实验表白，按这种方式（第三种加入方式）对溶菌酶进行复性，与具有协同作用。墓甍葺名莲图采用不同的添加方式一和对溶菌酶的复性效果。（）：仅加入；（）：与同时加入复性液；（）：复性后再加入当复性完毕以后，运用相变功能，通过升高温度可将从溶菌酶分子上剥离出去，从而为溶菌酶的后续纯化带来便利。同时，在剥离表面活性剂以后（或单独使用），同样可运用其温敏相变功能儿实现，的循环使用（图）。图的循环使用示意图本章小结 及其合成中间产物 和 对尿素变性溶菌酶的复性过程均有促进作用，而对盐酸胍变性溶菌酶的复性过程却具有克制作用，不能用于辅助盐酸胍变性溶菌酶的复性。分子中的疏水性空腔及链段可以共同促进溶菌酶的复性，具有协同辅助溶菌酶复性的作用，荧光光谱的研究结果证实了这一结论。的浓度对溶菌酶的复性效果有一定的影响，当溶菌酶的最终浓度为时，的 对溶菌酶的复性效果最佳：而复性温度应当控制在其以下。与结合用于辅助溶菌酶的复性时，最佳在作用一段时间后（约）再加入复性体系，否则会对溶菌酶的复性产生不利影响。由于 具有温敏相变功能，在复性完毕以后，可通过升高体系温度实现（或包络了的）从复性体系中分离，为溶菌酶的后续纯化带来便利。并实现的循环使用。第二章氧化多糖衍生物用于天然胶乳改性的研究 引言 天然橡胶乳液州）是一种生物合成的高聚物水基型胶体体系，以聚顺式一异戊二烯为主体，并有十几种组分的物质。其重要成分为橡胶烃、水、非胶物质，其中非胶物质重要由蛋白质、类脂物、丙酮溶物、水溶物、无机盐等组成。天然胶乳具有优异的工艺操作及物理性能，其湿凝胶强度高、弹性大、蠕变小等，就其通用性而言，目前尚无其它材料能替代，仍然是医务工作者隔离病毒及感染性微生物的最佳选择。上世纪以来，由于人们对防止艾滋病、肝炎等病毒感染的意识增强，导致了乳胶制品特别是手套和避孕套需求量的急剧上升，但不久人们发现使用乳胶制品会引发一种过敏症，其最先的症状是荨麻疹，表现为皮肤瘙痒、发炎、起疙瘩、长水泡等症状，严重时会引起过敏性休克、甚至死亡【】。最初人们认为是乳胶制品生产过程中加入的助剂，如秋兰姆、琉基苯并噻唑、氨基甲酸盐等引起的过敏症，后来对乳胶制品的过敏性进行进一步的研究，发现天然胶乳自身具有的水溶性蛋白质（）是引起过敏的重要因素【。鲜胶乳中蛋白质的含量占胶乳重的，其中约被橡胶粒子所吸附，是构成粒子保护层的重要物质，约存在于胶乳底层的液体中，共余部分则溶解于乳清。这些蛋白质是决定橡胶粒子胶体稳定性的重要因素【，。为解决乳胶制品中水溶性蛋白的过敏性问题，目前重要采用的方法是减少乳胶中的水溶性蛋白的含量，国际上普遍认为，当乳胶手套中水溶性蛋白质质量分数小于时，对胶乳过敏的人在皮肤刺激实验中几乎不显示过敏反映，但大多数国家规定其质量分数应小于。减少天然胶乳中水溶性蛋白质比较成熟的方法有：（）氯化法，：运用浓盐酸与次氯酸钠反映释放出的氯气与发生交联和环化反映，在乳胶表面形成防止蛋白质迁移的阻断层。同时使蛋白质变性而使其难以溶解。氯化法是减少胶乳手套水溶性蛋白质含量的一种非常有效的方法，也是目前工业上普遍采用的办法。但氯化解决产生的氯化废水会对环境导致污染。（）沥滤法：有湿凝胶沥滤和干胶膜沥滤。湿凝胶沥滤是指在干燥前洗涤附着在模具上的湿凝胶，干胶膜沥滤是指在胶膜干燥和硫化后洗涤附着在模具上的胶膜。（）多次离心法【】：由于胶乳中的非橡胶物质绝大多部分分布在乳清相和小胶粒中，通过反复加水稀释胶乳和离心浓缩可制成非橡胶物质含量极低的胶乳。（）酶解决法【：运用蛋白酶分解破坏天然胶乳涉及胶粒表面保护层中的蛋白质，将分解出来的蛋白质转变成水溶性物质，再通过离心分离除去或在沥滤中洗掉，从而大大减少天然胶乳制品中的含量。（）辐射硫化法】：使用射线或电子束对离心浓缩胶乳进行辐射硫化，稀释后再离心可得到蛋白质含量很低的低蛋白质胶乳。上述方法虽然可以有效减少天然胶乳中的水溶性蛋白质含量，但一方面操作复杂，生产成本高，且有的方法还会对环境导致污染；另一方面由于减少蛋白质含量会影响天然胶乳的稳定性、生胶的干燥速率、减少生胶的抗氧化性能，同时对乳胶制品的力学性能也有一定的不利影响【。因此，通过减少胶乳中水溶性蛋白质（）含量的方法解决乳胶制品皮肤过敏问题并不是一个最佳的选择。本研究初次提出通过固定蛋白质的方法来解决乳胶制品蛋白质过敏问题。即在天然胶乳中添加可生物降解的、具有良好生物兼容性的氧化多糖（本研究选取了海藻酸钠、透明质酸和羧甲基纤维素三种多糖），运用氧化多糖分子上的醛基与蛋白质分子上的氨基的交联，增大蛋白质的分子量，使蛋白质失去水溶性，从而将蛋白质固定在乳胶膜内。具体的实验内容涉及：氧化海藻酸钠、氧化透明质酸和氧化羧甲基纤维素的制备和表征；三种氧化多糖对乳胶蛋白质的固定效果比较；氧化多糖对乳胶中蛋白质分布的影响；添加氧化多糖后，乳胶膜的热重、力学性能及生物降解性能的研究等。其中，水溶性蛋白质的析出实验通过改善的方法进行表征；乳胶膜蛋白质的分布情况通过考马斯亮蓝染色法进行评价；生物降解性能通过室内土埋法进行考察。实验部分 原料与试剂 高氨离心浓缩天然胶乳（，），其部分指标见表。海藻酸钠（，天津大茂化学试剂厂），福林酚试剂（，北京鼎国生物技术有限责任公司），脱氧胆酸钠（，心上海伯奥生物技术有限公司），三氯乙酸（，天津福晨化学试剂厂），磷钨酸（，幔国药集团化学试剂有限公司），考马斯亮蓝（，上海伯奥生物技术有限公司），盐酸羟胺（天津天新精细化工研发中心），其他试剂均为分析纯，水为去离子水。表高氨浓缩天然胶乳的部分指标（厂家提供）氧化多糖的制备及表征 按照】所报道的方法制备氧化海藻酸钠（）。将海藻酸钠（曲溶于蒸馏水中，然后在搅拌下加入高碘酸钠，用蒸馏水将溶液稀释至总体积。高碘酸钠的加入比例分别为，。避光反映后，加入，醇，继续搅拌终止反映。加入氯化钠和乙醇使海藻酸钠氧化产物沉淀出来。将所得沉淀重新溶于去离子水，用去离子水透析以减少最终产品中的含量和高碘酸钠含量。产物冷冻干燥得到一种白色产品。用进行表征。参照上述方法制备和表征氧化透明质酸（）和氧化羧甲基纤维素（）。醛基含量的测定在多糖的氧化过程中，糖环单元中的和位置的羟基易转变为羰基。生成的醛基可与盐酸羟胺发生希夫碱反映转变为含氮衍生物（肟）。通过与溶液的酸碱中和反映可测定在希夫碱反映过程中生成的，并通过如下关系计算醛基含量。相关的反映式（以海藻酸钠为例）和计算公式如下：争（）一（）（）（）【伽】（肌。）：（）其中，【为待分析的中醛基含量，；为滴定时所消耗的溶液的体积，单位；为待分析的的质量，单位。用一（，），采用压片法。扫描室温下的红外光谱。扫描范围为，间距为 乳胶膜的制备 将高氨离心浓缩天然胶乳（）与一定量的氧化多糖氨水溶液混合，然后将混合物加入到直径为的培养皿中，在室温下水平放置天，待胶乳凝固以后于”干燥成膜。乳胶膜中氧化多糖含量分别为，和。由天然胶乳（）与氨水溶液（）形成的不含氧化多糖的乳胶膜为空白样。在成膜过程中乳胶膜朝向培养皿底面的那一面被定义为乳胶膜的底面（），另一面为顶面（）。水溶性蛋白质含量及分布 采用改善的方法【，运用试剂测定乳胶膜中水溶性蛋白质（）含量，并按照以下公式（）和（）计算：（）黑：，（）（）这里，为抽提液（为的磷酸盐缓冲液）的体积，；是从标准曲线上测得的蛋白质浓度，；为浓缩因子；为被抽提的乳胶膜质量，；为溶解蛋白质沉淀时所用溶液的体积，。通过蛋白质染色法考察乳胶膜中蛋白质的分布情况。制备大小为的膜样，浸入盛有染色液（考马斯亮蓝，甲醇，冰醋酸，蒸馏水）的培养皿中，置于摇床上每隔将乳胶膜样翻转一次，染色。染色完毕后用脱色液（甲醇，冰醋酸，蒸馏水）对乳胶膜样进行脱色，脱色总时间为，每隔将膜样翻转一次并重新加入新的脱色液。用去离子水冲洗脱色后的乳胶膜样，用滤纸吸干膜样表面的水分，对染色的乳胶膜样的顶面、底面及侧面拍照。力学性能的测试 根据，用（）自动拉力机测定了室温下乳胶膜的拉伸强度（弼）和断裂伸长率（）。剪取乳胶膜测试样（），用夹具夹持固定。夹具的初始间距为，拉伸速度为。热降解性能分析 采用一型热重分析仪于氛围测量乳胶膜的热失重曲线。测量范围为，升温速率为，保护气的流量为，载流气的流量为。测试前将复合膜于下真空干燥。室内土埋降解性能分析 根据描述的方法【，通过监测乳胶膜质量的变化分析膜的降解情况。将氧化海藻酸钠含量不同的乳胶膜（海藻酸钠含量分别为：，和叭）剪成块实验所需的面积的条状样片，烘干至恒重，记录质量州）。将取来的普通园艺土，仔细去除其中的板结土块、植物残片等杂物，然后用孔径为（目）的筛子过筛后放入自制的塑料容器中，将降解膜片垂直埋入土壤中，并保持土壤疏松及瓶内外空气循环流通，用去离子水保持潮湿，放置于环境温度和湿度的条件下，定期取出一个样品，将其泡入去离子水中，沉淀泥浆，洗涤、过滤、烘干、称重，记录质量（）。按下式（）计算乳胶膜的质量损失率（，），绘制降解曲线。，：（）其中，和分别为降解前后乳胶膜样的质量，；为土埋的时间，；，为土埋天后膜的质量损失率。结果和讨论 氧化多糖的表征（。）图、和的光谱。处为醛基的伸缩振动峰表多糖与高碘酸钠按不同的摩尔比（，多糖，。分别为、和）氧化得到的氧化多糖的醛基含量在避光的条件下将氧化多糖溶液用高碘酸钠氧化，多糖和高碘酸钠按照不同的氧化比例反映后得到的不同氧化限度的氧化多糖的醛基含量见表。数据显示，氧化多糖的醛基含量与高碘酸钠的用量成正比。图显示的是按高碘酸钠的加入比例为氧化得到的三种氧化多糖的红外谱图。从红外谱图中看出，三种氧化多糖红外吸取峰中在。处出现了醛基的的伸缩振动峰，表白多糖已成功被氧化为氧化多糖【引。氧化多糖乳胶膜中蛋白质的析出率以及乳胶膜力学性能的比较 取一定量醛基含量约为 的、和（即按反映时多糖与高碘酸钠的摩尔比均为氧化得到的氧化多糖）与一定量的天然胶乳共混，得到的乳胶膜蛋白质的析出率及乳胶膜的力学性能如表 所示。从表中看出，水溶性蛋白质的析出率按对比样、和的顺序逐渐减小，表白、和对蛋白质的固定效果为，即效果最佳，且三种氧化多糖均好于对比样；相对于未加氧化多糖的乳胶膜，添加了氧化多糖的乳胶膜的拉伸强度和断裂伸长率均未发生明显变化。以上实验数据表白，本研究所制备的三种氧化多糖都能有效地固定蛋白质。同时对乳胶膜的力学性能影响不大。但在这三种氧化多糖中，对蛋白质的固定效果最佳，另一方面是，然后是。但由于使用后，乳胶膜的颜色泛黄，呈棕黄色，且含量越高，乳胶膜的颜色越深。而透明质酸的价格偏高，在工业应用时会增长生产成本。因此，在工业应用时，建议使用固定天然乳胶中的蛋白质。在本研究的后续实验部分我们也以为研究对象进行研究。表不同氧化多糖乳胶膜水溶性蛋白质的析出率及力学性能 水溶性蛋白析出率及其在乳胶膜中的分布 用改善的法测定的不同含量的乳胶膜水溶性蛋白质析出情况见图。图（）为固定的醛基含量（醛基含量为），改变用量时水溶性蛋白质的析出率。由图（）看出，随着含量的增长而急剧减小，当在乳胶膜中的含量为时，已下降至。图（）是在固定用量（叭）的情况下，将不同醛基含量的加入胶乳后形成的乳胶膜中水溶性蛋白质的析出率。从图中看出，随着醛基含量的增大而减小。特别地，当的醛基含量为时，减小至眈，这个数值已低于乳胶蛋白质致敏的最低蛋白质允许含量【。实验结果表白，与乳胶膜中的醛基含量是直接相关的，说明乳胶中的与间发生了互相作用。、）功、一，乱霎一用量（）图（）（醛基含量为曲的用量和（）醛基含量（用量为叭）与水溶性白质析出量的关系与乳胶的互相作用可用于解释的用量所导致的乳胶膜中的不同。海藻酸钠糖环上，位上的羟基被高碘酸钠氧化以后，、间的发生断裂，并形成缩醛或两个醛基，从而生成大量可以反映的活性基团（图，）。天然胶乳的为，在此条件下，乳胶中蛋白质的氨基以自由的形式存在，有助于与醛基发生希夫碱反映将两个分子交联起来（图，）。由于用于制备的海藻酸钠是一种分子量约为，的天然多糖。因此，乳胶蛋白质与海藻酸钠交联以后，会由于蛋白质分子量的急剧增大而导致其水溶性减少，从而克制蛋白质从乳胶膜中析出。帅一焉蓐吐州图 的制备及其与蛋白质的互相作用示意图通过考马斯亮蓝染色的方法考察了乳胶中蛋白质的分布情况。染色后的乳胶膜见图，其中蓝色的区域代表蛋白质的分布区域，颜色越深表白蛋白质的分布越集中。乳胶膜内部蛋白质的分布情况是通过乳胶膜的侧面蛋白质的分布表征的。如图（）显示，在未含的天然乳胶膜中，仅仅只有乳胶膜的上层表面（）为蓝色区域，其他各面均为白色。说明蛋白质仅分布在乳胶膜的上层表面。这是由于在成膜的过程中，蛋白质会逐渐迁移并聚集到乳胶膜的表面四。图（）显示的是天然乳胶膜与加入占乳胶固含量（醛基含量）时乳胶膜的染色情况。从图中看出，染色后具有的乳胶膜样的六个面均观测到蓝色，且顶面（）的蓝色比对比样浅得多?说明在具有的乳胶膜中蛋白质是均匀分布的。这是由于通过蛋白质与间的交联反映己经将蛋白质固定在乳胶膜内部，从而阻止了成膜过程中蛋白质的迁移。！芒匝亟匠亘亟协蓟，醛基含量为曲图蛋白质在乳胶膜中的分布。乳胶膜不舍：乳胶膜含 含量及醛基含量对乳胶膜力学性能的影响一零一仍西一山仂仂了一互卫一（）一零一毋一山价了一暑卫一（）图（醛基含量为）的用量（）和（用量为：）醛基含量（）与乳胶膜力学性能的关系醛基含量相同而用量不同的孚胶膜的力学性能测试图如图）所示。在醛基含量相同的情况下，随着乳胶膜中含量的增长，乳胶膜的断裂伸长率略有减少，拉伸强度略有增大。不同含量的乳胶膜的拉伸强度和断裂伸长率的变化范围为和。如图（）所示，中醛基含量对于乳胶膜的力学性能的影响与图（）中得到的规律是近似的。不同醛基含量的乳胶膜的拉伸强度和断裂伸长率的变化范围为 和，即的加入未对乳胶膜的力学性能产生明显影响。乳胶膜的热降解过程分析（。）图不同含量的乳胶膜的曲线图不同含量的乳胶膜的曲线如图所示。从图中曲线看出，乳胶膜在左右发生剧烈热降解。虽然在”期间，乳胶膜的质量一直呈下降的趋势，但在范围内（图），随氧化海藻酸钠的用量不同，乳胶膜质量下降的限度不同：氧化海藻酸钠的用量越大，乳胶膜质量下降的限度越大。这是由于在此温度下，海藻酸钠发生了氧化分解，并部分碳化，从而导致乳胶膜质量的减少【】。乳胶膜在”左右分解完全，总降解率为。不同含量的乳胶膜的如图所示。从乳胶膜的曲线）看出，乳胶膜在。时乳胶膜有个质量下降峰（图），该峰的强度与海藻酸钠的用量呈正比关系，表白此时质量的下降与海藻酸钠有关，相应于是海藻酸钠的裂解温度。，、零、一（卜。图不同含量的乳胶膜的曲线图乳胶膜的室内土埋降解过程瓣水转删峰土埋时间（天）图不同用量的（醛基含量为）乳胶膜在天内的质量损失率通过测量土埋后乳胶膜片的质量损失率评价了乳胶膜在土壤中的降解情况。占乳胶固含量分别为，和，的（醛基含量为）乳胶膜在土埋天内的质量损失率如图所示。从乳胶膜土埋天内的质量损失率看出，随着土埋时间的延长，乳胶膜的质量损失率增大。不同含量的乳胶膜在土埋起始的天内质量下降限度没有明显的差别，但天以后，含量越高，乳胶膜的质量损失率越大，显示出了含量对乳胶膜质量损失的影响。至天后，未加的乳胶膜的质量损失率保持在左右，而加入的乳胶膜的质量损失率均超过，且随着土埋时问的延长，其质量损失率继续增大。当土埋时间至天时，含的乳胶膜质量损失率达成，所损失的质量超过天然乳胶中非橡胶物质的固含量（如表所示）。在土埋降解实验中，将膜样从土壤取出时，可观测胶膜样上有霉菌附着；将这牡乳胶膜样千操后，霉菌生长的地方颜色变深。不同含量的乳胶膜在犬时的降解效果如（曲所示。古量越高，乳胶膜表面孔穴越多，乳胶膝样颜色越探。即降解过程中膜样上的霉菌越多。含的乳胶膜在不同土埋时日的降解效果如图（）所示。随着土埋时问的延长，乳胶膜片上孔穴增长，霉萤生长越致密。结合斟中的不同乳胶膜的质量损臾率可知乳胶膜的质量损失是弓霉菌的生长相关的。羽、譬；）图不同用量的（醛基含量为，）乳胶膜在天内的降解效粜（）及刖试样在不同时叫的降解效果（）依据表所水的乳胶的组成玎知。天然乳胶膜中的非橡胶纽分约为且它们比橡胶组分更易于发生降解。从土埋天后天然乳胶膜的质量损失率接近（图）可知，在土埋过程中发生降解的应为天然乳胶中的非橡胶成分。对于具有的乳胶膜而言，在土埋天后它们的质量损失率均超过，且最高可达。这说明随着土埋时间的延长，具有的乳胶膜中的橡胶成分也开始发生分解。即的加入对于乳胶膜的降解有促进作用。这是由于海藻酸钠是一种具有良好的生物兼容性的天然聚多糖，很容易被微生物所降解】。在乳胶膜中加入以后，由于的存在有助于土壤中微生物的生长及聚集，这些微生物也许会促进乳胶膜的降解【。由于在乳胶膜中分布均匀（见），因此，随着土埋时间的延长，在和乳胶膜逐渐降解过程中会形成大量孔穴。这会增长乳胶膜降解过程中生长的霉菌与乳胶膜的有效接触，从而促进具有的乳胶膜的降解。本章小结 本研究制备了氧化海藻酸钠、氧化透明质酸及氧化羧甲基纤维素三种多糖衍生物，考察了它们对乳胶蛋白质的固定效果及对乳胶膜降解性能的影响。研究结果表白在天然胶乳中添加很少量的这三种天然多糖衍生物即可有效地固定天然胶乳中的蛋白质，并且对乳胶膜的力学性能没有明显的影响，特别是氧化羧甲基纤维素效果最佳。考马斯亮蓝的染色结果表白，氧化海藻酸钠改善了蛋白质在乳胶膜中的分布，使其分布更为均匀，从而有效地将蛋白质固定在乳胶膜的内部。同时，对乳胶膜的生物降解还具有一定的促进作用，可以在一定限度上促进乳胶膜的降解。研究结果表白，用氧化多糖固定蛋白质在解决乳胶膜中蛋白质过敏问题具有非常实际的应用价值。第三章结论 本研究合成了一种温度敏感的一环糊精衍生物，探讨了口对变形溶菌酶的复性作用，同时合成了三种天然多糖衍生物氧化海藻酸钠（）、氧化透明质酸（）和氧化羧甲基纤维素（），并探讨了这三种天然多糖衍生物对天然胶乳中的蛋白质的固定作用及对乳胶膜降解过程的影响。重要结论如下：（）及其合成中间产物 和对尿素变性溶菌酶的复性过程均有促进作用，然而对盐酸胍变性溶菌酶的复性过程却具有克制作用，不能用于辅助经盐酸胍变性的溶菌酶的复性；结构单元中的 疏水性空腔及链段具有协同作用，荧光光谱的研究结果证实了这一结论。单独用于辅助尿素变性溶菌酶复性时，其浓度对溶菌酶的复性效果有一定的影响，当溶菌酶的最终浓度为时，的浓度控制在时溶菌酶的复性效果最佳；而复性温度应当控制在其以下。与联合用于辅助溶菌酶的复性时，应在作用一段时间后（约）再加入到复性体系；具有的温敏相变功能可实现的循环使用。（）在天然胶乳中添加很少量的这三种天然多糖衍生物即可有效地固定天然胶乳中的蛋白质，并且对乳胶膜的力学性能没有明显的影响。相对于天然乳胶膜中蛋白质重要分布于乳胶膜的上层表面，添加了氧化海藻酸钠的乳胶膜中蛋白质的分布更为均匀。氧化海藻酸钠对乳胶膜的生物降解还具有一定的促进作用，可以在一定限度上促进乳胶膜的降解。研究结果表白，用氧化多糖固定蛋白质在解决乳胶膜蛋白质过敏问题具有非常实际的应用价值。附件一、个人简历陈继平，男，年月出生，博士，助理研究员。年毕业于四川师范大学化学学院，获硕士学位；年毕业于四川大学皮革化学工程系，获博士学位。年进入中山大学从事博士后研究工作。重要研究方向为天然高分子功能化改性及其在蛋白质复性、乳胶蛋白固定方面的研究。作为重要成员承担多项国家和省部级课题，申请专利项，以第一作者发表论文篇，其中在，等国际学术刊物上发表、收录学术论文篇。二、在站期间以第一作者发表的论文及专利，（），（）申请专利一项：一种天然橡胶胶乳蛋白质的固定方法，申请号：三、在站期间获得的科研基金及承担的其它课题国家自然科学基金委面上项目，天然聚多糖衍生的水凝胶化因子及其性能研究，万，批准号，参与广东省自然科学基金面上项目，新型凝胶因子的设计制备与功能特性，万，批准号，参与四、在站期间参与国内外学术会议情况第届反映性高分子学术讨论会，广州，五、在站期间承担教学和或工作情况协助导师指导年本科生毕业论文名。致谢一方面，感谢我的合作导师张黎明专家在我博士后工作期间对我工作、生活等方面给予的极大帮助和关怀。从导师身上我不仅学到了许多新的专业知识，并且也学到了许多科研方法和做人的道理。在此，谨向张老师致以衷心的感澍！同时，感谢本课题组的杨立群老师、李伟老师、易菊珍老师和实验室全体同仁的帮助与关心，和你们在一起使我在中山大学度过了两年的快乐时光。最后，感谢国家自然科学基金和广东省自然科学基金对本研究的资助。